Мышиной модели кишечная ишемия-реперфузии

Резюме

Здесь мы опишем детальную процедуру кишечной ишемии-реперфузии у мышей, что приводит к воспроизводимым травмы без смертности для поощрения стандартизации этой техники по полю. Эта модель кишечной травмы ишемии-реперфузии может быть использован для изучения клеточных и молекулярных механизмов повреждения и регенерации.

Аннотация

Кишечная ишемия является опасным для жизни состояние, связанное с широким спектром клинических состояний, включая атеросклероз, тромбоз, гипотензия, некротический энтероколит, трансплантация кишечника, травмы и хроническое воспаление. Кишечный ишемии-реперфузии (ИК) травма является следствием острого мезентериального ишемии, вызванной недостаточным кровотоком через мезентериальных сосудов, что приводит к кишечным повреждением. Реперфузии после ишемии может еще более усугубить повреждение кишечника. Механизмы травмы ИК сложны и плохо изучены. Таким образом, экспериментальные малые животные модели имеют решающее значение для понимания патофизиологии травмы ИК и развитие новых видов лечения.

Здесь мы описываем модель мыши острой кишечной травмы IR, который обеспечивает воспроизводимый повреждение тонкой кишки без смертности. Это достигается за счет индукции ишемии в области дистальной подвздошной кишки с помощью временно occludinг периферийные и терминальные коллатеральные ветви верхней брыжеечной артерии в течение 60 мин с использованием микрососудистых клипов. Реперфузии в течение 1 ч или 2 ч после травмы результаты воспроизводимым травмы кишечника, рассмотренного гистологического анализа. Правильное положение микрососудистых клипов имеет решающее значение для данной процедуры. Поэтому ролик предоставляет подробный визуальный шаг за шагом описание этой методики. Эта модель кишечной травмы ИК могут быть использованы для изучения клеточных и молекулярных механизмов повреждения и регенерации.

Введение

Кишечник очень чувствителен к нарушению кровотока, что вызывает ишемию и повреждение эпителия. Реперфузии после ишемии обеспечивает повторное насыщение кислородом ткани, и может дополнительно способствовать патологии. Таким образом, кишечная ишемия и реперфузионное повреждение связано с широким спектром патологий, в том числе некротизирующего энтероколита, отторжение аллотрансплантата в малом трансплантации кишечника, осложнения брюшной аорты хирургии аневризм, искусственного кровообращения и воспалительных ^1,2 заболевания кишечника. Кишечные ИК травмы, особенно острой брыжеечной ишемии, является опасным для жизни состояние приводит к заболеваемости и смертности ^3.

Несмотря на то, плохо понимают, как полагают кишечная ишемия-реперфузия (ИК) в случае травмы, связаны с изменениями в микрофлоры кишечника, а также производство активных форм кислорода и воспалительных цитокинов и хемокинов ^1,4-6. Это приводит к активации как вNate и адаптивные иммунные механизмы , которые способствуют воспаление и ткани травмы ^1,7,8.

Животные модели имеют решающее значение для понимания механизмов травмы ИК, так как они позволяют легко и амплитудно с потерей функции генетических экспериментов. Несколько моделей животных ИК были разработаны , которые включают в себя полную закупорку сосудов, низкий ишемию потока, и сегментирован окклюзии сосудов (суммированы в недавнем всеобъемлющем обзоре ^9). Кишечная ишемия , вызванная полным сосудистой окклюзии верхней брыжеечной артерии (SMA) представляет собой простой и широко используется модель IR у крупных животных и грызунов ^9-11. Тем не менее, различные участки кишечника имеют разную восприимчивость к травмам. Кроме того, разнообразный спектр анестетиков, анальгетиков, техник окклюзии артерии, а также несоответствие продолжительности ишемического повреждения и восстановления в результате различной степени травмы оправдав наше понимание биологии ИК по нескольким Studies. Таблица 1 демонстрирует эти несоответствия в мышиных ИК - исследований. Самый большой недостаток с использованием коротких ишемических раза (30-45 мин) нацеливает окно восстановления, на котором можно наблюдать заметные различия между случаями и контролем. Мягкий повреждение эпителия может быть решена через час после реперфузии, поэтому специализированная патологические показатели могут потребоваться, чтобы найти различия в эпителиальной реституции. В противоположность этому, чрезмерный ущерб, как это видно на 100 мин ишемического повреждения могут привести к полному denudement эпителия, где реституция не больше невозможна, увеличивая уровень смертности, а также время восстановления. Таким образом, здесь мы описываем детальную процедуру кишечника IR у мышей, что приводит к воспроизводимым травмы без смертности для поощрения стандартизации этой техники по всей нашей области. Эта модель кишечной травмы ИК могут быть использованы для изучения клеточных и молекулярных механизмов повреждения и регенерации.

протокол

Исследования на животных были проведены в соответствии с Национальным институтом здравоохранения и руководящих принципов были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитет Трюдо института. 8-12 недельных мышей C57BL / 6 мышей использовали для исследования.

