LC-MS El análisis de las plaquetas humanas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial

Resumen

Aquí mostramos plaquetas humanas aisladas se pueden utilizar como un accesible ex vivo modelo para estudiar adaptaciones metabólicas en respuesta al complejo I inhibidor de la rotenona. Este enfoque emplea trazado isotópico y la cuantificación relativa mediante espectrometría de cromatografía de masa líquida y se puede aplicar a una variedad de diseños de estudio.

Resumen

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Introducción

Metabolismo mitocondrial disfuncional se ha implicado en una amplia gama de enfermedades, incluyendo neurodegeneración, el cáncer y la enfermedad cardiovascular ^30. Como tal, un gran esfuerzo se ha colocado en la caracterización de defectos metabólicos que contribuyen a la patogénesis de la enfermedad. Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS / MS) se considera el estándar de oro para la cuantificación de analitos de matrices biológicas complejas y con frecuencia se emplea para estudios metabólicos ^8. Sin embargo, como es a menudo el caso con los estudios biomédicos, la consecución de un modelo accesible y bien definida correspondiente a la enfermedad humana es un desafío.

Muchos estudios emplean modelos celulares transformadas para sondear el impacto de xenobióticos o anomalías genéticas en el metabolismo celular ^7,9. La reprogramación metabólica que se produce en las células cancerosas pueden introducir factores de confusión ²¹ y por lo tanto no son ideales. Estos problemas pueden ser circumvented con modelos celulares primarios, aunque la obtención de biomasa suficiente para los análisis metabólicos puede ser un reto. Por otra parte, el impacto de altas cantidades de antibióticos que se utilizan en la cultura se ha destacado como estudios mitocondriales ¹⁶ de confusión potenciales.

Las plaquetas humanas ofrecen la oportunidad de utilizar un modelo celular primario con suficiente contenido mitocondrial para estudios metabólicos ^5,22,27,32. En primer lugar, las plaquetas se pueden adquirir fácilmente, a través de la extracción de sangre de donantes individuales, o en grandes volúmenes de bancos de sangre, y por lo tanto proporcionar un modelo en el que factores externos pueden ser controlados fácilmente. En segundo lugar, debido a su pequeño tamaño, las plaquetas pueden ser fácilmente aislados de otros componentes de la sangre con un mínimo de trabajos de preparación en laboratorios incluso mínimamente equipados ^5. Es de destacar que las plaquetas no contienen núcleos y por lo tanto se pueden utilizar para estudiar alteraciones en el metabolismo de manera independiente de la regulación transcripcional. Aquí nos muestran queAdemás de la cuantificación relativa de tioésteres de acil-coenzima A (CoA), el sistema de plaquetas aislado se puede utilizar para examinar el metabolismo del carbono. En concreto, el informe de uso de marcaje metabólico con isótopo estable (no radiactivo) marcado con ^[13 C _6] -glucosa y ^[13 C _16] palmitato para sondear la incorporación de ^[13C] -label en el metabolito importante acetil- CoA a través de la glicólisis o de la oxidación de ácidos grasos. Esto proporciona una plataforma de gran alcance, generalizable, y versátil debido a la amplia participación de especies acil-CoA reductasa en las vías bioquímicas ^13,24 y la tratabilidad de este sistema para probar otras variables, tales como la inhibición del complejo I con rotenona ^3,33. Además de la información proporcionada en el Protocolo a continuación, una descripción detallada de los métodos utilizados para el etiquetado de isótopos y para los análisis basados ​​en CL-EM se puede encontrar en Basu y Blair ^4.

Protocolo

Ética Declaración: Todos los protocolos relativos al tratamiento de muestras humanas siguen las directrices de la Universidad de Pennsylvania comité de ética de investigación humana.

