肠缺血再灌注损伤的小鼠模型

摘要

这里，我们描述肠缺血再灌注的小鼠中的详细过程，这导致在重现的损伤而不死亡率鼓励跨字段这种技术的标准化。肠缺血再灌注损伤的该模型可用于研究损伤和再生的细胞和分子机制。

摘要

肠缺血是具有广泛的临床病症，包括动脉粥样硬化，血栓形成，低血压，坏死性小肠结肠炎，肠移植，创伤和慢性炎症有关的威胁生命的情况。肠缺血再灌注（IR）的损伤为急性肠系膜缺血的结果，通过肠系膜血管引起的血流量不足，导致肠损伤。再灌注缺血可能进一步加剧肠道损伤。 IR损伤的机制是复杂的和理解甚少。因此，实验小动物模型是了解缺血再灌注损伤的病理生理和新疗法的发展至关重要。

这里，我们描述急性肠道IR损伤，提供了小肠的重现性损伤而不死亡率的小鼠模型。这是通过诱导缺血远端回肠的区域由在时间上的occludin实现克用微血管夹子60分钟肠系膜上动脉的周边和终端侧枝。再灌注1小时后，或在通过组织学分析研究了肠的可再现伤伤结果后2小时。微血管剪辑的正确位置的程序是至关重要的。因此，视频剪辑提供这一技术的详细目视一步一步的说明。肠IR损伤的该模型可用于研究损伤和再生的细胞和分子机制。

引言

肠道是引起缺血和上皮损伤的血流量的中断非常敏感。缺血再灌注提供了组织的复氧，并能进一步促进病理。因此，肠缺血再灌注损伤是具有广泛的病状，包括坏死性小肠结肠炎，在小肠移植同种异体移植物排斥，腹主动脉瘤手术，心肺旁路和炎性肠病^1,2-并发症相关联。肠缺血再灌注损伤，尤其是急性肠系膜缺血，是造成发病率和死亡率³危及生命的疾病。

虽然了解甚少，肠缺血再灌注（IR）的损伤被认为是与肠道菌群的变化以及产生活性氧和炎性细胞因子和趋化因子^1,4-6相关联。这导致在这两种激活内特和促进炎症和组织损伤^1,7,8适应性免疫的机制。

动物模型对于理解IR损伤的机制的关键，因为它们允许容易GAIN-和失功能遗传实验。已开发红外几种动物模型，其中包括完整的血管闭塞，低流量缺血和分段血管闭塞（在最近的一次全面回顾总结^9）。引起肠系膜上动脉（SMA）的完整的血管闭塞肠缺血是IR的大型动物和啮齿动物^9-11一个简单而常用的模式。然而，肠道的不同区域有不同的易感性伤害。此外，各种不同的麻醉剂，镇痛药，动脉阻塞技术，以及在可变程度的损伤缺血性损伤和恢复结果的持续时间不一致混杂我们的红外跨多个studie的生物学的理解秒。 表1展示了在小鼠IR研究这些不一致。从使用较短的缺血时间（30-45分钟），最大的缺点是针对在可观察的病例与对照组之间差异明显复苏的窗口。轻度损伤的上皮可以解决再灌注后一小时，因此专门病理指标可能需要找到在上皮恢复原状的差异。与此相反，过大的损坏，由100分钟缺血损伤所看到可能导致上皮，恢复原状不再可能的完整denudement，增加死亡率，和恢复时间。因此，在这里我们描述肠道IR小鼠的详细程序导致重复性的伤害死亡率不鼓励在我们领域这一技术的标准化。肠IR损伤的该模型可用于研究损伤和再生的细胞和分子机制。

研究方案

动物研究按照健康准则全国学院进行，并由机构动物护理被批准，并使用特鲁多研究所委员会。 8-12周龄的C57BL / 6小鼠用于该研究。

1.准备手术

1. 准备和消毒手术器械。
2. 制备基于异氟醚麻醉系统的鼻锥，并加热垫。确保加热垫不会过热（<39℃）。
3. 确保异氟烷气体清除罐被正确地定位，以确保排气口在所述罐的底部不被堵塞或以任何方式闭塞。称重之前对罐程序和文件重气体清扫罐。当罐的重量超过50g累计重量（〜12小时）的丢弃罐。

