미토콘드리아 대사 유학을위한 플랫폼으로 인간 혈소판의 LC-MS 분석

요약

여기에서 우리는 고립 된 인간의 혈소판 내가 로테를 억제제 복잡한에 대한 응답으로 신진 대사 적응을 연구하는 생체 접근으로 모델을 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 이 방법은 액체 크로마토 그래피 질량 분석에 의해 추적 동위 상대적 정량을 채용하고 연구 다양한 디자인을 적용 할 수있다.

초록

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

서문

역기능 미토콘드리아 대사는 신경 변성, 암, 심혈관 질환 ^(30)을 포함하여 다양한 질환에 연루되어왔다. 따라서, 많은 노력이 질병의 발병에 기여하는 대사 결함을 특성화에 배치되었습니다. 액체 크로마토 그래피 - 탠덤 질량 분석 (LC-MS / MS)는 복잡한 생물학적 매트릭스에서 분석의 정량화를위한 ​​황금 표준으로 간주되며 종종 대사 연구 ⁸ 사용된다. 종종 인간의 질병과 관련이 접근하고 잘 정의 된 모델을 달성 생물 의학 연구의 경우입니다 그러나, 도전이다.

많은 연구는 세포 대사 ^7,9에 생체 이물질 또는 유전 적 이상의 영향을 프로빙을위한 세포 모델을 변형 사용한다. 혼란을 도입 할 수 암 세포에서 발생하는 대사 재 프로그래밍 ⁽²¹⁾ 요인 때문에 적합하지 않습니다. 이러한 문제는 circumve 될 수 있습니다대사 분석에 충분한 미생물을 얻는 것은 어려울 수 있지만, 일차 전지 모델 nted. 또한, 문화에 사용되는 항생제의 많은 양의 영향은 잠재적으로 혼란 미토콘드리아 연구 ^(16)과 같이 강조하고있다.

인간 혈소판 대사 연구 ^5,22,27,32 충분한 미토콘드리아 콘텐츠 일차 전지 모델을 이용할 수있는 기회를 제공. 혈액 공여자 개별 또는 혈액 은행에서 대량 흡입되므로 외부 요인 용이하게 제어 할 수있는 모델을 제공 내지 제 혈소판 쉽게 얻을 수있다. 둘째, 그들의 작은 크기 혈소판 용이에도 최소한 갖춘 실험실 ⁵ 최소 준비 작업과 다른 혈액 성분으로부터 분리 될 수있다. 참고로, 혈소판 핵을 포함하지 않는 때문에, 독립적으로 전사 조절 대사 변화를 연구하는 데 이용 될 수있다. 여기에 우리가 보여아실 - 조효소 A (COA) 티오 상대 정량 이외에 혈소판 격리 시스템은 탄​​소 대사를 검토 할 수있다. 특히, 우리는 중요한 대사 물질 아세틸으로 ^[(13) C] -label의 설립을 조사하기 위해 안정 동위 원소 (비 방사성) 표지 ^[13 C _6] 글루코스와 ^[13 C _16] -palmitate과 신진 대사 라벨의 사용을보고 CoA를 해당 작용 또는 지방산 산화를 통한. 이는 생화학 적 경로 ^13,24에서 아실 CoA를 종의 광범위한 참여와 같은 로테 ^3,33 복잡한 I의 억제와 같은 다른 변수를 테스트에이 시스템의 취급 용이성에 강력한 일반화하고, 다양한 플랫폼을 제공합니다. 아래의 프로토콜에서 제공하는 정보에 더하여, 동위 원소 표지하고 상기 LC-MS 기반 분석에 사용되는 방법의 광범위한 설명 바수 블레어 ^4에서 찾아 볼 수있다.

프로토콜

윤리 정책 : 인간의 샘플의 처리에 관한 모든 프로토콜은 대학의 펜실베니아의 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따르십시오.

