LC-MS Analisi delle piastrine umane come una piattaforma per lo Studio del metabolismo mitocondriale

Riepilogo

Qui mostriamo isolato piastrine umane possono essere utilizzati come accessibili ex vivo modello per studiare adattamenti metabolici in risposta al complesso I inibitore rotenone. Questo approccio impiega tracing isotopica e relativa quantificazione dal liquido spettrometria cromatografia massa e può essere applicato ad una varietà di disegni di studio.

Abstract

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Introduzione

Metabolismo mitocondriale disfunzionale è stata implicata in una vasta gamma di malattie, tra cui neurodegenerazione, il cancro, le malattie cardiovascolari e ^30. Come tale, grande sforzo è stato posto sulla caratterizzazione difetti metabolici che contribuiscono alla patogenesi della malattia. Spettrometria di massa cromatografia liquida-tandem (LC-MS / MS) è considerata il gold standard per la quantificazione di analiti da matrici biologiche complesse ed è spesso impiegato per studi metabolici ^8. Tuttavia, come è spesso il caso con studi biomedici, raggiungendo un modello accessibile e ben definito rilevante per la malattia umana è una sfida.

Molti studi impiegano trasformate modelli cellulari per sondare l'impatto di xenobiotici o anomalie genetiche sul metabolismo cellulare ^7,9. La riprogrammazione metabolica che si verifica nelle cellule tumorali può introdurre confusione fattori di ²¹ e non sono quindi l'ideale. Questi problemi possono essere circumvented con modelli cellulari primarie, anche se l'ottenimento di biomassa sufficiente per le analisi del metabolismo può essere impegnativo. Inoltre, l'impatto di elevate quantità di antibiotici utilizzati in cultura è stato evidenziato come potenzialmente confondenti studi mitocondriali ^16.

Piastrine umane permettersi l'opportunità di utilizzare un modello di cellula primaria con sufficiente contenuto mitocondriale per studi metabolici ^5,22,27,32. Innanzitutto, le piastrine possono essere facilmente acquisite, attraverso il sangue trae da donatori individuali o in grandi volumi da banche del sangue, e quindi fornire un modello in cui fattori esterni possono essere facilmente controllati. In secondo luogo, a causa delle loro piccole dimensioni, le piastrine possono essere facilmente isolati da altri componenti del sangue con il lavoro preparatorio minima in laboratori attrezzati minimamente ^5. Da segnalare, le piastrine non contengono nuclei e possono quindi essere utilizzati per studiare le alterazioni al metabolismo indipendentemente dalla regolazione trascrizionale. Qui mostriamo cheoltre alla quantificazione relativa di (CoA) tioesteri acil-coenzima A, il sistema piastrinico isolato può essere utilizzato per esaminare il metabolismo carbonio. In particolare, si segnala l'utilizzo di marcatura metabolica con isotopi stabili (non radioattivo) marcato ^[13 C _6] Glucosio e ^[13 C _16] -palmitate per sondare incorporazione della ^[13 C] -label nella importante acetil metabolita CoA via glicolisi o ossidazione degli acidi grassi. Questo fornisce una piattaforma potente, generalizzabile, e versatile grazie alla massiccia partecipazione di specie acil-CoA in vie biochimiche ^13,24 e la trattabilità di questo sistema per testare altre variabili, come ad esempio l'inibizione del complesso con rotenone ^3,33. Oltre alle informazioni fornite nel protocollo di seguito, una descrizione dettagliata dei metodi utilizzati per l'etichettatura degli isotopi e per le analisi LC-MS-based può essere trovato in Basu e Blair ^4.

Protocollo

Etica Dichiarazione: Tutti i protocolli in materia di trattamento dei campioni umani seguono le linee guida del comitato di etica della ricerca human L'Università della Pennsylvania di.

