Modelo murino de isquemia-reperfusión intestinal Lesiones

Resumen

A continuación se describe el procedimiento detallado de isquemia-reperfusión intestinal en ratones que produce lesiones reproducibles sin mortalidad para fomentar la estandarización de esta técnica a través del campo. Este modelo de lesión de isquemia-reperfusión intestinal puede ser utilizado para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la lesión y regeneración.

Resumen

La isquemia intestinal es una afección potencialmente mortal asociado con una amplia gama de condiciones clínicas que incluyen la aterosclerosis, trombosis, hipotensión, enterocolitis necrotizante, trasplante de intestino, el trauma y la inflamación crónica. lesión intestinal por isquemia-reperfusión (IR) es una consecuencia de isquemia mesentérica aguda, causada por el flujo inadecuado de sangre a través de los vasos mesentéricos, lo que resulta en el daño intestinal. Reperfusión después de la isquemia puede exacerbar aún más el daño del intestino. Los mecanismos de la lesión IR son complejos y poco conocidos. Por lo tanto, los modelos experimentales de animales pequeños son fundamentales para la comprensión de la fisiopatología de la lesión IR y el desarrollo de nuevas terapias.

Aquí se describe un modelo de ratón de lesión IR intestinal aguda que proporciona lesión reproducible del intestino delgado sin mortalidad. Esto se consigue por la isquemia inducir en la región del íleon distal por temporalmente ocludinag las ramas colaterales periféricos y terminales de la arteria mesentérica superior durante 60 minutos con clips microvasculares. Reperfusión durante 1 hora, o 2 horas después de la lesión resulta en lesión reproducible del intestino examinado por análisis histológico. La correcta posición de las pinzas microvasculares es crítica para el procedimiento. Por lo tanto el clip de vídeo proporciona una detallada descripción visual paso a paso de esta técnica. Este modelo de lesión intestinal IR se puede utilizar para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la lesión y regeneración.

Introducción

El intestino es muy sensible a la interrupción del flujo de sangre que provoca isquemia y daño epitelial. Reperfusión después de la isquemia proporciona re-oxigenación del tejido, y puede promover aún más la patología. Por lo tanto, la lesión por isquemia y reperfusión intestinal se asocia con una amplia gama de patologías, incluyendo enterocolitis necrotizante, rechazo de aloinjertos en el trasplante de intestino delgado, las complicaciones de la cirugía de aneurisma de aorta abdominal, derivación cardiopulmonar, y ^1,2 enfermedad inflamatoria intestinal. IR lesión intestinal, isquemia mesentérica aguda sobre todo, es una condición que amenaza la vida como resultado de la morbilidad y la mortalidad ^3.

Aunque poco entendido, se cree que intestinal por isquemia-reperfusión (IR) daño a estar asociado con cambios en la microflora intestinal, así como la producción de especies reactivas del oxígeno y citoquinas inflamatorias y quimiocinas ^1,4-6. Esto conduce a la activación de ambos enNate y mecanismos inmunes adaptativas, que promueven la inflamación y el tejido ^1,7,8 lesión.

Los modelos animales son fundamentales para la comprensión de los mecanismos de la lesión por IR, ya que permiten una fácil ganancia y la pérdida de experimentos genéticos de la función. Varios modelos animales de IR se han desarrollado, que incluyen la oclusión vascular completa, bajo la isquemia de flujo, y segmentada de oclusión vascular (que se resumen en una revisión exhaustiva reciente ^9). La isquemia intestinal causado por la oclusión vascular completa de la arteria mesentérica superior (SMA) es un modelo sencillo y de uso común de IR en animales grandes y roedores ^9-11. Sin embargo, las diferentes áreas del intestino tienen diferente susceptibilidad a la lesión. Además, la diversa gama de anestésicos, analgésicos, técnicas de oclusión de la arteria, así como la inconsistencia en la duración de la lesión isquémica y resultado de recuperación en grados variables de lesión de confusión nuestra comprensión de la biología de IR a través de múltiples studies. La Tabla 1 muestra estas inconsistencias en los estudios de IR murino. El mayor inconveniente del uso de los tiempos de isquemia más cortos (30-45 min) se dirige a la ventana de la recuperación sobre la cual se pueden observar diferencias discernibles entre los casos y controles. lesión leve en el epitelio puede ser resuelto de una hora después de la reperfusión, por lo tanto, se especializó métricas patológicos pueden ser necesarios para encontrar las diferencias en la restitución epitelial. Por el contrario, un daño excesivo, como se ve por 100 min de la lesión isquémica puede resultar en la denudement completa del epitelio, cuando la restitución ya no es posible, el aumento de la tasa de mortalidad y el tiempo de recuperación. Por lo tanto, aquí se describe el procedimiento detallado de la RI intestinal en ratones que produce lesiones reproducibles sin mortalidad para fomentar la estandarización de esta técnica a través de nuestro campo. Este modelo de lesión intestinal IR se puede utilizar para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la lesión y regeneración.

