Modèle murin de Intestinal Ischémie-reperfusion

Résumé

Nous décrivons ici la procédure détaillée de l'intestin d'ischémie-reperfusion chez des souris ayant entraîné des lésions reproductibles sans mortalité pour encourager la standardisation de cette technique à travers le champ. Ce modèle de l'intestin lésions d'ischémie-reperfusion peut être utilisée pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de blessures et de régénération.

Résumé

l'ischémie intestinale est une condition potentiellement mortelle associée à une large gamme de conditions cliniques, y compris l'athérosclérose, la thrombose, l'hypotension, l'entérocolite nécrosante, de l'intestin transplantation, les traumatismes et l'inflammation chronique. Intestinal lésions d'ischémie-reperfusion (IR) est une conséquence de l'ischémie mésentérique aiguë, causée par la circulation sanguine insuffisante par les vaisseaux mésentériques, entraînant des dommages intestinaux. Ischémie reperfusion suivant peut encore aggraver les dommages de l'intestin. Les mécanismes de blessure IR sont complexes et mal comprises. Par conséquent, les modèles expérimentaux animaux de petite taille sont essentiels pour la compréhension de la pathophysiologie de la blessure IR et le développement de nouvelles thérapies.

Nous décrivons ici un modèle de souris de blessure IR intestinale aiguë qui fournit une blessure reproductible de l'intestin grêle, sans mortalité. Ceci est réalisé par l'ischémie induisant dans la zone de l'iléon distal par temporellement occludineg les branches collatérales périphériques et terminales de l'artère mésentérique supérieure pendant 60 minutes en utilisant des clips microvasculaires. Reperfusion pendant 1 heure ou 2 heures après lésion entraîne une blessure reproductible de l'intestin examiné par analyse histologique. position correcte des pinces microvasculaires est critique pour la procédure. Par conséquent, le clip vidéo fournit une description détaillée visuelle étape par étape de cette technique. Ce modèle de blessure IR intestinale peut être utilisée pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de blessures et de régénération.

Introduction

L'intestin est très sensible à l'interruption de la circulation sanguine ce qui provoque l'ischémie et l'épithélium endommagé. Reperfusion après une ischémie fournit re-oxygénation du tissu, et peut promouvoir davantage la pathologie. Par conséquent, une ischémie et une lésion de reperfusion intestinale est associée à une large gamme de pathologies, y compris l' entérocolite nécrosante, le rejet d' allogreffe dans une transplantation de l' intestin, les complications de la chirurgie de l' aorte abdominale d' un anévrisme, un pontage cardiopulmonaire et ^1,2 inflammatoire de la maladie de l' intestin. Lésion intestinale IR, l' ischémie mésentérique particulièrement aigu, est une condition mortelle résultant de la morbidité et de la mortalité ^3.

Bien que mal compris, intestinale ischémie-reperfusion (IR) blessure est pensé pour être associée à des changements dans le microbiote intestinal ainsi que la production d'espèces réactives de l' oxygène et des cytokines inflammatoires et des chimiokines ^1,4-6. Cela conduit à une activation à la fois ennate et les mécanismes immunitaires adaptatives qui favorisent l' inflammation et les tissus des blessures ^1,7,8.