1. Подготовка к хирургии

1. Подготовить и стерилизовать хирургические инструменты.
2. Подготовка изофлуран на основе системы анестезии с конусообразной и подогреваемым площадку. Убедитесь, что накладка нагревается не перегревается (<39 ° С).
3. Убедитесь, что изофлуран газа продувка адсорбера расположен правильно, чтобы обеспечить выпускные отверстия в нижней части контейнера не были заблокированы или окклюзия каким-либо образом. Взвесьте газа продувкой канистру до процедуры и веса документа на канистре. Выбросьте канистру, когда вес превышает канистра 50 г накопленной массы (~ 12 ч).

2. Анестезия

1. Обезболить мышь с 3% изофлуран в индукционной камере (1 л / минO _2).
   1. Оценка глубины анестезии неспособностью оставаться в вертикальном положении, потеря целенаправленного добровольного движения, потеря мигательного рефлекса, расслабление мышц и потеря реакции на рефлекторную стимуляцию (палец ноги или хвост щепотку с давлением фирмы).
   2. Оценка частоты дыхания и рисунок, наблюдая стенки грудной клетки и брюшной движения. Под оптимальной анестезии, частота дыхания должна быть ~ 55-65 вдохов в минуту.
   3. Удалить мышь из индукции камеры и быстро брить область живота мыши.
2. Для того, чтобы предотвратить высыхание роговицы, поместите мягкий глазной мази в глаза.
3. Поместите курсор на нагретом площадку и подключить его через нос конуса к системе анестезии. Убедитесь, что мембрана конус латекса нос плотно надевается на голову мыши и нет утечки изофлуран.
4. Снижение изофлуран ставки до 1,5%, и вводят бупренорфин (0,1 мг / кг) и кетамина (10 мг / кг) подкожно, чтобы предотвратить скручивание болевого кадной.
5. Wipe-ее кожа области работы с стерильным ватным тампоном, смоченным раствором Бетадин хирургическим последующим 70% этанола.

3. хирургия

1. Сделать см лапаротомии средней линии 3-5 с операционными ножницами. Зона работы Крышка с стерильной неприлипающими площадки, смоченным физиологическим раствором. Изолировать слепую кишку и подвздошную и подвергать брыжеечной артерии с помощью ватного тампона, смоченные в физиологическом растворе.
2. Чтобы облегчить зажим претендуете, сделать небольшие зарубки в брыжейки окружающих брыжеечной артерии с использованием тонких ирис scissors.To сделать это, осторожно поднимите кишечник с гардеробными пинцетом и разрезать брыжейки на обеих сторонах верхней брыжеечной артерии в месте желаемого клипа (рис 1А). Затем добавляют несколько капель стерильного физиологического раствора в области нужное положение клипа перед нанесением клипов.
   Примечание: Для выполнения операции фиктивный, выполните хирургическую процедуру до шага 3.2. Не применять зажимы. Вместо этого, поддерживать ткань влажной теплой добавленнием сЭлин, как описано в 3.6 в течение 1 часа. После этого переходите к шагу 4.1,
3. Закупоривать первые ветви порядка верхней брыжеечной артерии с микрососудистых зажимами (70 г) с использованием силы клип для наложения для создания 5-7 см область ишемического подвздошной прилегающих к слепой кишке (рис 1В). Хотя позиция судов является консервативным, могут быть небольшие различия между мышами (см примеры на рисунке 1). Таким образом, 2 или 3 ролика, как правило , требуется (см расположение зажимов на рисунке 1А, D, E, черные стрелки).
   Примечание: Используйте зажимы высокого качества судов. клипы высокого давления могут повредить сосуды и предотвратить регенерацию, тогда как низкие клипами давления (<30 г) не может полностью блокировать кровоток.
4. Блок коллатерального кровотока через кишечник с помощью двух микрососудистых клипов через сосуды (40 г) силы, демаркации области ишемического кишечника (рис 1). Закупорка коллатеральных сосудов требуетсяпредотвратить приток крови от соседних кровеносных сосудов (см расположение зажимов на рисунке 1А, D, E, зеленые стрелки).
5. Дополнительно: Добавить раствор гепарина (6 USP единиц / мл), чтобы предотвратить свертывание крови. По каплям добавляют 0,5 мл раствора гепарина с изолированной кишки.
6. Влажные стерильные без клейкий коврик деликатных вытирает физиологическим раствором, предварительно нагретый до 37 ° С и применяются к хирургической области. Убедитесь, что влажные салфетки остается влажным в течение всей процедуры.
7. Поддерживать ишемия в течение 60 мин с использованием 1-1,5% изофлуран анестезии во всем. Если процедура ишемия выполнена правильно, ишемическая область изменится вина красного цвета примерно 30 мин. Обратите внимание , что кровеносные сосуды дистальных к положению зажима в увеличенном масштабе при ишемии (рис 1, правая панели) , свидетельствующего об успешном прикус.
8. Внимательно следить за мышь во время стадии ишемии. Продолжать применять физиологический раствор в неприлипающими площадку, охватывающей участок хирургии.
9. отметкакрая ишемизированной области пипеткой 20 мкл Gill`s 3 гематоксилином на ткани для облегчения уборки ишемизированной ткани и прилегающей здоровой ткани от той же мыши для сравнения (рис 1E, правая панель).