1. Preparación de tampones y 100x Soluciones madre

1. Preparar 1 L de tampón de base de Tyrode. Combinar 8.123 g de NaCl, 1,428 g _{de NaHCO3,} 0,466 g _{de CaCl2} ∙ 2 _H2O, 0,224 g de KCl, y 0,095 g de MgCl _2. Ajustar el volumen total de 1 litro con _ddH2O Esterilizar por filtración búfer base de Tyrode.
2. Preparar soluciones madre 100x de la glucosa y el ácido palmítico. Para 100x soluciones madre de glucosa, se disuelven 100 mg de glucosa o ^[13 C _6] -glucosa en 1 ml de ddH ₂ O. Para soluciones palmitato de 100x, se disuelven 2,56 mg de ácido palmítico o 2,72 mg de ácido -palmitic ^[13 C _16] en 1 ml de etanol. Esterilizar por filtración 100x soluciones madre.
3. Los tampones de preparar apropiado Enriquecido Tyrode
   1. Para los estudios no etiquetado, añadir 1 ml de solución de glucosa 100x y 100x 1 ml de solución madre de ácido palmítico a 98 ml de tampón de base de Tyrode.
   2. Para los estudios de etiquetado de glucosa, añadir 1 ml de 100x ^[13 C _6] solución madre-glucosa y 1 ml de solución madre de ácido 100x palmítico a 98 ml de tampón de base de Tyrode.
   3. Para los estudios de etiquetado ácido palmítico, añadir 1 ml de solución madre 100x glucosa y 1 ml de ^[13 C _16] solución madre de ácido -palmitic a 98 ml de tampón de base de Tyrode.
4. Preparar soluciones para el tratamiento rotenona
   1. Preparar una solución de 10 mM social de rotenona en dimetilsulfóxido (DMSO).
   2. Para los estudios de dosis-respuesta no etiquetado, proceder a 1.4.3. Para los estudios de etiquetado en una sola dosis, continúe con el 1.4.5.
   3. Realizar una dilución en serie de la rotenona de stock 10 mM en DMSO para obtener soluciones con concentraciones de rotenona que van de 1 nM a 100 mM. Estos son 100x socials.
   4. Añadir 50 l de cada población a 5 ml de tampón de base de Tyrode + glucosa + ácido palmítico de 1.3.1 para preparar soluciones con concentraciones de rotenona que varían de 10 pM a 1 mM. Alternativamente, se añaden 50 l de DMSO para servir como un control del vehículo. Proceder a 2,1.
   5. Diluir la solución madre 10 mM 1.000 veces en DMSO para obtener una solución de trabajo de 10 micras.
   6. Añadir 50 l de esta población a 5 ml cada una de búfer base de Tyrode + ^[13 C _6] -glucosa + ácido palmítico de 1.3.2 y la base de tampón + glucosa + ^[13 C _16] ácido -palmitic de 1.3.3 de Tyrode. La concentración final es 100 nM rotenona. Alternativamente, se añaden 50 l de DMSO a cada memoria intermedia para servir como controles del vehículo.

2. Aislamiento de plaquetas

Nota: Este método es susceptible de plaquetas derivadas de todo, ya sea de sangre o de bolsas de plaquetas. Los datos de ejemplo contenidas en este documento se preparóel uso de las plaquetas derivadas de bolsas de plaquetas. Por favor, véase Basu et al. ⁵ para más detalles sobre el uso de las plaquetas aisladas de la sangre entera.

1. El aislamiento de plaquetas partir de sangre total
   NOTA: Si el aislamiento de las plaquetas de una bolsa de plaquetas, proceder a 2.2.1.
   1. Centrifugar la sangre entera a 175 x g durante 15 min sin frenos.
   2. Se transfiere 1 ml de la parte superior de plasma rico en plaquetas (PRP) capa a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   3. Centrifugar el PRP a 400 x g durante 5 min.
   4. Aspirar el sobrenadante y proceda al paso 3.1 o 3.2.
2. El aislamiento de plaquetas a partir de una bolsa de plaquetas
   1. Transferir 1 ml de la suspensión de plaquetas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   2. Centrifugar la suspensión a 400 xg durante 5 min.
   3. Aspirar el sobrenadante y proceda al paso 3.1. o 3.2.

