نموذج الفئران من المعوية الإسكيمية-ضخه إصابة

Summary

نحن هنا وصف الإجراء مفصل من الأمعاء نقص التروية ضخه في الفئران مما يؤدي إلى الإصابة استنساخه دون وفيات لتشجيع توحيد هذه التقنية عبر الميدان. ويمكن استخدام هذا النموذج من الأمعاء إصابة نقص التروية ضخه لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للإصابة والتجدد.

Abstract

نقص تروية الأمعاء هو حالة تهدد الحياة المرتبطة مع مجموعة واسعة من الحالات الطبية بما في ذلك تصلب الشرايين والجلطة، انخفاض ضغط الدم، التهاب الأمعاء الناخر، زرع الأمعاء، والصدمات النفسية والالتهابات المزمنة. المعوية إصابة نقص التروية ضخه (الأشعة تحت الحمراء) هي نتيجة لنقص التروية المساريقي الحاد، والناجمة عن عدم كفاية تدفق الدم من خلال الأوعية المساريقي، مما أدى إلى تلف الأمعاء. يمكن ضخه نقص التروية التالية يزيد من تفاقم الضرر من الأمعاء. آليات إصابة الأشعة تحت الحمراء معقدة وغير مفهومة. ولذلك، نماذج حيوانية صغيرة تجريبية حاسمة لفهم الفيزيولوجيا المرضية لإصابة الأشعة تحت الحمراء وتطوير علاجات جديدة.

نحن هنا وصف نموذج الفأر من الإصابة الأشعة تحت الحمراء المعوية الحادة التي توفر اصابة استنساخه من الأمعاء الدقيقة دون وفيات. ويتحقق ذلك عن طريق إحداث نقص التروية في منطقة الدقاق القاصي قبل زمنيا occludinز الفروع الجانبية المحيطية والطرفية من الشريان المساريقي العلوي لمدة 60 دقيقة باستخدام مقاطع الاوعية الدموية الدقيقة. ضخه لمدة 1 ساعة، أو 2 ساعة بعد النتائج إصابة في إصابة استنساخه من الأمعاء فحص عن طريق التحليل النسيجي. الموقف الصحيح من لقطات الاوعية الدموية الدقيقة هو أمر حاسم لهذا الإجراء. وبالتالي يوفر مقطع الفيديو المرئي وصف تفصيلي خطوة بخطوة من هذه التقنية. ويمكن استخدام هذا النموذج من الإصابة الأشعة تحت الحمراء المعوية لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للإصابة والتجدد.

Introduction

الأمعاء حساس جدا لانقطاع تدفق الدم الذي يسبب نقص التروية والظهارية الضرر. ضخه بعد نقص التروية توفر إعادة الأوكسجين للأنسجة، ويمكن أن تزيد من تعزيز علم الأمراض. لذلك، يرتبط المعوية إصابة نقص التروية وضخه مع مجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك التهاب الأمعاء الناخر، رفض المزروع في زرع الأمعاء الدقيقة، والمضاعفات من البطن جراحة الشريان الأبهر تمدد الأوعية الدموية، المجازة القلبية الرئوية، والتهاب ^1،2 أمراض الأمعاء. المعوية الأشعة تحت الحمراء الإصابة، الجلطة المعوية خاصة الحاد، هو حالة تهدد الحياة مما أدى إلى معدلات الاعتلال والوفيات ^3.

على الرغم من أن يساء فهمها، ويعتقد الأمعاء نقص التروية ضخه (IR) إصابة تترافق مع تغيرات في مجهريات الأمعاء وكذلك إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية والسيتوكينات الالتهابية وكيموكينات ^1،4-6. وهذا يؤدي إلى تنشيط سواء فينيت والآليات المناعية التكيفية التي تعزز الالتهابات والأنسجة إصابة ^1،7،8.

