LC-MS تحليل الصفائح الدموية البشرية باعتبارها منصة لدراسة الميتوكوندريا الأيض

Summary

نحن هنا تظهر الصفائح الدموية البشرية معزولة يمكن استخدامها بوصفها الوصول فيفو السابقين نموذج لدراسة التعديلات التمثيل الغذائي ردا على مجمع أنا المانع روتينون. هذا النهج يعمل تتبع النظائر وتقدير نسبي من قبل السائل الطيف اللوني الشامل ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من التصاميم الدراسة.

Abstract

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Introduction

وقد تورط استقلاب الميتوكوندريا المختلة وظيفيا في مجموعة واسعة من الأمراض بما فيها التنكس العصبي، والسرطان، وأمراض القلب والأوعية الدموية ^30. على هذا النحو، وقد انصب جهد كبير على تميز عيوب التمثيل الغذائي التي تسهم في التسبب بالمرض. يعتبر السائل اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS) المعيار الذهبي لتقدير حجم التحاليل من مصفوفات بيولوجية معقدة، وغالبا ما تستخدم للدراسات التمثيل الغذائي ^8. لكن، وكما هو الحال مع الدراسات الطبية الحيوية، وتحقيق نموذج للوصول واضحة المعالم ذات الصلة إلى الأمراض التي تصيب البشر في كثير من الأحيان هو التحدي.

العديد من الدراسات توظف تحويل نماذج الخلوية لبحث تأثير الاكسيوبيوتك أو خلل وراثي في استقلاب الخلايا ^7،9. إعادة برمجة التمثيل الغذائي الذي يحدث في الخلايا السرطانية يمكن أن يعرض الخلط عوامل ^21، وبالتالي ليست مثالية. ويمكن لهذه القضايا أن يكون circumvented مع نماذج الخلية الأولية، على الرغم من أن الحصول على الكتلة الحيوية ما يكفي لتحليل التمثيل الغذائي يمكن أن يكون تحديا. وعلاوة على ذلك، تم تسليط الضوء على تأثير كميات عالية من المضادات الحيوية المستخدمة في الثقافة باعتبارها دراسات الميتوكوندريا يحتمل الخلط ^16.

الصفائح الدموية البشرية تحمل الفرصة للاستفادة من نموذج الخلية الأولية مع محتوى الميتوكوندريا كافية للدراسات التمثيل الغذائي ^{5،22،27،32.} أولا، الصفائح الدموية ويمكن الحصول عليها بسهولة، من خلال توجه الدم من المتبرعين الفردية، أو بكميات كبيرة من بنوك الدم، وبالتالي تقدم نموذجا في العوامل الخارجية التي يمكن السيطرة عليها بسهولة. ثانيا، نظرا لصغر حجمها، والصفائح الدموية يمكن عزلها من مكونات الدم الأخرى مع العمل التحضيري الحد الأدنى في مختبرات مجهزة حتى الحد الأدنى ^5. وتجدر الإشارة، الصفائح الدموية لا تحتوي على نواة، وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة تعديلات على عملية التمثيل الغذائي بشكل مستقل من تنظيم النسخي. نحن هنا تبين أنبالإضافة إلى تقدير النسبي (لجنة الزراعة) ثيو إستر أسيل-أنزيم، ونظام الصفائح الدموية معزولة يمكن استخدامها لدراسة التمثيل الغذائي الكربون. على وجه التحديد، ونحن التقرير استخدام العلامات الأيض مع النظائر المستقرة (غير المشعة) المسمى ^[13 C _6] -glucose ^و[13 C _16] -palmitate للتحقيق إدماج ^[13 C] -label في acetyl- الأيض مهم لجنة الزراعة عن طريق تحلل أو أكسدة الأحماض الدهنية. وهذا يوفر منصة قوية، للتعميم، وتنوعا نظرا لمشاركة واسعة من الأنواع أسيل، لجنة الزراعة في المسارات البيوكيميائية ^13،24 وقابلية الإستطراق من هذا النظام لاختبار المتغيرات الأخرى، مثل تثبيط أنا معقدة مع روتينون ^3،33. بالإضافة إلى المعلومات المنصوص عليها في البروتوكول أدناه، وصفا واسعة من الأساليب المستخدمة لوضع العلامات النظائر والتحليلات تستند LC-MS-يمكن العثور عليها في باسو وبلير ^4.

Protocol

أخلاقيات الإعلان: جميع البروتوكولات المتعلقة بمعاملة العينات البشرية اتباع المبادئ التوجيهية من جامعة بنسلفانيا جنة أخلاقيات البحوث البشرية.