Protocolo

Se llevaron a cabo estudios con animales de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud directrices y fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el uso comité del Instituto Trudeau. 8-12 semanas de edad C57BL / 6 ratones se utilizaron para el estudio.

1. Preparación para la Cirugía

1. Preparar y esterilizar instrumentos quirúrgicos.
2. Preparar sistema de anestesia basada en isoflurano con el cono de la nariz y la almohadilla caliente. Asegúrese de que la almohadilla caliente no se ha recalentado (<39 ºC).
3. Asegúrese de que el isoflurano recipiente de recogida de gases está colocado correctamente para asegurar que los orificios de escape en la parte inferior de la lata no se bloquean o ocluido de ninguna manera. Pesar recipiente de recogida de gases antes del procedimiento y el peso del documento en el cartucho. Deseche el cartucho cuando el peso del recipiente es superior a 50 g de peso acumulado (~ 12 h).

2. anestesia

1. Anestesiar al ratón con 3% de isoflurano en una cámara de inducción (1 L / minO _2).
   1. Evaluar la profundidad anestésica por una incapacidad para permanecer en posición vertical, pérdida de movimiento intencional voluntaria, pérdida del reflejo de parpadeo, la relajación muscular y la pérdida de respuesta a la estimulación reflex (dedo del pie o pellizco de la cola con una presión firme).
   2. Evaluar la frecuencia respiratoria y el patrón mediante la observación de los movimientos de la pared torácica y abdominal. Bajo anestesia óptima, la tasa de respiración debe ser ~ 55-65 respiraciones por minuto.
   3. Retire ratón desde la cámara de inducción y afeitar rápidamente el área del abdomen del ratón.
2. Para evitar la desecación de la córnea, colocar pomada oftálmica sosa en los ojos.
3. Coloca el ratón sobre la almohadilla caliente y conectarlo a través de cono de la nariz con el sistema de anestesia. Asegúrese de que la membrana cono de la nariz de látex se ajusta firmemente sobre la cabeza del ratón y no hay fugas de isoflurano.
4. Reducir la tasa de isoflurano al 1,5%, e inyectar buprenorfina (0,1 mg / kg) y ketamina (10 mg / kg) por vía subcutánea para prevenir wind-up del dolor en cascada.
5. limpie THe la piel de la zona de operación con un hisopo de algodón estéril empapada con una solución de Betadine quirúrgico seguido de etanol al 70%.