Les modèles animaux sont essentiels à la compréhension des mécanismes de blessure IR, car ils permettent facile et intensité forte des expériences génétiques perte de fonction. Plusieurs modèles animaux de IR ont été développés qui comprennent l' occlusion vasculaire complète, faible ischémie d'écoulement, et segmenté occlusion vasculaire (résumé dans un examen complet récente ^9). L' ischémie intestinale causée par une occlusion vasculaire complète de l' artère mésentérique supérieure (SMA) est un modèle simple et couramment utilisé IR chez les grands animaux et les rongeurs ^9-11. Cependant, les différentes zones de l'intestin ont une sensibilité différente à la blessure. En outre, la diversité des anesthésiques, des analgésiques, des techniques d'occlusion de l'artère, ainsi que des incohérences dans la durée de la lésion ischémique et le résultat de la récupération à des degrés variables de blessures confondant notre compréhension de la biologie de l'IR à travers studie multipless. Le tableau 1 montre ces incohérences dans les études IR murins. Le plus grand inconvénient d'utiliser les temps ischémiques plus courtes (30-45 min) vise la fenêtre de rétablissement sur lequel des différences perceptibles entre les cas et les contrôles peuvent être observés. blessure légère à l'épithélium peut être résolu d'une heure après reperfusion, par conséquent spécialisée métriques pathologiques peuvent être nécessaires pour trouver des différences dans la restitution épithéliale. En revanche, des dommages excessifs, comme on le voit en 100 min d'une lésion ischémique peut entraîner la denudement complète de l'épithélium, lorsque la restitution ne peut plus, en augmentant le taux de mortalité, et le temps de récupération. Par conséquent, nous décrivons ici la procédure détaillée de IR intestinale chez des souris ayant entraîné des lésions reproductibles sans mortalité pour encourager la standardisation de cette technique dans notre domaine. Ce modèle de blessure IR intestinale peut être utilisée pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de blessures et de régénération.

Protocole

Les études animales ont été effectuées en conformité avec l'Institut national de la Santé et des lignes directrices ont été approuvées par l'Institutional Animal Care et utilisent Comité de l'Institut Trudeau. 8 à 12 semaines C57BL / 6 de souris ont été utilisées pour l'étude.

1. Préparation pour la chirurgie

1. Préparer et stériliser les instruments chirurgicaux.
2. Préparer un système d'anesthésie à base isoflurane avec cône et coussin chauffant. Assurez-vous que coussin chauffant est pas surchauffé (<39 ° C).
3. Assurez-vous que le balayage des gaz d'isoflurane cartouche est correctement positionnée pour que les orifices d'évacuation au fond de la boîte métallique ne sont pas bloqués ou occlus en aucune façon. Peser gaz balayage cartouche avant la procédure et le document poids sur cartouche. Jeter le contenant lorsque le poids de la cartouche est supérieure à 50 g de poids accumulé (~ 12 h).

2. Anesthésie

1. Anesthetize souris avec 3% d'isoflurane dans une chambre d'induction (1 L / minO _2).
   1. Évaluer profondeur de l'anesthésie par une incapacité à rester debout, la perte de mouvement intentionnel volontaire, perte de réflexe de clignement, la relaxation musculaire et la perte de réponse à une stimulation réflexe (orteil ou pincement de la queue avec une pression ferme).
   2. Évaluer la fréquence respiratoire et le modèle en observant la paroi thoracique et les mouvements abdominaux. Sous anesthésie optimale, le taux de respiration doit être ~ 55-65 respirations par minute.
   3. Retirez la souris de la chambre d'induction et de se raser rapidement la région de l'abdomen de la souris.
2. Pour éviter la dessiccation de la cornée, placer pommade ophtalmique fade dans les yeux.
3. Placez la souris sur le coussin chauffant et le connecter via cône de nez au système d'anesthésie. Faire membrane cône de nez de latex que soit fermement sur la tête de la souris et il n'y a pas de fuite de l'isoflurane.
4. Réduire le taux isoflurane à 1,5%, et injecter buprénorphine (0,1 mg / kg) et de la kétamine (10 mg / kg) sous-cutanée pour éviter la liquidation de la douleur-cascade.
5. essuyez ee peau de la zone d'opération avec un tampon de coton stérile imbibé de solution chirurgicale Betadine suivie par 70% d'éthanol.