1. إعداد المخازن و100X الحلول المالية

1. إعداد 1 لتر من العازلة قاعدة تايرود. الجمع بين 8.123 غرام كلوريد الصوديوم، 1.428 غرام NaHCO _3، 0،466 جم CaCl ₂ ∙ 2 H ₂ O، 0.224 غرام بوكل، و0.095 ز MgCl _2. ضبط الحجم الإجمالي إلى 1 لتر مع DDH ₂ O. فلتر تعقيم العازلة قاعدة تايرود.
2. إعداد الحلول الأسهم 100X من الجلوكوز وحمض البالمتيك. ل100X الحلول الأسهم الجلوكوز، حل 100 ملغ جلوكوز أو ^[13 C _6] -glucose في 1 مل من ده ₂ O. عن حلول بالميتات 100X، ويحل 2.56 ملغ من حمض البالمتيك أو 2.72 ملغ من ^[13 C _16] حامض -palmitic في 1 مل من الايثانول. فلتر تعقيم 100X الحلول الأسهم.
3. إعداد المخازن المناسبة المخصب تايرود
   1. لدراسات عدم وضع العلامات، إضافة 1 مل من 100X حل الأسهم الجلوكوز و 1 مل من 100X البالمتيك المحلول حامض الى 98 مل من العازلة قاعدة تايرود.
   2. للدراسات العلامات الجلوكوز، إضافة 1 مل من 100X ^[13 C _6] حل الأسهم -glucose و 1 مل من 100X البالمتيك المحلول حامض الى 98 مل من العازلة قاعدة تايرود.
   3. للدراسات حمض البالمتيك وصفها، إضافة 1 مل من 100X الجلوكوز حل سهم و 1 مل من ^[13 C _16] -palmitic المحلول حامض الى 98 مل من العازلة قاعدة تايرود.
4. إعداد حلول لعلاج روتنون
   1. إعداد ملي حل الأسهم 10 من روتينون في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]).
   2. للدراسات الجرعة والاستجابة غير وسم، انتقل إلى 1.4.3. لدراسات وضع العلامات في جرعة واحدة، انتقل إلى 1.4.5.
   3. إجراء التخفيف المتسلسل للسهم روتينون 10 ملم في DMSO للحصول على حلول مع تركيزات روتينون تتراوح ما بين 1 نانومتر إلى 100 ميكرومتر. هذه هي 100X الأسهمالصورة.
   4. إضافة 50 ميكرولتر من كل الأسهم إلى 5 مل من العازلة قاعدة تايرود + الجلوكوز + حمض البالمتيك من 1.3.1 لإعداد حلول مع تركيزات روتينون بدءا من 22:00 إلى 1 ميكرومتر. بدلا من ذلك، إضافة 50 ميكرولتر من DMSO لتكون بمثابة السيطرة على السيارة. المضي قدما إلى 2.1.
   5. تمييع 10 ملي حل الأسهم 1000 أضعاف في DMSO للحصول على حل العمل 10 ميكرومتر.
   6. إضافة 50 ميكرولتر من هذه الأسهم إلى 5 مل كل من العازلة قاعدة تايرود + ^[13 C _6] -glucose + حمض البالمتيك من 1.3.2 وقاعدة عازلة تايرود + الجلوكوز + ^[13 C _16] حامض -palmitic من 1.3.3. التركيز النهائي هو 100 نانومتر روتينون. بدلا من ذلك، إضافة 50 ميكرولتر من DMSO لكل عازلة لتكون بمثابة الضوابط السيارة.

2. صفائح الدم العزلة

ملاحظة: هذه الطريقة غير قابلة للالصفائح الدموية المستمدة إما من الدم الكامل أو من أكياس الصفائح الدموية. تم إعداد البيانات الواردة سبيل المثالباستخدام الصفائح الدموية المستمدة من أكياس الصفائح الدموية. يرجى الاطلاع باسو وآخرون. ⁽⁵⁾ لمزيد من التفاصيل حول استخدام الصفائح المعزولة من الدم الكامل.

1. عزل الصفائح الدموية من الدم الكامل
   ملاحظة: إذا عزل الصفائح الدموية من كيس من الصفائح الدموية، انتقل إلى 2.2.1.
   1. الطرد المركزي الدم كله في 175 ز س لمدة 15 دقيقة مع عدم وجود فرامل.
   2. نقل 1 مل من البلازما الغنية بالصفائح الدموية العلوي (PRP) طبقة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
   3. الطرد المركزي PRP في 400 ز س لمدة 5 دقائق.
   4. نضح طاف وانتقل إلى الخطوة 3.1 أو 3.2.
2. عزل الصفائح الدموية من حقيبة صفائح الدم
   1. نقل 1 مل من تعليق الصفائح الدموية إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
   2. الطرد المركزي تعليق في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
   3. نضح طاف وانتقل إلى الخطوة 3.1. أو 3.2.