3. Cirugía

1. Hacer una laparotomía cm de la línea media de 3-5 con tijeras de funcionamiento. Área de actividad de la cubierta con el cojín no adherente estéril humedecido con solución salina. Aislar ciego y el íleon y exponer la arteria mesentérica superior usando hisopos de algodón humedecidos en solución salina.
2. Para facilitar la aplicación de clips, hacer pequeñas muescas en el mesenterio que rodea la arteria mesentérica superior usando iris finas scissors.To ello, levante suavemente el intestino con una pinza vestidores y cortar mesenterio a ambos lados de la arteria mesentérica superior en la posición de corte deseada (Figura 1A). A continuación, añadir algunas gotas de solución salina estéril a la zona de la posición de clip deseado antes de aplicar clips.
   Nota: Para realizar la cirugía simulada, siga el procedimiento quirúrgico hasta el paso 3.2. No aplicar clips. En su lugar, mantener el tejido húmedo por el agregado s tibiaaline como se describe en 3.6 durante 1 h. Después, continúe en el paso 4.1,
3. Ocluir las primeras ramas de la orden de la arteria mesentérica superior con clips microvasculares (70 g de fuerza) utilizando un aplicador de clips para crear una región de 5-7 cm del íleon isquémica adyacente al ciego (Figura 1B). Aunque la posición de los vasos es conservadora, puede haber ligeras variaciones entre los ratones (ver ejemplos en la Figura 1). Por lo tanto, se requieren generalmente 2 o 3 clips (ver la situación de los clips en la Figura 1A, D, E, flechas negras).
   Nota: Utilice grapas de vaso de alta calidad. clips de alta presión puede dañar los vasos y evitar la regeneración mientras que los clips de baja presión (<30 g) no puede bloquear completamente el flujo sanguíneo.
4. Bloquear el flujo sanguíneo colateral a través del intestino usando dos clips microvasculares través de los vasos (40 g fuerza), demarcación de la región del intestino isquémico (Figura 1). Se requiere la oclusión de vasos colaterales aimpide el suministro de sangre de los vasos sanguíneos adyacentes (ver la situación de los clips en la figura 1A, D, E, flechas verdes).
5. Opcional: Añadir solución de heparina (6 USP unidades / ml), para prevenir la coagulación de la sangre. Gota a gota añadir 0,5 ml de solución de heparina al intestino aislado.
6. Húmedos almohadilla no adherente delicados toallitas estériles con solución salina precalentada a 37 ° C y se aplican a la zona quirúrgica. Asegúrese de que las toallitas húmedas se mantiene durante todo el procedimiento.
7. Mantener la isquemia durante 60 minutos usando 1-1,5% a lo largo de la anestesia con isoflurano. Si la isquemia procedimiento se realiza correctamente, la región isquémica cambiará a rojo vino de color en aproximadamente 30 minutos. Tenga en cuenta que los vasos sanguíneos distales a la posición del clip se agrandan durante la isquemia (Figura 1, paneles de la derecha) que indica la oclusión exitosa.
8. Vigilar de cerca el ratón durante la etapa de la isquemia. Seguir aplicando una solución salina para la almohadilla no adherente que cubre el sitio de la cirugía.
9. marcalos bordes de la zona isquémica mediante pipeteo 20 l de Gill`s 3 hematoxilina sobre el tejido para facilitar la cosecha el tejido isquémico y el tejido sano adyacente de la misma para la comparación de ratón (Figura 1E, panel derecho).

4. Etapa de reperfusión

1. Al final de la isquemia añadir unas gotas de solución salina en el área de clip y retire suavemente clips microvasculares con aplicador de clips. A continuación, empuje suavemente el intestino de nuevo a la cavidad abdominal con solución salina humedecido puntas de algodón. Retire la almohadilla no adherente y cierre de la pared abdominal y la piel utilizando acero inoxidable grapas para heridas 9 mm. Si la reperfusión se lleva a cabo durante más de 3 horas, utilice una sutura absorbible vicryl para cerrar la pared abdominal antes de la aplicación de grapas de heridas en la piel.
2. Mantener los ratones en una jaula limpia calentó durante cantidad deseada de tiempo (30 min, 60 min, 120 min, o 180 min) para la fase de reperfusión.
3. Compruebe los animales al menos cada 30 minutos para asegurar la estabilidad.