2.麻醉

1. 麻醉小鼠，用3％异氟烷在感应腔室（1升/分钟O _2）。
   1. 通过无力评估麻醉深度，以保持直立，有目的的自主运动，眨眼反射消失，肌肉松弛，以及失去响应的损失反射性刺激（趾或尾掐以坚定的压力）。
   2. 通过观察胸壁和腹部的运动评估呼吸频率和模式。在最佳麻醉，呼吸速率应为每分钟55-65〜呼吸。
   3. 从感应腔除去小鼠，并迅速剃鼠标的腹部区域。
2. 为预防角膜干燥，将平淡无奇的眼药膏在眼里。
3. 放置在加热垫鼠标，它通过鼻锥连接到麻醉系统。确保胶乳鼻锥膜牢固地配合在小鼠头部并没有异氟烷的泄漏。
4. 减少异氟烷率至1.5％，并注入丁丙诺啡（0.1毫克/千克）和氯胺酮（10毫克/千克）经皮下以防止疼痛级联的卷绕。
5. 擦拭日e皮肤与手术优碘溶液，然后用70％乙醇浸泡消毒棉签操作区。

3.手术

1. 做一个中线3-5厘米剖腹手术以经营剪刀。用无菌非粘附垫用生理盐水沾湿覆盖操作区域。隔离盲肠和回肠，用在盐水中浸湿的棉签暴露肠系膜上动脉。
2. 为了方便剪辑应用，在周围用细光圈scissors.To做到这一点，肠系膜上动脉肠系膜做小缺口，轻轻抬起换药镊子肠道，并在需要的剪辑的位置上切断肠系膜上动脉两侧肠系膜（ 图1A）。然后，施加片段之前添加无菌生理盐水几滴需要的剪辑的位置的区域。
   注意:要进行假手术，按照手术步骤执行到步骤3.2。不适用剪辑。相反，保持组织通过添加温暖湿润小号艾琳在3.6 1小时描述。随后，执行步骤4.1，
3. 闭塞使用一个夹具施放创建相邻盲肠（ 图1B）的缺血性回肠的5-7厘米区域微血管剪辑（70挤压力g）肠系膜上动脉的第一级分支。虽然船只的位置是保守的，有可能是小鼠之间的细微变化（参见图1的例子）。因此，2或3个片段，通常需要（参见图1A，D，E，黑色箭头的剪辑的位置）。
   注意:使用高品质的容器剪辑。高压剪辑会损害血管和防止再生，而低压剪辑（<30克）可以不完全阻断血流。
4. 通过使用跨血管2微血管夹子（40克的力）的肠阻塞侧支血流，demarking缺血肠的区域（ 图1）。侧支血管闭塞，需要防止从相邻血管的血液供应（参见图1A，D，E，绿色箭头的剪辑的位置）。
5. 可选:添加肝素溶液（6 USP单位/ ml），以防止血液凝固。滴加到0.5肝素溶液毫升的离体肠管。
6. 用盐水湿无菌非粘附垫娇嫩湿巾预先加热到37℃，并适用于手术区。确保湿巾在整个过程中保持湿润。
7. 保持缺血使用整个1-1.5％异氟烷麻醉60分钟。如果正确地执行局部缺血过程中，局部缺血区域将在大约30分钟改变为酒红色的颜色。需要注意的是血管远侧夹子位置指示成功闭塞缺血（ 图1，右图）中被放大。
8. 密切监察在缺血阶段鼠标。继续适用盐溶液到非粘附垫覆盖所述手术部位。
9. 标记缺血区的通过在组织上吸取20微升Gill`s 3苏木的边缘，以方便收获从同一小鼠的缺血组织和邻近的健康组织进行比较（ 图1E，右图）。

4.再灌注阶段

1. 在缺血的末尾添加上剪辑区域生理盐水滴几滴，轻轻取出微血管剪辑施夹。然后，用盐水湿润棉提示轻轻地推肠道回腹腔。除去非贴壁垫和关闭使用9个毫米的不锈钢伤口夹腹壁和皮肤。如果超过3小时进行再灌注时间越长，使用可吸收的薇乔缝合皮肤上施加缠绕剪辑之前关闭腹壁。
2. 保持在加热的清洁笼子小鼠的灌注阶段的时间所需量的（30分钟，60分钟，120分钟，或180分钟）。
3. 检查动物至少每30分钟，以确保稳定性。