3. Surgery

1. Faire un cm laparotomie ligne médiane 3-5 avec des ciseaux d'exploitation. Couvrir la zone d'opération avec un tampon non-adhérente stérile humidifié avec une solution saline. Isoler caecum et de l'iléon et d'exposer l'artère mésentérique supérieure en utilisant des tampons de coton humidifié dans une solution saline.
2. Pour faciliter pince à appliquer, faire de petites entailles dans le mésentère entourant l'artère mésentérique supérieure en utilisant l' iris fines scissors.To faire, soulevez doucement l'intestin avec une pince de pansement et couper mésentère des deux côtés de l'artère mésentérique supérieure à la position du clip désiré (Figure 1A). Ensuite, ajoutez quelques gouttes de solution saline stérile à la zone de la position du clip désiré avant d'appliquer des clips.
   Remarque: Pour effectuer l'intervention chirurgicale fictive, suivre la procédure chirurgicale jusqu'à l'étape 3.2. Ne pas appliquer des clips. Au lieu de cela, de maintenir le tissu humide par ajouté s chaudaline comme décrit dans 3,6 pendant 1 heure. Ensuite, passez à l'étape 4.1,
3. Obturer les premières branches de l' ordre de l'artère mésentérique supérieure avec des clips microvasculaires (70 g de force) à l' aide d' un applicateur de clips pour créer une région de 5-7 cm de l'iléon ischémique adjacent à caecum (figure 1B). Bien que la position des navires est conservatrice, il pourrait y avoir de légères variations entre les souris (voir des exemples sur la figure 1). Par conséquent, 2 ou 3 clips sont habituellement nécessaires (voir l'emplacement des clips sur la figure 1A, D, E, flèches noires).
   Remarque: Utilisez des pinces de navires de haute qualité. clips à haute pression peuvent endommager les vaisseaux et prévenir la régénération tandis que les clips de basse pression (<30 g) ne peut pas bloquer complètement la circulation sanguine.
4. Bloquer la circulation sanguine collatérale dans l'intestin en utilisant deux clips microvasculaires à travers les navires (40 g vigueur), démarquage la région de l' intestin ischémique (Figure 1). Occlusion des vaisseaux collatéraux est nécessaire pourempêcher l' approvisionnement en sang des vaisseaux sanguins adjacents (voir l'emplacement des clips sur la figure 1A, D, E, flèches vertes).
5. Facultatif: ajouter une solution d'héparine (6 unités USP / ml) pour empêcher la coagulation du sang. Ajouter goutte à goutte 0,5 ml d'une solution d'héparine à l'intestin isolé.
6. Wet pad non-adhérent lingettes délicates stériles avec une solution saline pré-chauffé à 37 ° C et d'appliquer à la zone chirurgicale. Assurez-vous que les lingettes reste humide pendant toute la procédure.
7. Maintenir l'ischémie pendant 60 minutes en utilisant 1-1,5% isoflurane partout. Si la procédure d'ischémie est effectuée correctement, la région ischémique va changer au vin de couleur rouge dans environ 30 min. Notez que les vaisseaux distaux à la position du clip de sang sont agrandies au cours de l' ischémie (Figure 1, panneaux de droite) indiquant une occlusion réussie.
8. Surveiller de près la souris lors de l'étape de l'ischémie. Continuer à appliquer une solution saline au tampon non-adhérente couvrant le site de la chirurgie.
9. marqueles bords de la zone ischémique par pipetage de 20 ul Gill`s 3 hématoxyline sur le tissu afin de faciliter la récolte des tissus ischémiques et les tissus sains adjacents de la même souris à titre de comparaison (figure 1E, panneau de droite).

4. reperfusion étape

1. A la fin de l'ischémie ajouter quelques gouttes de solution saline sur la zone du clip et retirez délicatement les clips microvasculaires avec applicateur d'agrafes. Ensuite, poussez doucement l'intestin vers la cavité abdominale en utilisant une solution saline humidifié conseils de coton. Retirer pad non-adhérent et fermer la paroi abdominale et de la peau en utilisant 9 mm des agrafes en acier inoxydable. Si reperfusion est effectuée pendant plus de 3 heures, utiliser un vicryl suture absorbable pour fermer la paroi abdominale avant d'appliquer des clips plaies sur la peau.
2. Maintenir la souris dans une cage propre chauffé pendant la durée souhaitée (30 min, 60 min, 120 min, 180 min) pendant la phase de reperfusion.
3. Vérifier les animaux au moins toutes les 30 min pour garantir la stabilité.