버퍼의 1. 준비 및 100 배 스톡 솔루션

1. 기본 타이로드의 버퍼 1 L를 준비합니다. ₂ ∙ 2 H ₂ O, 0.224 g의 KCl, 및 0.095 g의의 MgCl _2. DDH ₂ O.과 1 L에 총 볼륨을 조정 8.123 g의 NaCl, 1.428 g의 _{수 NaHCO3,} 0.466 g의 염화칼슘을 결합 필터는 기본 타이로드의 버퍼를 소독.
2. 포도당과 팔 미트 산의 100 배 재고 솔루션을 준비합니다. 100 배 포도당 재고 솔루션의 경우, DDH ₂ O 1 ㎖에서 100 mg의 포도당 또는 ^[13 C _6] 글루코스 공수를 용해 100 배 팔미 테이트 솔루션의 경우, 팔 미트 산의 2.56 mg을 에탄올 1 ㎖에서 ^[13 C _16] -palmitic 산 2.72 mg의 용해. 필터 100X 원액 살균.
3. 적절한 농축 타이로드의 버퍼를 준비합니다
   1. 비 표지 연구의 경우, 1 100 배 포도당 주식 솔루션 ㎖의 기본 타이로드의 버퍼의 98 ml의에 100 배 팔 미트 산 원액 1ml를 추가합니다.
   2. 포도당 라벨 연구의 경우, 기본 타이로드의 버퍼의 98 ml의 100 배 팔 미트 산 원액 1 100 배 ^[13 C _6] 글루코스 공수 원액의 mL 및 1 ml에 추가 할 수 있습니다.
   3. 팔 미트 산 라벨 연구의 경우, 기본 타이로드의 버퍼의 98 ml를 1 ml의 ^[13 C _16] -palmitic 산 원액 ml의 포도당 원액 100 배의 1을 추가합니다.
4. 로테 처리를위한 솔루션을 준비
   1. 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 로테의 10 mM 스톡 용액을 준비한다.
   2. 비 표시 용량 - 반응 시험의 경우, 1.4.3를 진행합니다. 단일 용량에서 라벨 연구의 경우, 1.4.5를 진행합니다.
   3. 1 nM 내지 100 μM까지 로테 농도와 솔루션을 얻기 위해 DMSO에 10 밀리미터 로테 주식의 일련의 희석을 수행합니다. 이들은 100 배 재고 있습니다에스.
   4. 오후 10시 1 μM까지 로테 농도와 솔루션을 준비 1.3.1에서 기본 타이로드의 버퍼 + 포도당 + 팔 미트 산 5 ml의 각 주식의 50 μl를 추가합니다. 또한, 차량 제어 역할을 DMSO의 50 μl를 추가합니다. 2.1로 진행합니다.
   5. 10 μM 작업 용액을 얻었다 DMSO에 10 mM의 스톡 용액을 1000 배로 희석.
   6. 5 ml의 기본 타이로드의 버퍼 + 각이 주식의 50 μl를 추가합니다 ^[13 C _6] 글루코스 공수 + 팔 미트 산을 1.3.2에서베이스 타이로드의 버퍼 + 포도당 + ^[(13) C _(16)] 1.3.3에서 -palmitic 산. 최종 농도는 100 나노 로테이다. 또한, 차량 제어 역할을하는 각 버퍼에 DMSO의 50 μl를 추가합니다.

2. 혈소판 분리

참고 :이 방법은 하나 전혈이나 혈소판 가방에서 유래 혈소판 의무가 있습니다. 여기에 포함 된 예제 데이터를 제조 하였다혈소판 가방에서 파생 된 혈소판을 사용. 바수 등의 알을 참조하시기 바랍니다. ⁽⁵⁾ 전체 혈액에서 분리 된 혈소판을 사용에 대한 자세한 내용은.

1. 전체 혈액에서 혈소판 분리
   참고 : 혈소판의 가방에서 혈소판을 분리하는 경우, 2.2.1를 진행합니다.
   1. 없이 브레이크와 15 분 동안 175 x g에서 원심 분리기 전혈.
   2. 전송 상부 혈소판 풍부 혈장 1 ㎖ (PRP)을 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 층을 포함한다.
   3. 5 분 동안 400 × g으로의 PRP를 원심 분리기.
   4. 기음 뜨는 및 3.1 또는 3.2 단계로 진행합니다.
2. 혈소판 가방에서 혈소판 분리
   1. 전사 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 혈소판 현탁액 1 ㎖.
   2. 5 분 동안 400 XG에 현탁액을 원심 분리기.
   3. 기음 뜨는 및 3.1 단계로 진행합니다. 또는 3.2.

