דגם Murine של פגיעת המעיים איסכמיה reperfusion

Summary

כאן אנו מתארים את ההליך המפורט של reperfusion איסכמיה מעיים בעכברים שתוצאתה הפגיעה לשחזור ללא תמותה לעודד סטנדרטיזציה של טכניקה זו על פני השדה. מודל זה של פגיעת איסכמיה-רה-פרפוזיה במעי יכול להיות מנוצל כדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים של פציעה והתחדשות.

Abstract

איסכמיה מעיים הוא מצב מסכן חיים הקשורים מגוון רחב של מצבים רפואיים, כולל טרשת עורקים, פקקת, תת לחץ דם, דלקת מעי נמקית, השתלת מעי, טראומה ודלקת כרונית. פציעה איסכמיה-רה-פרפוזיה מעיים (IR) היא תוצאה של איסכמיה mesenteric חריפה, הנגרמת על ידי זרימת דם מספקת דרך כלי mesenteric, וגרמו נזק מעיים. Reperfusion איסכמיה הבאים יכולים להחמיר נזק של המעי. המנגנונים של פגיעת IR הם מורכבים לא ידועים ולא מובנים. לכן, במודלים של בעלי חיים קטנים ניסיוניים הם קריטיים להבנת הפתופיזיולוגיה של פציעת IR לבין ההתפתחות של טיפולים חדשניים.

כאן אנו מתארים במודל עכבר של פגיעה IR חריפה במעי המספק פגיעה לשחזור של המעי הדק ללא תמותה. זו מושגת על ידי איסכמיה התרמה באזור של מעי דיסטלי ידי זמנית occluding ענפים בטחונות הפריפריה הטרמינל של עורק mesenteric המעולה במשך 60 דקות באמצעות קטעי כלי דם. Reperfusion עבור שעה 1, או 2 שעות לאחר תוצאות פגיעות פגיע לשחזור של המעי נבדק על ידי ניתוח היסטולוגית. עמדה הנכונה של קליפים כלי הדם היא קריטית עבור ההליך. לכן את הסרטון ממחיש באופן חזותי מפורט צעד אחר צעד תיאור של הטכניקה הזו. מודל זה של פציעת IR במעי יכול להיות מנוצל כדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים של פציעה והתחדשות.

Introduction

המעי רגיש מאוד הפרעה של זרימת הדם הגורמת לנזק איסכמיה ו אפיתל. Reperfusion לאחר איסכמיה מספק מחדש חמצון של רקמות, והוא יכול לקדם פתולוגיה. לכן, פגיעה איסכמיה ו reperfusion מעיים מזוהה עם מגוון רחב של פתולוגיות, כולל דלקת מעי נמקית, דחייה של השתל בהשתלות מעי דק, סיבוכי ניתוח מפרצת אבי העורקים בבטן, מכונת לב-ריאה, ו ^1,2 מחלת מעי דלקתית. פגיעה במעיים IR, במיוחד איסכמיה mesenteric חריפה, הוא מצב מסכן חיים וכתוצאה מכך תחלואה ותמותה ^3.

למרות לא ידוע ולא מובן,-reperfusion איסכמיה של המעי (IR) פציעה הוא חשב להיות קשורה לשינויים החיידקים במעיים כמו גם את הייצור של מינים החמצן מגיב וציטוקינים דלקתיים וכמוקינים ^1,4-6. זה מוביל הפעלה של שניהםנייט ומנגנוני החיסון אדפטיבית אשר לקדם ^1,7,8 פגיעה דלקת רקמות.