4. Реперфузии этап

1. В конце ишемией добавить несколько капель физиологического раствора на площади клипа и аккуратно удалить микрососудистых зажимы с зажимом для наложения. Затем, осторожно надавите кишечника обратно в брюшную полость с помощью солевых смачивают советы хлопка. Удалить неприлипающими площадку и закрыть брюшной стенки и кожи, используя 9 мм зажимы навитые из нержавеющей стали. Если реперфузии выполняется дольше, чем 3 ч, используют рассасывающиеся викрил швом, чтобы закрыть брюшной стенки перед нанесением раны клипов на коже.
2. Поддерживать мышей в чистую клетку, нагреваемой в течение желаемого промежутка времени (30 мин, 60 мин, 120 мин, или 180 мин) для фазы реперфузии.
3. Проверьте животных по крайней мере, каждые 30 минут, чтобы обеспечивающих стабильность.

5. Вскрытие и сбор урожая тонкой кишки

1. Эвтаназии мышей СО ₂ передозировку с последующим смещением шейных позвонков в заданное время после реперфузии.
2. Открыть брюшной полости и собирать ишемическую кишечной ткани для дальнейшего анализа. Урожай здоровой нормальная ткань прилегающих к поврежденной ткани в качестве внутреннего контроля для учета любой системной реакции на травму.
   Примечание: Этот элемент управления является более подходящим, чем ложнооперированных контрольных мышей, потому что ложнооперированных мышей не подвергаются системной реакции на ИК-индуцированного повреждения.
3. Промойте кишечного содержимого с помощью 30 мл шприц с прикрепленной иглой зондового заполненной физиологическим раствором, а затем разрезается кишечник в продольном направлении. Если образец кишечника необходим для анализа экспрессии генов, вырезать фрагмент 1,5 мм в продольном направлении, и использовать оставшуюся часть для гистологического анализа.
4. Для гистологического анализа, подготовить рулет с помощью пары щипцов катать INTESTине.
5. Для поддержания свернутую форму, поместите кусочки кишечника между биопсии пенопластовых прокладок в кассетах ткани (рисунок 2). Поместите кассеты в 10% забуференном формалине.
6. Закрепить ткани в формалине в течение по крайней мере 24 часов. Заменить формалин с 70% этанола в течение еще 24 ч. Магазин ткани в 70% этаноле до бесконечности при комнатной температуре.
7. Вставить в парафин, вырезать секции 5 мкм и пятна с гематоксилином и эозином с использованием стандартного протокола (рисунок 3).

6. Подсчет очков

1. Оценка мышиный травмы ишемии-реперфузии , как в таблице 2. Выберите подходящий метод подсчета очков.
2. Дополнительно: Разделить поле зрения на четыре секции, так как тяжесть травмы изменяется по всему разрезу.
3. Вычислить средний балл каждой секции из баллов, полученных вслепую.
4. Сравните степень поврежденной ткани между случаями и контролем, а также гое неповрежденной ткани с использованием теста Крускала-Уоллиса, а затем несколькими тестовыми сравнений Данна.

Результаты

Мы оптимизировали экспериментальный протокол ИК хирургии, чтобы получить воспроизводимое ИК-индуцированного повреждения подвздошной кишки у мышей. Представитель результаты демонстрируются в этом разделе.

На рисунке 1 пока...

Обсуждение

Разработка моделей мышей кишечной травмы ИК значительно улучшили понимание механизмов повреждения тканей и помогли в развитии потенциальных терапевтических стратегий для сведения к минимуму повреждения тканей ^7,9,11,34. Критические шаги этого протокола правильное позиционирова?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Pad	Sunbeam	E12107-819	Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine	Vasco	UCAP 0001-0000171	Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone	Parkland Scientific	ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge	Parkland Scientific	80000, 80120
Induction Chamber	Surgivet	V711802
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10	Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper	Oster	Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment	Webster	8804604
Buprenorphine	McKesson	562766	Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl)	Pfizer	NADA 45-290	Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips	Puritan medical products	806-WC	Autoclave before use
Betadine	Purdue Products	67618-150-17	10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution	Aspen	46066-807-60	Adjust to room temperature before use
IR rodent thermometer	BIOSEB	BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70 g	Roboz Surgical	RS5424, RS5435	Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40 g	Roboz Surgical	RS6472	Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps	World Precision Instruments	14189	Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin	Thermo Scientific	14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm	Cell Point Scientific	201-1000
Autoclip applier	Beckton Dickinson	427630
Byopsy foam pad	Simport	M476-1
Tissue cassette	Fisher Healthcare	15182701A	Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin	Fisher Scientific	245-684
Surgical iris scissors	World Precision Instruments	501263-G SC	Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors	World Precision Instruments	501219-G	Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps	Roboz Surgical	RS-5228, RS-8122	Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg	Sigma	2106
Reflex wound clip removing forceps	Roboz Surgical	RS-9263	Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile	Coviden	1050
Fisherbrand transfer pipets	Fischer Scientific	13-711-5AM	Use pipets to dropwise add saline