3. إجراء تقييم للتجربة

1. لتحديد تأثير أجنبي بيولوجياالعلاج (على سبيل المثال، روتينون) على مستويات التمثيل الأيضي من الفائدة (على سبيل المثال، أسيتيل التميم)، انتقل إلى 3.1.1. لتحديد تأثير أجنبي بيولوجيا (على سبيل المثال، روتينون) على إدماج تمهيدا الأيض في المستقلب المصب من الفائدة، والمضي قدما إلى 3.2.1.
   1. لا تستخدم أي مكررات البيولوجية أقل من ثلاثة لكل حالة، و resuspend الصفائح الدموية بيليه من الخطوة 2.1.4 أو 2.2.3 في 1 مل من كل حل من خطوة 1.4.4.
   2. احتضان الصفائح الدموية معلق في CO ₂ حاضنة تغلف المياه المقرر أن الرطوبة 95٪، 5٪ CO ₂ و 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. انتقل إلى الخطوة 4.1
      ملاحظة: نحن هنا وصف تجربة الاستجابة للجرعة. بدلا من ذلك، يمكن أن يتم دورة التجربة المرة التي تم فيها تثبيت الجرعة وتفاوتت مدة الحضانة بدلا من ذلك.
2. لتحديد تأثير العلاج أجنبي بيولوجيا على إدماج تمهيدا الأيض في المستقلب المصب من الفائدة.
   1. Uالغناء ما لا يقل عن ثلاثة مكررات البيولوجية لكل حالة، و resuspend الصفائح الدموية بيليه من الخطوة 2.1.4 أو 2.2.3 في 1ml من كل صياغة عازلة تايرود المسمى من الخطوة 1.4.6.
   2. احتضان الصفائح الدموية معلق في CO ₂ حاضنة تغلف المياه المقرر أن الرطوبة 95٪، 5٪ CO ₂ و 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. انتقل إلى الخطوة 4.1.

4. تسقيه والتميم استخراج

1. بيليه الصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 3 دقائق.
2. نضح طاف.
3. الصفائح الدموية resuspend في 750 ميكرولتر الجليد الباردة حمض الخليك ثلاثي الكلور 10٪ (ث / ت).
4. إضافة مستقر معيار داخلي مناسب المسمى النظير. على سبيل المثال، إذا كان الهدف هو مقارنة مستويات الأنواع جنة الزراعة عبر عينات، استخدم 100 ميكرولتر من خليط من المستقر النظائر المسمى ثيو إستر لجنة الزراعة تم الحصول عليها من الخميرة كما هو موضح سابقا (SILEC تقنية) ^29.
5. نبض يصوتن كل عينة 30 مرات مع نبضات 0.5 ثانية.
6. عينات الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
7. يلصق C18 الصلبة مرحلة الاستخراج (SPE) أعمدة لمشعب فراغ.
8. حالة الأعمدة مع الميثانول 1 مل.
9. تتوازن الأعمدة مع 1 مل ده ₂ O.
10. تشغيل المستمدة من عينة طاف (حوالي 850 ميكرولتر في هذه الحالة) من خلال الأعمدة.
11. غسل الأعمدة مع الماء 1 مل.
12. تحميل 10 مل أنابيب زجاجية أجهزة الطرد المركزي في مشعب فراغ لجمع شطف الكسر.
13. أزل الأعمدة مع 1 مل من خلات الأمونيوم 25 مم في الميثانول.
14. شطافة الجافة تحت غاز النيتروجين.
15. و resuspend بقايا المجففة في 50 ميكرولتر 5٪ (ث / ت) وحامض 5 السلفوساليسيليك ونقل إلى قارورة HPLC.

الإعداد 5. HPLC

1. باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة لنظام HPLC، إنشاء أسلوب مع الظروف HPLC الأمثل لالتحاليل المستهدفة والعمود المستخدمة، كما هو موضح في الجدول رقم 1.
   ملاحظة: temperat العمودكان لدى عودتهم المستخدمة لتوليد هذه البيانات 25 درجة مئوية ولكن سوف تختلف معايير محددة من قبل الصك وفيما يتعلق المركبات من الفائدة. لأسيل، لجنة الزراعة الكميات، تم الإبلاغ عن أساليب متعددة للتحليل LC-MS، والتحقق من صحتها عن التحاليل المختلفة في مختلف الظروف LC ^14،19،20.
2. السماح للHPLC لكي تتوازن على نحو كاف.
   ملاحظة: يجب أن تشمل كلا من فتيلة من المذيبات قبل ربط العمود وموازنة العمود في الظروف المذيبات انطلاق لهذه الطريقة. حجم موازنة يجب أن يتبعوا إرشادات الشركة المصنعة، ويجب أن يتم تحويل الناتجة النفايات السائلة للنفايات.
   ملاحظة: استشر باسو وبلير ⁽⁵⁾ لمزيد من التفاصيل حول إعدادات HPLC.