5. La necropsia y recolección de intestino delgado

1. La eutanasia a los ratones por CO ₂ sobredosis seguido por dislocación cervical en el momento deseado después de la reperfusión.
2. Abra cavidad abdominal y recoger el tejido intestinal isquémica para su posterior análisis. Cosecha tejido normal sano adyacente al tejido lesionado como un control interno para dar cuenta de cualquier reacción sistémica a la lesión.
   Nota: Este control es más apropiada que la operación simulada ratones de control porque los ratones con operación simulada no se someten a una reacción sistémica a la lesión inducida por IR.
3. Lave el contenido intestinal mediante jeringa de 30 ml con aguja de sonda unida llena con solución salina y luego se corta el intestino longitudinalmente. Si se requiere una muestra de intestino para el análisis de la expresión génica, cortar un fragmento de 1,5 mm en sentido longitudinal, y el uso de la pieza restante para el análisis histológico.
4. Para el análisis histológico, preparar un rollo suizo usando un par de pinzas para hacer rodar la intestine.
5. Para mantener la forma enrollada, colocar las piezas de intestino entre almohadillas de espuma de biopsia en cassettes de tejido (Figura 2). Coloque los cassettes en 10% de formalina tamponada.
6. Fijar el tejido en formalina durante al menos 24 h. Reemplazar formol con un 70% de etanol durante 24 horas más. tejido de la tienda en 70% de etanol indefinidamente a temperatura ambiente.
7. Incrustar en parafina, se cortaron secciones de 5 micras y se tiñen con hematoxilina y eosina utilizando un protocolo estándar (Figura 3).

6. Scoring

1. Puntuación de la lesión por isquemia-reperfusión murino tal como se resume en la Tabla 2. Elija un método de puntuación apropiada.
2. Opcional: Se divide el campo de visión en cuatro secciones ya que la gravedad de la lesión varía a lo largo de la sección.
3. Calcular la nota media de cada sección de las puntuaciones obtenidas a ciegas.
4. Comparar el grado del tejido lesionado entre los casos y de control, así como a the ileso tejido utilizando una prueba de Kruskal-Wallis, seguido de la prueba de comparaciones múltiples de un Dunn.

Resultados

Hemos optimizado el protocolo experimental de la cirugía de infrarrojos para obtener la lesión inducida reproducible IR del íleon en ratones. Los resultados representativos se manifestaron en esta sección.

La Figura 1 muestra ejemplos de posición clips microvasculares para inducir isquemia del íleon. Las flechas negras indican la posición de los principales clips que ocluyen las ramas de primer orden de...

Discusión

El desarrollo de modelos de ratón de IR lesión intestinal han mejorado en gran medida la comprensión de los mecanismos de lesión tisular y ayudado en el desarrollo de estrategias terapéuticas potenciales para minimizar los daños ^7,9,11,34. Los pasos críticos de este protocolo son la colocación apropiada de las grapas microvasculares, la coordinación correcta de la evaluación histológica isquemia y adecuada de la lesión IR.

La duración de la isquemia es crítica para d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Pad	Sunbeam	E12107-819	Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine	Vasco	UCAP 0001-0000171	Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone	Parkland Scientific	ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge	Parkland Scientific	80000, 80120
Induction Chamber	Surgivet	V711802
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10	Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper	Oster	Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment	Webster	8804604
Buprenorphine	McKesson	562766	Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl)	Pfizer	NADA 45-290	Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips	Puritan medical products	806-WC	Autoclave before use
Betadine	Purdue Products	67618-150-17	10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution	Aspen	46066-807-60	Adjust to room temperature before use
IR rodent thermometer	BIOSEB	BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70 g	Roboz Surgical	RS5424, RS5435	Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40 g	Roboz Surgical	RS6472	Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps	World Precision Instruments	14189	Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin	Thermo Scientific	14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm	Cell Point Scientific	201-1000
Autoclip applier	Beckton Dickinson	427630
Byopsy foam pad	Simport	M476-1
Tissue cassette	Fisher Healthcare	15182701A	Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin	Fisher Scientific	245-684
Surgical iris scissors	World Precision Instruments	501263-G SC	Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors	World Precision Instruments	501219-G	Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps	Roboz Surgical	RS-5228, RS-8122	Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg	Sigma	2106
Reflex wound clip removing forceps	Roboz Surgical	RS-9263	Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile	Coviden	1050
Fisherbrand transfer pipets	Fischer Scientific	13-711-5AM	Use pipets to dropwise add saline