במודלים של בעלי חיים הם קריטיים להבנת המנגנונים של פגיעה IR, מאחר שהם מאפשרים gain- קל ניסויים גנטיים הפסד של פונקציה. במודלים של בעלי חיים כמה IR פותחו הכוללים חסימה של כלי דם מלא, איסכמיה זרימה נמוכה, ו מפולח חסימה של כלי דם (שהעיקריים בם פורטו סקירה מקיפה אחרונה ^9). איסכמיה מעיים הנגרמת על ידי חסימה של כלי דם מלא של עורק mesenteric המעולה (SMA) היא מודל קל נפוץ של IR בחיות גדולות ומכרסמים ^9-11. עם זאת, באזורים שונים של המעי יש רגישות שונה על פשע. בנוסף, המגוון הרחב של חומרי הרדמה, משככי כאבים, טכניקות חסימה בעורק, כמו גם חוסר עקביות משך פגיעת איסכמית תוצאת התאוששות מעלות משתנות של פציעת בלבול הבנתנו את הביולוגיה של IR ברחבי studie המרובהים. טבלה 1 מדגים סתירות אלה במחקרים IR בעכברים. החסרון הגדול ביותר מהשימוש פעמים איסכמי קצרות (30-45 דקות) הוא מיקוד החלון של התאוששות שעליו הבדלים להבחין בין מקרים ובקרות ניתן לצפות. פציעה קלה עד האפיתל עשויה להיפתר שעה לאחר רה-פרפוזיה, ולכן התמחתה מדדי פתולוגיים שיידרשו כדי למצוא הבדלי שבת אפיתל. לעומת זאת, נזק מוגזם, כפי שניתן לראות על ידי 100 דקות של פגיעה איסכמית עלול לגרום denudement שלם של האפיתל, שם השבת כבר אי אפשר, להגדיל את שיעור התמותה, וזמן ההתאוששות. לכן, כאן אנו מתארים את ההליך המפורט של IR מעיים בעכברים שתוצאתה הפגיעה לשחזור ללא תמותה לעודד סטנדרטיזציה של טכניקה זו על פני השדה שלנו. מודל זה של פציעת IR במעי יכול להיות מנוצל כדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים של פציעה והתחדשות.

Protocol

מחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם המכון הלאומי הנחיות בריאות אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש של המכון טרודו. 8-12 בן שבוע C57BL / 6 עכברים שימשו במחקר.

1. הכנה לקראת ניתוח

1. הכן לעקר מכשירי ניתוח.
2. כן מערכת הרדמה מבוסס isoflurane עם חרטומו, ואת משטח לוהט. ודא משטח מחומם לא יתר על המידה (<39 ºC).
3. ודא כי מכל הדחת גז isoflurane ממוקם כראוי על מנת להבטיח את יציאות פליטה בתחתית המכל אינם חסומים או מאפיל בכל דרך. לשקול מיכל הדחה גז לפני הליך ומשקל מסמך על המכל. בטל מכל כאשר משקל מכל עולה על 50 גרם של משקל שנצבר (~ 12 שעות).

2. הרדמה

1. להרדים עכבר עם 3% isoflurane בתא אינדוקציה (1 ליטר / דקהO _2).
   1. הערכת עומק ההרדמה על ידי חוסר יכולת להישאר זקוף, אובדן תנועה רצונית תכליתית, אובדן רפלקס מצמוץ, הרפיית שרירים, ואובדן בתגובה רפלקס גירוי (הבוהן או קמצוץ הזנב עם לחץ חזק).
   2. הערכת קצב הנשימה ואת דפוס ידי התבוננות דופן בית החזה ותנועות בטן. בהרדמה אופטימלית, קצב הנשימה צריך להיות ~ 55-65 נשימות לדקה.
   3. סר עכבר מאולם האינדוקציה ובמהירות לגלח את אזור הבטן של העכבר.
2. כדי למנוע התייבשות קרנית, למקם משחת עיניים תפל בעיני.
3. יש לשים את הסמן על המשטח הלוהט ולחבר אותו באמצעות חרטומו למערכת הרדמה. הפוך קרום חרטומו לטקס בטוח מתאים בחוזקה על הראש של העכבר ואין דליפה של isoflurane.
4. מקטינים את שיעור isoflurane ל -1.5%, ולהזריק עצירות (0.1 מ"ג / ק"ג) ו קטמין (10 מ"ג / ק"ג) תת עורי כדי למנוע את הרוח של מפל-כאב.
5. נגב העור דואר של אזור הפעולה עם מקלון צמר גפן סטרילי ספוג פתרון כירורגי בבטאדין ואחריו אתנול 70%.