الإعداد 6. مطياف الكتلة

1. باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة لمطياف الكتلة، إنشاء أسلوب المستهدفة للكشف عن أشكال المتأينة من المركبات ذات الأهمية. وتعرض المعلماتفي الجدول 2.
   ملاحظة: يجب أن تستخدم نظائرها النظائر المستقرة لهذه المركبات لتحديد ما إذا كان وضع إيجابي أو سلبي يعطي حساسية فائقة ولتحسين المصدر وحالة البصريات للكشف عنها. الوقت الكشف الكامل للطريقة مطياف الكتلة يجب أن تتوافق مع المكون وقت طريقة HPLC المرتبطة بها.
   ملاحظة: كما ذكر سابقا، وقد تم الإبلاغ عن أساليب متعددة للتحليل أسيل، لجنة الزراعة، بما في ذلك الإيجابية والسلبية ¹⁴ التأين ¹⁵ وسائط واستخدام دقة عالية مطياف الكتلة ¹⁷ بدلا من أداة الثلاثي رباعية ^28.
2. نظيفة ومعايرة الصك، ووضع رذاذ مستقرة في مطياف، وإتاحة الوقت من أجل حل المعايرة لتبديد كاف من المصدر والبصريات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
3. إنشاء تسلسل لجميع العينات مع برنامج حاسوبي لمراقبة مطياف الكتلة. Incluإزالة اسم أو معرفات رقمية، وبيان حجم الحقن وأداة الطريقة المناسبة. تشغيل فارغة قبل العينة الأولى، وتشغيل الفراغات ويغسل أخرى بين العينات حسب الحاجة لتخفيف المرحل أو مصفوفة الآثار.
   ملاحظة: طريقة معالجة لذروة التكامل من الاستشرابية السائل التحاليل المختارة كثير من الأحيان يمكن أن تحدد ضمن هذا التسلسل أو تطبيقها في معالجة البيانات في وقت لاحق.
4. بدء تسلسل ومراقبة الطيف وHPLC النظام الشامل بشكل دوري لمشكلات، منها تقلبات الضغط أو فشل النظام وفقدان كثافة إشارة أثناء التشغيل.
   ملاحظة: مشاكل حادة أو الفشل المدى المستمرة قد تتطلب وقف تشغيل وتطهير وإعادة توازنه النظام HPLC وكذلك تنظيف ومعايرة مطياف الكتلة. استشارة باسو وبلير ⁵ لمزيد من التفاصيل بشأن MS إعدادات ومعالجة البيانات.

النتائج

لإثبات فائدة هذه المنهجية قمنا مستنسخة إمكانية تعميم سبق وصفها التكيف الأيضي التعويضية الناجمة عن التعرض لروتينون. وقد تم تحديد هذه النتيجة سابقا في نماذج ثقافة الخلية ويهدف هذا التحقيق لاختبار إذا حدث هذا التحول الأيضي أيضا في الصفائح الدموية...

Discussion

هنا أثبتنا فائدة الصفائح المعزولة كمنصة لدراسة مضطرب استقلاب الميتوكوندريا. على وجه التحديد، فقد تميزت التكيف الأيضي ردا على تثبيط أنا معقدة من روتينون.

وسعت الدراسة النتائج ذكرت سابقا حول دور تثبيط أنا معقدة من روتينون في خطوط ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	746398
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O)	Sigma-Aldrich	223506
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	208337
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
13C6-Glucose	Sigma-Aldrich	389374
Palmitic acid	Cayman	10006627
13C16-Palmitic Acid	Sigma-Aldrich	605573
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Trichloro Acetic Acid	Sigma-Aldrich	T6399
5-Sulfosalicylic Acid	Sigma-Aldrich	390275
Acetonitirle	Fischer Scientific	A996-4	(optima)
Water (H2O)	Fischer Scientific	W7-4	(optima)
Formic acid	Fischer Scientific	85171	(optima)
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301
Ethanol	Fischer Scientific	04-355-222
Methanol	Fischer Scientific	A454-4	(optima)
Ammonium Acetate	Fischer Scientific	A639-500
2 ml Eppendorf Tubes	BioExpress	C-3229-1
LC vials (plastic)	Waters	186002640
10 ml Glass Centrifuge Tubes	Kimble Chase	73785-10
Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns	Waters	WAT094225
Pastuer Pipets	Fischer Scientific	13-678-200
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
CO2 Water-Jacketed Incubator	Nuaire	AutoFlow NU-8500
Triple Quadropole Mass Spectrometer	Thermo Scientific	Finnigan TSQ Quantum
HPLC	Thermo Scientific	Dionex Ultimate 3000
Source	Thermo Scientific	HESI II
HPLC Column	Phenomenex	Luna C18	3 μm particle size, 200 mm x 2 mm