3. 실험 수행

1. 생체이의 효과를 결정하기 위해치료 (예를 들어, 로테) 관심의 대사 산물의 수준에 (예를 들어, 아세틸 -CoA), 3.1.1를 진행합니다. 관심의 하류 대사 산물로 대사 전구 물질의 혼입에 생체이 물 (예., 로테)의 효과를 확인하려면 3.2.1를 진행합니다.
   1. 각 조건에 대해 셋 정도의 생물학적 복제를 사용하지 않고, 단계 1.4.4에서 각 솔루션 1 ml의 단계 2.1.4 또는 2.2.3에서 혈소판 펠렛을 재현 탁.
   2. 95 % 습도, 5 % CO _2, 1 시간 동안 37 ℃로 설정된 물 재킷 CO ₂ 인큐베이터에 재현 탁 혈소판 부화. 4.1 단계로 진행
      참고 : 여기에 우리는 용량 반응 실험에 대해 설명합니다. 대안 적으로, 시간 경과 실험이 수행 될 수는있는 용량은 고정시키고 인큐베이션 길이 대신 변화시켰다.
2. 관심 하류 대사 산물로의 대사 전구체의 혼입에 생체이 치료의 효과를 결정한다.
   1. 유각 조건에 대한 세 가지 생물학적 복제보다 적은 노래하지, 단계 1.4.6에서 표시 타이로드의 버퍼의 각 제제의 1ml의 단계 2.1.4 또는 2.2.3에서 혈소판 펠렛을 재현 탁.
   2. 95 % 습도, 5 % CO _2, 1 시간 동안 37 ℃로 설정된 물 재킷 CO ₂ 인큐베이터에 재현 탁 혈소판 부화. 4.1 단계로 진행합니다.

4. 담금질 및 CoA를 추출

1. 3 분 동안 3,000 XG에 원심 분리하여 혈소판 펠렛.
2. 기음 뜨는.
3. 750 ㎕의 얼음 냉 10 % 트리클로로 아세트산에 재현 탁 혈소판 (W / V).
4. 적절한 안정 동위 원소 표지 내부 표준을 추가합니다. 예를 들어, 목표는 샘플을 가로 질러 아실 CoA의 종 수준과 비교 안정 동위체 앞에서 설명한대로 효모에서 얻은 표지 된 CoA 티오 에스테르 (SILEC 기술) ^(29)의 혼합물 100 μl를 사용하는 것이다.
5. 펄스 초음파 처리 각 시료를 0.5 초 펄스 30 번.
6. 4 ℃에서 10 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기 샘플.
7. 진공 매니 폴드 C18 고체상 추출 (SPE)를 부착 기둥.
8. 1 ml의 메탄올과 열을 조건입니다.
9. 1 ML의 DDH ₂ O.로 열 평형
10. 열을 통해 샘플에서 파생 된 상층 액 (이 경우 약 850 μl를) 실행합니다.
11. 1 ml의 물에 열을 씻으십시오.
12. 진공 매니 폴드에로드 10 ㎖ 유리 원심 관이 용출 분획을 수집한다.
13. 메탄올 중 25 mM의 아세트산 암모늄 1 mL로 컬럼을 용출.
14. 질소 가스 하에서 건조 용출액.
15. 50 μl의 5 % (w / v)의 5 술포 산에서 건조 잔류를 재현 탁하고 HPLC 바이알로 전송합니다.

5. HPLC 설치

1. HPLC를위한 시스템 제어 소프트웨어를 사용하여 표 1에 나열된 바와 같이, 분석 대상 물질과 열 이용에 최적화 HPLC 조건을 생성하는 방법.
   참고 : 열 temperat를이러한 데이터의 생성에 사용 URE 25 ℃로했지만, 특정 파라미터는 악기에서 관심의 화합물에 대해 다를 것이다. 아실 CoA를 정량 들면, LC-MS 분석의 여러 가지 방법이보고되어 있고, 서로 다른 LC 조건 ^14,19,20 다른 분석 물에 대한 검증.
2. HPLC를 적절하게 평형을 허용합니다.
   참고 :이 방법의 시작 용매 조건에서 컬럼의 컬럼과 평형을 연결하기 전에 용매의 양 프라이밍을 포함해야한다. 평형 볼륨은 제조업체의 지시에 따라해야하고, 그 결과 유출 물 낭비 전환해야합니다.
   참고 : HPLC 설정에 대한 자세한 내용은 바수와 블레어 ^{(5)를 참조하십시오.}