3. Realización de un experimento

1. Para determinar el efecto de xenobióticostratamiento (por ejemplo, la rotenona) en los niveles de un metabolito de interés (por ejemplo, acetil-CoA), proceda a 3.1.1. Para determinar el efecto de un xenobiótico (por ejemplo., Rotenona) en la incorporación de un precursor metabólico en un metabolito aguas abajo de interés, proceder a 3.2.1.
   1. El uso de no menos de tres repeticiones biológica para cada condición, resuspender sedimento de plaquetas de la etapa 2.1.4 o 2.2.3 en 1 ml de cada solución de la etapa 1.4.4.
   2. Se incuban las plaquetas se resuspendieron en un incubador de _CO2 con camisa de agua ajustado a 95% de humedad, 5% de _CO2 y 37 ° C durante 1 hora. Continúe con el paso 4.1
      Nota: Aquí se describe un experimento de respuesta a la dosis. Alternativamente, un experimento de transcurso de tiempo se podría hacer en el que la dosis se fijó y la duración de la incubación se varió en su lugar.
2. Para determinar el efecto del tratamiento de xenobióticos en la incorporación de un precursor metabólico en un metabolito aguas abajo de interés.
   1. Tcantar no menos de tres repeticiones biológica para cada condición, volver a suspender sedimento de plaquetas de la etapa 2.1.4 o 2.2.3 en 1 ml de cada formulación de tampón de Tyrode marcado desde el paso 1.4.6.
   2. Se incuban las plaquetas se resuspendieron en un incubador de _CO2 con camisa de agua ajustado a 95% de humedad, 5% de _CO2 y 37 ° C durante 1 hora. Continúe en el paso 4.1.

4. La extinción y extracción CoA

1. Se precipitan las plaquetas por centrifugación a 3000 xg durante 3 min.
2. Aspirar el sobrenadante.
3. Volver a suspender las plaquetas en 750 l de hielo ácido tricloroacético al 10% frío (w / v).
4. Añadir estándar interno marcado isotópicamente estable apropiado. Por ejemplo, si el objetivo es comparar los niveles de especies CoA a través de muestras, utilice 100 l de una mezcla de isótopos estables tioésteres CoA marcados obtenidos a partir de la levadura como se describe anteriormente (técnica SILEC) ^29.
5. Pulse-sonicado cada muestra 30 veces con pulsos de 0,5 seg.
6. Centrifugar las muestras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
7. Colocar las columnas de extracción en fase sólida C18 (SPE) para colector de vacío.
8. Acondicionar las columnas con metanol 1 ml.
9. Equilibrar las columnas con 1 ml de _ddH2O
10. Ejecutar sobrenadante derivado de muestra (aproximadamente 850 l en este caso) a través de las columnas.
11. Se lavan las columnas con 1 ml de agua.
12. Cargar 10 ml tubos de centrífuga de vidrio en el colector de vacío para recoger la fracción de elución.
13. Eluir las columnas con 1 ml de acetato de amonio 25 mM en metanol.
14. eluato seca bajo gas nitrógeno.
15. Resuspender residuos secos en 50 l 5% (w / v) de ácido 5-sulfosalicílico y transferir a viales de HPLC.

5. Configuración de HPLC

1. Usando el software de control para el sistema de HPLC, crear un método con condiciones de HPLC optimizados para los analitos objetivo y la columna utilizada, tal como aparece en la Tabla 1.
   Nota: La columna de temperature utilizado para la generación de estos datos fue 25 ° C, pero los parámetros específicos variará según el instrumento y con respecto a los compuestos de interés. Para acil-CoA cuantificación, se ha informado de varios métodos de análisis LC-MS, y validado para diferentes analitos en diferentes condiciones de LC ^14,19,20.
2. Deje que la HPLC se equilibre adecuadamente.
   Nota: Este debe incluir tanto el cebado de disolventes antes de conectar una columna y equilibrado de la columna en las condiciones de disolvente de partida para el método. El volumen de equilibrio debe seguir las instrucciones del fabricante, y el efluente resultante debe ser desviado a perder.
   Nota: Consulte a Basu y Blair ⁵ para más detalles sobre la configuración de HPLC.