5。剖检及小肠的收获

1. 用CO安乐死的小鼠₂过量随后在所希望的时间再灌注颈脱位。
2. 打开腹腔并收集作进一步的分析缺血性肠组织。邻接受伤组织作为内部对照以考虑到损伤任何全身反应收获健康的正常组织。
   注意:此控件是比较合适的比假手术的对照组小鼠，因为假手术小鼠不接受以IR-性损伤全身反应。
3. 洗出用30毫升注射器填充以生理盐水，然后连接灌胃针切肠肠纵向内容。如果需要对基因表达分析小肠的样品，切1.5毫米片段纵向，并用于组织学分析的剩余片。
4. 对于组织学分析，使用一对镊子来滚动INTEST准备了瑞士卷国家统计局。
5. 维持轧制形式，放置肠中的多条组织盒活检泡沫垫（ 图2）之间。放置在10％缓冲福尔马林卡匣。
6. 修复组织在福尔马林中至少24小时。额外24小时替换用70％乙醇福尔马林。商店组织在70％乙醇无限期在室温下。
7. 在石蜡中嵌入，切为5μm切片并用苏木精和曙红使用标准协议（图3）染色。

6.评分

1. 分数鼠缺血再灌注损伤如表2。选择一个合适的评分方法。
2. 可选:划分的视场分为四个部分，因为伤害的严重程度在整个一节有所不同。
3. 从计算得到盲目得分每一部分的平均品位。
4. 比较案件和控制之间的受损组织的档次以及为thE使用秩和检验测试，随后邓恩的多重比较试验没有受伤的组织。

结果

我们优化的IR手术的实验方案获得小鼠回肠的重现性IR损伤的作用。代表性的结果证明了在此部分。

图1示出微血管剪辑位置的例子以诱导回肠的缺血。黑色箭头显示夹闭肠系膜上动脉一级分支的主要片段的位置。绿色箭头表示的附加片段的位置，以阻止来自侧支血管的血液供应。注意闭塞血管远端片段位置和intest...

讨论

肠道缺血再灌注损伤的小鼠模型的发展大大提高了组织损伤机制的理解和潜在的治疗策略的发展援助，以尽量减少组织损伤^7,9,11,34。此协议的关键步骤是微血管剪辑的正确定位，缺血再灌注损伤的缺血和适当的组织学评价的正确时机。

缺血的持续时间是为后续上皮损伤是至关重要的。以诱导可重复的IR损伤无发病率和实验小鼠的死亡率通常所需的时间是45-60分钟，随?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Pad	Sunbeam	E12107-819	Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine	Vasco	UCAP 0001-0000171	Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone	Parkland Scientific	ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge	Parkland Scientific	80000, 80120
Induction Chamber	Surgivet	V711802
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10	Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper	Oster	Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment	Webster	8804604
Buprenorphine	McKesson	562766	Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl)	Pfizer	NADA 45-290	Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips	Puritan medical products	806-WC	Autoclave before use
Betadine	Purdue Products	67618-150-17	10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution	Aspen	46066-807-60	Adjust to room temperature before use
IR rodent thermometer	BIOSEB	BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70 g	Roboz Surgical	RS5424, RS5435	Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40 g	Roboz Surgical	RS6472	Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps	World Precision Instruments	14189	Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin	Thermo Scientific	14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm	Cell Point Scientific	201-1000
Autoclip applier	Beckton Dickinson	427630
Byopsy foam pad	Simport	M476-1
Tissue cassette	Fisher Healthcare	15182701A	Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin	Fisher Scientific	245-684
Surgical iris scissors	World Precision Instruments	501263-G SC	Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors	World Precision Instruments	501219-G	Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps	Roboz Surgical	RS-5228, RS-8122	Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg	Sigma	2106
Reflex wound clip removing forceps	Roboz Surgical	RS-9263	Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile	Coviden	1050
Fisherbrand transfer pipets	Fischer Scientific	13-711-5AM	Use pipets to dropwise add saline