6. 질량 분석기 설치

1. 질량 분석 장치에 대한 제어 소프트웨어를 사용하여 관심 화합물의 이온화 된 형태의 검출을위한 타겟을 만드는 방법. 매개 변수되게됩니다표 2인치
   주 : 이들 화합물의 안정 동위체 유사체는 양 또는 음의 모드가 우수한 감도를 제공할지 여부를 결정하고 그 검출을위한 소스 및 광학 조건을 최적화하기 위해 사용되어야한다. 질량 분석계에있어서의 총 검출 시간 연관된 HPLC 방법의 시간 성분에 대응한다.
   주 : 앞서 언급 된 바와 같이, 아실 CoA를 분석의 다수의 방법은 양극 ^(14)과 음극 ^(15)의 이온화 모드 오히려 삼중 사중 악기 ^(28)보다 고해상도 질량 분석기 ^(17)의 사용을 포함하여,보고되었다.
2. 깨끗하고, 악기를 교정 분광계로 안정적인 스프레이를 확립하고, 보정 용액이 적절 소스와 제조업체의 지침에 따라 광학에서 발산하는 시간을 허용합니다.
3. 질량 분석기 제어 소프트웨어와 모든 샘플에 대한 순서를 설정합니다. 의 inclu이름이나 숫자 식별자를 해제하고 적절한 주입 볼륨과 악기 방법을 나타냅니다. 첫 번째 샘플 전에 빈을 실행하고 이월 또는 매트릭스 효과를 완화하기 위해 필요에 따라 샘플 사이에 다른 공백 및 세척을 실행합니다.
   주 : 선택된 분석 '액체 크로마토 그램의 피크의 통합을위한 처리 방법들은이 시퀀스 내에서 설정되거나 후속 적 데이터 처리에 적용 할 수있다.
4. 순서를 시작하고 압력 변동 또는 시스템 장애 및 운전 중 신호 강도의 손실을 포함하여 문제를 주기적으로 질량 분석기 및 HPLC 시스템을 모니터링 할 수 있습니다.
   주 : 심각한 문제 또는 영구 실행 실패 실행과 퍼지를 중지 요구 및 재 평형화 세척뿐만 아니라 HPLC 시스템 및 질량 분석을 교정 할 수있다. 단말기 설정 및 데이터 처리에 대한 자세한 내용은 바수와 블레어 ^{(5)를 참조하십시오.}

결과

우리가 노출 로테 논에 결과 이​​전에 설명한 보상 대사 적응의 일반화를 재현 한이 방법의 유용성을 입증합니다. 이 결과는 이전에 세포 배양 모델에서 발견되었으며,이 연구는이 대사 변화도 anuclear과 세포 배양과 같은 실험적 인공물 경향이없는 혈소판 발생하면 테스트하고자 하였다. 그들의 신진 대사 활동을 유지하지만,이 작품은, 인간의 주입을 위해 너무 오래된...

토론

여기에서 우리는 교란 미토콘드리아 대사 연구를위한 플랫폼으로 고립 된 혈소판의 유틸리티를 보여 주었다. 특히, 우리는 로테으로 복잡한 I 억제에 대한 응답으로 신진 대사 적응을 특징으로하고있다.

본 연구는 인간의 혈소판에 세포 라인에서 로테 논에 의해 복잡한 I 억제의 역할 이전에보고 된 연구 결과를 확장했다. 중요한 것은,이 또한 억제 로테 혈소판 석시 닐 -CoA?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	746398
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O)	Sigma-Aldrich	223506
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	208337
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
13C6-Glucose	Sigma-Aldrich	389374
Palmitic acid	Cayman	10006627
13C16-Palmitic Acid	Sigma-Aldrich	605573
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Trichloro Acetic Acid	Sigma-Aldrich	T6399
5-Sulfosalicylic Acid	Sigma-Aldrich	390275
Acetonitirle	Fischer Scientific	A996-4	(optima)
Water (H2O)	Fischer Scientific	W7-4	(optima)
Formic acid	Fischer Scientific	85171	(optima)
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301
Ethanol	Fischer Scientific	04-355-222
Methanol	Fischer Scientific	A454-4	(optima)
Ammonium Acetate	Fischer Scientific	A639-500
2 ml Eppendorf Tubes	BioExpress	C-3229-1
LC vials (plastic)	Waters	186002640
10 ml Glass Centrifuge Tubes	Kimble Chase	73785-10
Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns	Waters	WAT094225
Pastuer Pipets	Fischer Scientific	13-678-200
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
CO2 Water-Jacketed Incubator	Nuaire	AutoFlow NU-8500
Triple Quadropole Mass Spectrometer	Thermo Scientific	Finnigan TSQ Quantum
HPLC	Thermo Scientific	Dionex Ultimate 3000
Source	Thermo Scientific	HESI II
HPLC Column	Phenomenex	Luna C18	3 μm particle size, 200 mm x 2 mm