6. Configuración del Espectrómetro de Masas

1. Usando el software de control para el espectrómetro de masas, crear un método objetivo para la detección de formas ionizadas de los compuestos de interés. Parámetros se presentanen la Tabla 2.
   Nota: análogos de isótopos estables de estos compuestos deben ser utilizados para determinar si un modo positivo o negativo da una sensibilidad superior y para optimizar la fuente y la condición óptica para su detección. El tiempo de detección total del método espectrómetro de masas debe corresponder a la componente de tiempo del método de HPLC asociado.
   Nota: Como se ha mencionado anteriormente, se han descrito varios métodos de análisis de acil-CoA, incluyendo positivas ¹⁴ y negativos de ionización ¹⁵ modos y el uso de un espectrómetro de masas de alta resolución ¹⁷ en lugar de un instrumento de triple cuadrupolo ^28.
2. Limpiar y calibrar el instrumento, establecer una pulverización estable en el espectrómetro, y dar tiempo a la solución de calibración para disipar adecuadamente de la fuente y la óptica de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Configurar una secuencia para todas las muestras con el software de control espectrómetro de masas. includes el nombre o identificadores numéricos e indicar el método de volumen de inyección y el instrumento apropiado. Prepare un blanco antes de la primera muestra, y ejecutar otros espacios en blanco y lavados entre las muestras según sea necesario para mitigar los efectos de matriz o de arrastre.
   Nota: Un método de tratamiento para la integración de los picos de los cromatogramas líquidos analitos seleccionados 'a menudo se puede ajustar dentro de esta secuencia o posteriormente aplicado en el procesamiento de datos.
4. Comience la secuencia y supervisar el sistema de espectrómetro de masas y HPLC periódicamente de problemas, incluyendo fluctuaciones de presión o fallos del sistema y la pérdida de intensidad de la señal durante la carrera.
   Nota: Los problemas severos o fallos de ejecución persistentes pueden requerir detener la carrera y las purgas y volver a equilibrar el sistema HPLC, así como la limpieza y calibración del espectrómetro de masas. Consultar Basu y Blair ⁵ para más detalles sobre la configuración y el procesamiento de datos MS.

Resultados

Para demostrar la utilidad de esta metodología hemos reproducido la generalización de la adaptación metabólica compensatoria se ha descrito previamente como resultado de la exposición a la rotenona. Este hallazgo fue identificado previamente en modelos de cultivo celular y esta investigación tenía por objeto poner a prueba si este cambio metabólico también se produce en las plaquetas, que son anuclear y no es propenso a los mismos artefactos experimentales como cultivo celular. ...

Discusión

Aquí hemos demostrado la utilidad de plaquetas aisladas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial perturbado. En concreto, hemos caracterizado adaptación metabólica en respuesta a la inhibición del complejo I de la rotenona.

El presente estudio se ha extendido hallazgos presentados con anterioridad sobre el papel de la inhibición del complejo I de la rotenona en líneas celulares a las plaquetas humanas. Es importante destacar que esto se ha puesto de manifiesto q...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	746398
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O)	Sigma-Aldrich	223506
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	208337
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
13C6-Glucose	Sigma-Aldrich	389374
Palmitic acid	Cayman	10006627
13C16-Palmitic Acid	Sigma-Aldrich	605573
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Trichloro Acetic Acid	Sigma-Aldrich	T6399
5-Sulfosalicylic Acid	Sigma-Aldrich	390275
Acetonitirle	Fischer Scientific	A996-4	(optima)
Water (H2O)	Fischer Scientific	W7-4	(optima)
Formic acid	Fischer Scientific	85171	(optima)
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301
Ethanol	Fischer Scientific	04-355-222
Methanol	Fischer Scientific	A454-4	(optima)
Ammonium Acetate	Fischer Scientific	A639-500
2 ml Eppendorf Tubes	BioExpress	C-3229-1
LC vials (plastic)	Waters	186002640
10 ml Glass Centrifuge Tubes	Kimble Chase	73785-10
Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns	Waters	WAT094225
Pastuer Pipets	Fischer Scientific	13-678-200
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
CO2 Water-Jacketed Incubator	Nuaire	AutoFlow NU-8500
Triple Quadropole Mass Spectrometer	Thermo Scientific	Finnigan TSQ Quantum
HPLC	Thermo Scientific	Dionex Ultimate 3000
Source	Thermo Scientific	HESI II
HPLC Column	Phenomenex	Luna C18	3 μm particle size, 200 mm x 2 mm