النماذج الحيوانية حاسمة لفهم آليات الإصابة الأشعة تحت الحمراء، كما أنها تسمح gain- سهلة والتجارب الجينية الخسارة من وظيفة. وقد وضعت عدة نماذج حيوانية من الأشعة تحت الحمراء التي تشمل انسداد الأوعية الدموية كاملة، وانخفاض التروية التدفق، ومجزأة انسداد الأوعية الدموية (تلخيصها في مراجعة شاملة جرت مؤخرا ^9). نقص تروية الأمعاء الناجمة عن انسداد الأوعية الدموية كاملة من الشريان المساريقي (SMA) هو نموذج سهل ويشيع استخدامها من الأشعة تحت الحمراء في الحيوانات الكبيرة والقوارض ^9-11. ومع ذلك، ومناطق مختلفة من الأمعاء لها وضعية مختلفة للإصابة. وبالإضافة إلى ذلك، ومجموعة متنوعة من التخدير، والمسكنات، وتقنيات انسداد الشريان، فضلا عن التضارب في مدة الإصابة الدماغية ونتيجة التعافي في درجات متفاوتة من الإصابة التباس فهمنا للبيولوجيا الأشعة تحت الحمراء عبر الى الدراسات متعددةالصورة. يوضح الجدول 1 هذه التناقضات في دراسات الأشعة تحت الحمراء الفئران. العائق الاكبر من استخدام مرات الدماغية أقصر (30-45 دقيقة) تستهدف نافذة الانتعاش التي تقوم عليها الخلافات تمييز بين الحالات والضوابط يمكن ملاحظتها. إصابة خفيفة لظهارة يمكن حل ساعة بعد ضخه، وبالتالي متخصصة قد تكون هناك حاجة المقاييس المرضية للعثور على الخلافات في الرد الظهارية. في المقابل، الضرر المفرط، كما رأينا من قبل 100 دقيقة من الإصابة الدماغية قد يؤدي إلى denudement كاملة من الظهارة، حيث رد لم يعد ممكنا، وزيادة معدل وفيات، والوقت الانتعاش. ولذلك، ونحن هنا وصف الإجراء مفصل من الأشعة تحت الحمراء المعوية في الفئران مما يؤدي إلى الإصابة استنساخه دون وفيات لتشجيع توحيد هذه التقنية عبر مجالنا. ويمكن استخدام هذا النموذج من الإصابة الأشعة تحت الحمراء المعوية لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للإصابة والتجدد.

Protocol

أجريت الدراسات على الحيوانات وفقا للمعهد الوطني للإرشادات الصحة وتمت الموافقة من قبل رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام جنة معهد ترودو. واستخدمت الأسبوع 8-12 القديمة C57BL / 6 الفئران للدراسة.

1. التحضير للجراحة

1. إعداد وتعقيم الأدوات الجراحية.
2. إعداد نظام التخدير القائم على الأيزوفلورين مع مخروط الأنف، وسادة ساخنة. لا تجعل محموما على يقين سادة ساخنة (<39 درجة مئوية).
3. تأكد من أن الأيزوفلورين الكسح الغاز اسطوانة يتم وضع بشكل صحيح لضمان منافذ العادم في الجزء السفلي من العلبة لا يتم حظر أو المغطي بأي شكل من الأشكال. وزن الغاز الكسح العلبة قبل الإجراء والوزن وثيقة على العلبة. تجاهل علبة عندما يتجاوز وزن علبة 50 غ من الوزن المتراكم (~ 12 ساعة).

2. التخدير

1. تخدير الفأر مع 3٪ الأيزوفلورين في غرفة الاستقراء (1 لتر / دقيقةO _2).
   1. تقييم عمق التخدير عن طريق عدم القدرة على البقاء في وضع مستقيم، وفقدان حركة هادفة الطوعية، وفقدان المنعكس طرفة، استرخاء العضلات، وفقدان ردا على ارادي التحفيز (أخمص القدمين أو قرصة الذيل مع الضغط شركة).
   2. تقييم معدل التنفس ونمط من خلال مراقبة جدار الصدر وحركات البطن. تحت التخدير الأمثل، يجب أن يكون معدل التنفس ~ 55-65 نفسا في الدقيقة.
   3. إزالة الماوس من غرفة تحريض وبسرعة حلق منطقة البطن من الفأرة.
2. لمنع جفاف القرنية، ووضع مرهم للعين لطيف في العينين.
3. ضع الماوس على لوحة ساخنة وتوصيله عبر مخروط الأنف لنظام التخدير. يناسب التأكد من اللاتكس الأنف غشاء مخروط بحزم على رأسه من الفأرة وعدم وجود تسرب من الأيزوفلورين.
4. تخفيض معدل الأيزوفلورين إلى 1.5٪، وحقن البوبرينورفين (0.1 ملغ / كلغ) والكيتامين (10 ملغ / كلغ) تحت الجلد لمنع الرياح حتى من الألم تتالي.
5. مسح عشرالبريد الجلد من منطقة العملية مع مسحة القطن المعقم غارقة مع الحل الجراحي Betadine تليها 70٪ من الإيثانول.