3. כירורגיה

1. הפוך פיום בטן סנטימטר באמצע קו 3-5 במספרי הפעלה. כסה את איזור פעולה עם הכרית לא חסיד סטרילי טבול מלוח. לבודד cecum ואת המעי ולחשוף את עורק mesenteric המעולה שימוש צמר גפן טבולה מלוח.
2. כדי להקל קליפ החלים, לבצע חתכים קטנים לפדר סביב עורק mesenteric המעולה שימוש איריס בסדר scissors.To לעשות זאת, בעדינות להרים את המעי עם מלקחי הלבשה וחותך לפדר משני צידי עורק mesenteric המעולה במיקום קליפ הרצוי (איור 1A). לאחר מכן, להוסיף כמה טיפות של תמיסת מלח סטרילית לאזור על מצב קליפ רצוי לפני היישום קליפים.
   הערה: כדי לבצע את ניתוח הדמה, בצע את הליך כירורגי עד שלב 3.2. אין ליישם קליפים. במקום זאת, לשמור על רקמות לחות על ידי ים חמים הוסיףאלין כמתואר 3.6 עבור שעה 1. לאחר מכן, המשך לשלב 4.1,
3. לחסום את סניפי ממדרגה ראשונה של העורק mesenteric מעולה עם קליפים כלי הדם (כוח 70 גרם) באמצעות applier קליפ כדי ליצור אזור ס"מ 5-7 של מעי איסכמי סמוך cecum (איור 1B). למרות המיקום של הכלי הוא שמרני, ייתכן שיש שינויים קלים בין עכברים (ראה דוגמאות על איור 1). לכן, 2 או 3 קליפים בדרך כלל נדרשים (לראות את המיקום של קליפים על איור 1 א, ד, ה, חיצים שחורים).
   הערה: השתמש קליפים כלי באיכות גבוהה. קליפים לחץ גבוה יכול לפגוע בכלי ולמנוע התחדשות ואילו קליפים בלחץ נמוך (<30 גרם) לא יכול לחסום את זרימת הדם לחלוטין.
4. חסום זרימת דם בטחונות דרך המעי באמצעות שני קליפים כלי דם על פני כלי (40 כוח ג'י), demarking באזור מעי איסכמי (איור 1). ספיגה של כלי בטחונות נדרשהלמנוע אספקת דם מכלי דם סמוכים (לראות את המיקום של קליפים על איור 1 א, ד, ה, חצים ירוקים).
5. אופציונלי: הוסף פתרון הפרין (6 יחידות USP / מ"ל), כדי למנוע קרישת דם. Dropwise להוסיף 0.5 מיליליטר של תמיסת הפרין אל המעי המבודד.
6. סטרילי כרית לא חסיד לחים עדינים עם מי מלח מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס, החלימו על תחום כירורגים. ודא כי מגבונים נשארים רטובים במהלך ההליך כולו.
7. לשמור על איסכמיה במשך 60 דקות באמצעות 1-1.5% הרדמה isoflurane לאורך כל הדרך. אם הליך איסכמיה מבוצע כהלכה, באזור איסכמי ישתנה לאדום יין בצבע ב כ 30 דקות. שים לב כלי דם דיסטלי לתפקיד קליפ מוגדל במהלך איסכמיה (איור 1, לוחות מימין) המציין חסימה מוצלחת.
8. לעקוב מקרוב אחר העכבר בשלב איסכמיה. תמשיך לחול תמיסת מלח כדי לרפד לא חסיד המכסה את אתר הניתוח.
9. סימן את הקצוות של האזור איסכמי ידי pipetting 20 μl של hematoxylin Gill`s 3 על הרקמה כדי להקל קצירת רקמה איסכמית רקמה בריאה סמוכים מאותו עכבר להשוואה (איור 1E, פאנל מימין).

4. שלב reperfusion

1. בסוף של איסכמיה להוסיף כמה טיפות של תמיסת מלח על האזור קליפ בעדינות להסיר קליפים כלי הדם עם applier קליפ. ואז, בעדינות לדחוף את המעי חזרה אל חלל הבטן באמצעות עצות צמר גפן טבולה מלוחות. הסר כרית לא חסיד ולסגור את דופן הבטן ואת העור באמצעות קליפים הפצע נירוסטה 9 מ"מ. אם reperfusion מבוצע יותר מ -3 שעות, השתמש תפר vicryl נספגים לסגור את דופן הבטן לפני יישום קליפים פצע על העור.
2. לשמור על עכברים בכלוב נקי מחומם עבור פרק הזמן הרצוי (30 דק ', 60 דק', 120 דק ', או 180 דקות) עבור השלב reperfusion.
3. בדוק חיות לפחות כל 30 דקות כדי להבטיח יציבות.