1. Preparazione di buffer e 100x archivio Solutions

1. Preparare 1 L di tampone di base di Tyrode. Unire 8,123 g di NaCl, 1.428 g NaHCO _3, 0,466 g CaCl ₂ ∙ 2 H ₂ O, 0,224 g KCl, e 0,095 g MgCl _2. Regolare il volume totale a 1 L con DDH ₂ O. Filtro sterilizzare tampone di base Tyrode.
2. Preparare soluzioni 100x di glucosio e acido palmitico. Per 100x soluzioni di riserva di glucosio, sciogliere 100 mg di glucosio o ^[13 C _6]-glucosio in 1 ml di DDH ₂ O. Per soluzioni palmitato 100x, sciogliere 2,56 mg di acido palmitico o 2,72 mg di ^[13 C _16] acido -palmitic in 1 ml di etanolo. Filtro sterilizzare 100x azionari soluzioni.
3. Preparare Buffer proprio il caso Enriched Tyrode
   1. Per gli studi non-etichettatura, aggiungere 1 ml di 100x di soluzione di glucosio e 1 ml di 100x palmitico acido soluzione madre a 98 ml di tampone di base di Tyrode.
   2. Per gli studi di etichettatura di glucosio, aggiungere 1 ml di 100x ^[13 C _6] Glucosio soluzione madre e 1 ml di 100x palmitico acido soluzione madre a 98 ml di tampone di base di Tyrode.
   3. Per gli studi di etichettatura acido palmitico, aggiungere 1 ml di 100x di glucosio soluzione madre e 1 ml di ^[13 C _16] -palmitic acido soluzione madre a 98 ml di tampone di base di Tyrode.
4. Preparare soluzioni per il trattamento Rotenone
   1. Preparare una soluzione madre di 10 mm rotenone in dimetilsolfossido (DMSO).
   2. Per gli studi di dose-risposta non-etichettatura, procedere alla 1.4.3. Per gli studi di etichettatura in una singola dose, procedere alla 1.4.5.
   3. Eseguire una diluizione seriale del 10 mM rotenone magazzino in DMSO per ottenere soluzioni con concentrazioni che vanno da rotenone 1 nM a 100 micron. Questi sono 100x magazzinoS.
   4. Aggiungere 50 ml di ogni stock a 5 ml di tampone di base Tyrode + glucosio + acido palmitico da 1.3.1 per preparare le soluzioni con concentrazioni che vanno da rotenone 22:00 a 1 micron. In alternativa, aggiungere 50 ml di DMSO a servire come un controllo del veicolo. Procedere alla 2.1.
   5. Diluire il 10 soluzione madre mM 1.000 volte in DMSO per ottenere una soluzione di lavoro 10 micron.
   6. Aggiungere 50 ml di questo stock a 5 ml di tampone di base di Tyrode + ^[13 C _6]-glucosio + acido palmitico da 1.3.2 e la base del buffer + glucosio + ^[13 C _16] acido -palmitic da 1.3.3 Tyrode. La concentrazione finale è 100 nM rotenone. In alternativa, aggiungere 50 ml di DMSO a ciascun buffer per servire come comandi del veicolo.

2. Isolamento delle piastrine

Nota: Questo metodo è suscettibile di piastrine derivate da sangue intero o da sacchetti piastrine. I dati di esempio contenuti nel presente documento è stato preparatoutilizzando piastrine derivate da sacchetti piastrine. Si prega di consultare Basu et al. ⁵ per maggiori dettagli per quanto riguarda utilizzando piastrine isolate da sangue intero.

1. Isolamento delle piastrine da sangue intero
   NOTA: Se isolare le piastrine da un sacchetto di piastrine, procedere alla 2.2.1.
   1. Centrifugare il sangue intero a 175 x g per 15 minuti senza freni.
   2. Trasferire 1 ml di plasma ricco di piastrine superiore (PRP) strato in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
   3. Centrifugare il PRP a 400 x g per 5 min.
   4. Aspirare il surnatante e procedere al punto 3.1 o 3.2.
2. Isolamento piastrine da una borsa di piastrine
   1. Trasferire 1 ml della sospensione di piastrine in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
   2. Centrifugare la sospensione a 400 xg per 5 min.
   3. Aspirare il surnatante e procedere al punto 3.1. o 3.2.