3. جراحة

1. جعل سم البطن خط منتصف 3-5 مع مقص التشغيل. منطقة العملية غطاء مع لوحة العقيمة غير ملتصقة مبللة بمحلول ملحي. عزل الأعور والدقاق وفضح الشريان المساريقي العلوي باستخدام قطعة قطن مبللة في محلول ملحي.
2. لتسهيل كليب تطبيق، وجعل النكات صغيرة في مساريق المحيطة الشريان المساريقي العلوي باستخدام القزحية الجميلة scissors.To قيام بذلك، رفع بلطف الأمعاء مع ملقط خلع الملابس وقطع مساريق على كلا الجانبين من الشريان المساريقي العلوي في موقف كليب المطلوب (الشكل 1A). ثم، إضافة بضع قطرات من محلول ملحي معقم إلى منطقة موقف كليب المطلوبة قبل التقدم بطلب لقطات.
   ملاحظة: لإجراء الجراحة صورية، اتبع الإجراء الجراحي تصل إلى الخطوة 3.2. لا تنطبق مقاطع. بدلا من ذلك، والحفاظ على الأنسجة الرطبة التي كتبها s دافئ وأضافألين كما هو موضح في 3.6 لمدة 1 ساعة. بعد ذلك، انتقل إلى الخطوة 4.1،
3. انسداد الفروع من الدرجة الأولى من الشريان المساريقي العلوي مع لقطات الاوعية الدموية الدقيقة (70 ز قوة) باستخدام مطبق مقطع لإنشاء منطقة 5-7 سم من الدقاق الدماغية المجاور لالأعور (الشكل 1B). على الرغم من أن موقف السفن محافظ، قد تكون هناك اختلافات طفيفة بين الفئران (انظر الأمثلة على الشكل 1). وبالتالي، 2 أو 3 مقاطع وعادة ما تطلب (انظر موقع لقطات على الشكل 1A، D، E، السهام السوداء).
   ملاحظة: استخدم مقاطع سفينة ذات جودة عالية. يمكن لقطات ارتفاع ضغط يتلف الاوعية ومنع تجديد في حين مقاطع الضغط المنخفض (<30 ز) قد لا تمنع تماما من تدفق الدم.
4. منع تدفق الدم ضمانات من خلال الأمعاء باستخدام اثنين من لقطات الاوعية الدموية الدقيقة عبر الأوعية (40 ز قوة)، demarking المنطقة من الأمعاء الدماغية (الشكل 1). مطلوب انسداد الأوعية ضمانات لمنع تدفق الدم من الأوعية الدموية المجاورة (انظر موقع لقطات على الشكل 1A، D، E، السهام الخضراء).
5. اختياري: إضافة محلول الهيبارين (6 USP وحدة / مل)، لمنع تخثر الدم. قطرة قطرة إضافة 0.5 مل من محلول الهيبارين إلى الأمعاء المعزولة.
6. الرطب معقمة وسادة غير ملتصقة مناديل الحساسة بمحلول ملحي قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية، وتنطبق على منطقة العمليات الجراحية. تأكد من أن تقضي تبقى رطبة طوال فترة الإجراء.
7. الحفاظ على نقص التروية لمدة 60 دقيقة باستخدام التخدير الأيزوفلورين 1-1.5٪ في جميع أنحاء. إذا تم تنفيذ الإجراء نقص التروية بشكل صحيح، فإن المنطقة الدماغية تتغير إلى اللون الأحمر النبيذ في اللون في حوالي 30 دقيقة. لاحظ أن الأوعية الدموية البعيدة إلى موقف كليب تتضخم خلال نقص التروية (الشكل 1، لوحات اليمين) مشيرا إلى انسداد ناجحة.
8. تراقب عن كثب الماوس أثناء مرحلة نقص التروية. مواصلة تطبيق محلول ملحي لوحة غير ملتصقة تغطية الموقع لعملية جراحية.
9. علامة حواف المنطقة الدماغية قبل pipetting 20 ميكرولتر من Gill`s 3 الهيماتوكسيلين على النسيج لتسهيل حصاد الأنسجة الدماغية والأنسجة السليمة المجاورة من نفس الماوس للمقارنة (الشكل 1E، اللوحة اليمنى).

4. ضخه المرحلة

1. في نهاية نقص التروية إضافة بضع قطرات من المياه المالحة في المنطقة كليب وبلطف إزالة مقاطع الاوعية الدموية الدقيقة مع مقطع مطبق. ثم، ودفع بلطف الأمعاء إلى تجويف البطن باستخدام المياه المالحة مبلل نصائح القطن. إزالة وسادة غير ملتصقة وإغلاق جدار البطن والجلد باستخدام 9 مم الفولاذ المقاوم للصدأ مقاطع الجرح. إذا تم تنفيذ ضخه أطول من 3 ساعات، استخدم خياطة vicryl للامتصاص لإغلاق جدار البطن قبل تطبيق مقاطع الجرح على الجلد.
2. الحفاظ على الفئران في قفص نظيفة ساخنة لالمبلغ المطلوب من الوقت (30 دقيقة، 60 دقيقة، 120 دقيقة، أو 180 دقيقة) للمرحلة ضخه.
3. تحقق الحيوانات على الأقل كل 30 دقيقة لضمان الاستقرار.