class = "jove_title"> 5. Necropsy והקציר של המעי הדק

1. להרדים עכברים על ידי ה- CO ₂ ממנת יתר ואחריו נקע בצוואר הרחם בזמן הרצוי הבאים reperfusion.
2. פתח חלל הבטן לאסוף את רקמת המעי איסכמי לניתוח נוסף. קציר נורמלי בריאות רקמות סמוכות הרקמות הפגועות בקרתי פנימי לחשבון לכל תגובה מערכתית בכל נוגע לפגיעה.
   הערה: בקרה זה מתאימה יותר מאשר אחיזת העיניים המופעלות עכברים שליטים כי עכברי דמה מופעל אינם עוברים תגובה מערכתית בכל הנוגע לפגיעה נגרמת IR.
3. יש לשטוף היטב את תוכן המעי באמצעות מזרק 30 מ"ל עם מחט gavage מצורף מלא מלוחים ואז לחתוך את המעי longitudinally. אם מדגם של מעי נדרש עבור ניתוח ביטוי גנים, לחתוך שבר 1.5 מ"מ אורכים, ולהשתמש חתיכת נותרים לניתוח היסטולוגית.
4. לניתוח היסטולוגית, להכין רולדה בעזרת זוג מלקחיים כדי לגלגל את intestine.
5. כדי לשמור על הצורה התגלגלה, למקם את החלקים של מעי בין כריות קצף ביופסית קלטות רקמה (איור 2). מניח את הקלטות בפורמלין 10% שנאגרה.
6. תקן רקמה בפורמלין hr 24 לפחות. חלף פורמלין עם אתנול 70% עבור 24 שעות נוספות. רקמות חנות באתנול 70% ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר.
7. להטביע פרפין, לחתוך 5 סעיפים מיקרומטר ואת הכתם עם באמצעות hematoxylin ו eosin פרוטוקול סטנדרטי (איור 3).

6. ניקוד

1. ציון הפגיעה בעכברים איסכמיה-רה-פרפוזיה כפי שמסוכם בטבלה 2. בחר שיטת הניקוד המתאים.
2. אופציונלי: מחלקים את שדה הראייה לארבעה חלקים מאז חומרת הפגיעה משתנה לאורך כל הקטע.
3. חשב את ממוצע הציונים של כל קטע מתוך דפי תווים שהושגו בצורה עיוורת.
4. השווה את הכיתה של הרקמה הפגועה בין מקרים ובקרה וכן thדואר ללא פגע רקמות באמצעות מבחן Kruskal-Wallis, ואחריו מבחן ההשוואות המרובה של דאן.

תוצאות

אנחנו מותאמים פרוטוקול הניסוי של ניתוח IR להשיג פגיעה לשחזור IR מושרה של המעי בעכברים. נציג תוצאות מודגמות בסעיף זה.

איור 1 מציג דוגמאות של עמדת קליפים כלי דם כדי לגרום איסכמיה של המעי הע...

Discussion

פיתוח מודלים העכבר של פציעה IR מעיים השתפרו מאוד להבנת המנגנונים של פגיעה ברקמות וסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאל למזער נזק לרקמות ^7,9,11,34. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם מיצוב נכון של קליפים כלי הדם, עיתוי נכון של הערכה היסטולוגית איסכמיה והתקינה של פ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Pad	Sunbeam	E12107-819	Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine	Vasco	UCAP 0001-0000171	Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone	Parkland Scientific	ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge	Parkland Scientific	80000, 80120
Induction Chamber	Surgivet	V711802
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10	Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper	Oster	Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment	Webster	8804604
Buprenorphine	McKesson	562766	Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl)	Pfizer	NADA 45-290	Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips	Puritan medical products	806-WC	Autoclave before use
Betadine	Purdue Products	67618-150-17	10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution	Aspen	46066-807-60	Adjust to room temperature before use
IR rodent thermometer	BIOSEB	BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70 g	Roboz Surgical	RS5424, RS5435	Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40 g	Roboz Surgical	RS6472	Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps	World Precision Instruments	14189	Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin	Thermo Scientific	14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm	Cell Point Scientific	201-1000
Autoclip applier	Beckton Dickinson	427630
Byopsy foam pad	Simport	M476-1
Tissue cassette	Fisher Healthcare	15182701A	Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin	Fisher Scientific	245-684
Surgical iris scissors	World Precision Instruments	501263-G SC	Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors	World Precision Instruments	501219-G	Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps	Roboz Surgical	RS-5228, RS-8122	Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg	Sigma	2106
Reflex wound clip removing forceps	Roboz Surgical	RS-9263	Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile	Coviden	1050
Fisherbrand transfer pipets	Fischer Scientific	13-711-5AM	Use pipets to dropwise add saline