5. Nécropsie et récolte des petits Intestin

1. Euthanasier souris par CO ₂ surdose suivie par dislocation cervicale au moment voulu suivant reperfusion.
2. Ouvrir la cavité abdominale et recueillir le tissu intestinal ischémique pour une analyse ultérieure. Récolte du tissu sain et normal adjacent au tissu lésé comme un contrôle interne pour tenir compte de toute réaction systémique à des blessures.
   Remarque: Ce contrôle est plus approprié que le simulacre utilisé des souris de contrôle parce que les souris sham opéré ne subissent pas une réaction systémique à une blessure IR-induite.
3. Laver le contenu intestinal en utilisant 30 ml seringue avec une aiguille de gavage joint rempli de solution saline, puis couper l'intestin longitudinalement. Si un échantillon de l'intestin est nécessaire pour l'analyse de l'expression des gènes, couper un fragment de 1,5 mm longitudinalement, et utiliser le morceau restant pour l'analyse histologique.
4. Pour l'analyse histologique, préparer un rouleau suisse en utilisant une paire de pinces pour rouler le Intestine.
5. Pour maintenir la forme enroulée, placer les morceaux de l' intestin entre les plots de mousse de biopsie dans des cassettes de tissus (figure 2). Placez les cassettes dans 10% de formaline tamponnée.
6. Fixer le tissu dans le formol pendant au moins 24 heures. Remplacer la formaline avec 70% d'éthanol pour un 24 heures supplémentaires. tissus de magasin dans 70% d'éthanol indéfiniment à la température ambiante.
7. Incluez dans de la paraffine, couper 5 um sections et aux taches avec de l' hématoxyline et de l' éosine en utilisant un protocole standard (Figure 3).

6. Scoring

1. Score de la lésion d' ischémie-reperfusion murin tel que résumé dans le tableau 2. Choisissez une méthode de notation appropriée.
2. Facultatif: Diviser le champ de vision en quatre sections depuis la gravité de la blessure varie tout au long de la section.
3. Calculer la teneur moyenne de chaque section à partir des scores obtenus à l'aveuglette.
4. Comparez la qualité du tissu blessé entre les cas et le contrôle ainsi que de the indemne tissu à l'aide d'un test de Kruskal-Wallis, suivie par de multiples tests de comparaisons d'un Dunn.

Résultats

Nous avons optimisé le protocole expérimental de la chirurgie IR pour obtenir reproductible lésion induite IR de l'iléon chez la souris. Les résultats représentatifs sont illustrés dans cette section.

La figure 1 montre des exemples de la position des clips microvasculaires pour induire une ischémie de l'iléon. Les flèches noires indiquent la position des principaux clips occlusifs premières...

Discussion

Le développement de modèles de souris de blessures IR intestinale ont grandement amélioré la compréhension des mécanismes de la lésion tissulaire et aidé dans le développement de stratégies thérapeutiques potentielles pour minimiser les dommages des tissus ^7,9,11,34. Les étapes essentielles de ce protocole sont un bon positionnement des clips microvasculaires, bon timing de l'évaluation de l'ischémie et histologiques appropriée des blessures IR.

La durée de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Pad	Sunbeam	E12107-819	Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine	Vasco	UCAP 0001-0000171	Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone	Parkland Scientific	ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge	Parkland Scientific	80000, 80120
Induction Chamber	Surgivet	V711802
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10	Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper	Oster	Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment	Webster	8804604
Buprenorphine	McKesson	562766	Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl)	Pfizer	NADA 45-290	Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips	Puritan medical products	806-WC	Autoclave before use
Betadine	Purdue Products	67618-150-17	10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution	Aspen	46066-807-60	Adjust to room temperature before use
IR rodent thermometer	BIOSEB	BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70 g	Roboz Surgical	RS5424, RS5435	Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40 g	Roboz Surgical	RS6472	Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps	World Precision Instruments	14189	Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin	Thermo Scientific	14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm	Cell Point Scientific	201-1000
Autoclip applier	Beckton Dickinson	427630
Byopsy foam pad	Simport	M476-1
Tissue cassette	Fisher Healthcare	15182701A	Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin	Fisher Scientific	245-684
Surgical iris scissors	World Precision Instruments	501263-G SC	Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors	World Precision Instruments	501219-G	Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps	Roboz Surgical	RS-5228, RS-8122	Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg	Sigma	2106
Reflex wound clip removing forceps	Roboz Surgical	RS-9263	Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile	Coviden	1050
Fisherbrand transfer pipets	Fischer Scientific	13-711-5AM	Use pipets to dropwise add saline