الطبقة = "jove_title"> 5. التشريح وحصاد الأمعاء الدقيقة

1. الموت ببطء الفئران عن طريق CO ₂ جرعة زائدة تليها خلع عنق الرحم في الوقت المطلوب ضخه التالية.
2. فتح تجويف البطن وجمع الأنسجة المعوية الدماغية لمزيد من التحليل. حصاد الأنسجة الطبيعية السليمة المجاورة للأنسجة المصابة باعتبارها الرقابة الداخلية لحساب أي رد فعل النظامية للإصابة.
   ملاحظة: هذه السيطرة هو أكثر ملاءمة من الشام تشغيل السيطرة على الفئران لصورية تعمل الفئران لا تخضع رد فعل النظامية الاصابة الناجمة عن الأشعة تحت الحمراء.
3. تغسل محتوى الأمعاء باستخدام حقنة 30 مل مع إبرة أنبوب تغذية تعلق مليئة المالحة وثم قطع الأمعاء طوليا. إذا كنت بحاجة لعينة من الأمعاء لتحليل التعبير الجيني، وقطع جزء 1.5 ملم طوليا، واستخدام قطعة المتبقية للتحليل النسيجي.
4. للتحليل النسيجي، وإعداد لفافة السويسرية باستخدام زوج من ملقط للفة intestالمعهد الوطني للإحصاء.
5. للحفاظ على شكل تدحرجت، ضع قطعة من الأمعاء بين فوم خزعة في أشرطة الأنسجة (الشكل 2). وضع أشرطة في 10٪ مخزنة الفورمالين.
6. إصلاح الأنسجة في الفورمالين لمدة 24 ساعة على الأقل. استبدال الفورمالين مع الايثانول 70٪ لمدة 24 ساعة إضافية. تخزين الأنسجة في 70٪ من الإيثانول إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة.
7. تضمينها في البارافين، وقطع 5 ميكرون المقاطع وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين باستخدام بروتوكول قياسي (الشكل 3).

6. تسجيل النقاط

1. تسجيل إصابة نقص التروية ضخه الفئران كما تلخيصها في الجدول 2. اختيار طريقة التسجيل المناسب.
2. اختياري: تقسيم مجال الرؤية إلى أربعة أقسام منذ شدة الإصابة تختلف في جميع أنحاء القسم.
3. حساب متوسط ​​درجات كل قسم من عشرات الحصول عمياء.
4. مقارنة درجة من النسيج المصاب بين الحالات والسيطرة وكذلك إلى thلم يصب ه الأنسجة باستخدام اختبار كروسكال واليس، تليها اختبار المقارنات المتعددة لدان.

النتائج

نحن الأمثل بروتوكول تجريبي لجراحة الأشعة تحت الحمراء للحصول على استنساخه إصابة الأشعة تحت الحمراء التي يسببها للالدقاق في الفئران. وأظهرت نتائج ممثلة في هذا القسم.

ويبين الشكل 1 أمثل?...

Discussion

تطوير نماذج الماوس الإصابة الأشعة تحت الحمراء المعوية قد تحسنت بشكل كبير في فهم آليات إصابة الأنسجة وساعد في تطوير الاستراتيجيات العلاجية المحتملة للحد من تلف الأنسجة ^{7،9،11،34.} الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول هي تحديد المواقع المناسبة لقطات الاوعية الدموية ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Pad	Sunbeam	E12107-819	Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine	Vasco	UCAP 0001-0000171	Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone	Parkland Scientific	ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge	Parkland Scientific	80000, 80120
Induction Chamber	Surgivet	V711802
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10	Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper	Oster	Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment	Webster	8804604
Buprenorphine	McKesson	562766	Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl)	Pfizer	NADA 45-290	Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips	Puritan medical products	806-WC	Autoclave before use
Betadine	Purdue Products	67618-150-17	10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution	Aspen	46066-807-60	Adjust to room temperature before use
IR rodent thermometer	BIOSEB	BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70 g	Roboz Surgical	RS5424, RS5435	Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40 g	Roboz Surgical	RS6472	Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps	World Precision Instruments	14189	Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin	Thermo Scientific	14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm	Cell Point Scientific	201-1000
Autoclip applier	Beckton Dickinson	427630
Byopsy foam pad	Simport	M476-1
Tissue cassette	Fisher Healthcare	15182701A	Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin	Fisher Scientific	245-684
Surgical iris scissors	World Precision Instruments	501263-G SC	Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors	World Precision Instruments	501219-G	Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps	Roboz Surgical	RS-5228, RS-8122	Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg	Sigma	2106
Reflex wound clip removing forceps	Roboz Surgical	RS-9263	Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile	Coviden	1050
Fisherbrand transfer pipets	Fischer Scientific	13-711-5AM	Use pipets to dropwise add saline