3. Esecuzione di un esperimento

1. Per determinare l'effetto di xenobioticitrattamento (ad esempio, rotenone) sui livelli di un metabolita di interesse (ad esempio, acetil-CoA), procedere alla 3.1.1. Per determinare l'effetto di uno xenobiotico (ad es., Rotenone) sull'incorporazione di un precursore metabolico in un metabolita valle di interesse, procedere alla 3.2.1.
   1. Utilizzando non meno di tre repliche biologiche per ogni condizione, risospendere piastrinica pellet dal punto 2.1.4 o 2.2.3 in 1 ml di ciascuna soluzione dal punto 1.4.4.
   2. Incubare piastrine risospese in un incubatore CO ₂ con camicia d'acqua insieme al 95% di umidità, 5% di CO ₂ e 37 ° C per 1 ora. Passare al punto 4.1
      Nota: Qui si descrive un esperimento di risposta alla dose. In alternativa, un esperimento decorso potrebbe essere fatto in cui la dose è stato fissato e la lunghezza di incubazione era varia invece.
2. Per determinare l'effetto del trattamento xenobiotico sull'incorporazione di un precursore metabolico in un metabolita valle di interesse.
   1. Ucantare non meno di tre repliche biologiche per ogni condizione, risospendere piastrinica pellet dal punto 2.1.4 o 2.2.3 in 1 ml di ciascuna formulazione del marcato del buffer di Tyrode dal punto 1.4.6.
   2. Incubare piastrine risospese in un incubatore CO ₂ con camicia d'acqua insieme al 95% di umidità, 5% di CO ₂ e 37 ° C per 1 ora. Passare al punto 4.1.

4. raffreddamento e CoA Estrazione

1. Pellet piastrine per centrifugazione a 3.000 xg per 3 min.
2. Aspirare il surnatante.
3. piastrine risospendere in 750 microlitri freddo ghiaccio acido tricloroacetico 10% (w / v).
4. Aggiungere adeguato standard interno marcati con isotopi stabili. Ad esempio, se l'obiettivo è di confrontare i livelli di specie CoA tutti i campioni, utilizzare 100 ml di una miscela di tioesteri CoA etichettati ottenuti da lieviti come descritto precedentemente stabile isotopi (tecnica SILEC) ^29.
5. Pulse-ultrasuoni ogni campione di 30 volte con impulsi di 0,5 sec.
6. Centrifugare i campioni a 16.000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
7. Fissare C18 estrazione in fase solida (SPE) colonne di collettore del vuoto.
8. Condizionare le colonne con 1 ml di metanolo.
9. Equilibrare le colonne con 1 ml DDH ₂ O.
10. Eseguire campione derivato surnatante (circa 850 microlitri in questo caso) attraverso le colonne.
11. Lavare le colonne con acqua 1 ml.
12. Caricare 10 ml provette di vetro centrifuga nel collettore del vuoto per raccogliere frazione di eluizione.
13. Eluire le colonne di 1 ml di acetato di ammonio 25 mM in metanolo.
14. eluato secco sotto azoto.
15. Risospendere residui secchi in 50 microlitri 5% (w / v) di acido 5-solfosalicilico e trasferire in fiale HPLC.

Setup 5. HPLC

1. Utilizzando il software di controllo per il sistema di HPLC, creare un metodo con condizioni HPLC ottimizzate per gli analiti bersaglio e colonna utilizzata, come elencato nella Tabella 1.
   Nota: La colonna di temperature utilizzata per la produzione di questi dati era di 25 ° C ma i parametri specifici varierà per strumento e per quanto riguarda i composti di interesse. Per acil-CoA quantificazione, sono stati riportati diversi metodi di analisi LC-MS, e convalidato per i diversi analiti nelle diverse condizioni di LC ^14,19,20.
2. Lasciare che il HPLC per equilibrare adeguatamente.
   Nota: Questo dovrebbe includere sia innesco di solventi prima di collegare una colonna e equilibrazione della colonna in cominciando condizioni solvente per il metodo. Il volume di equilibrio deve seguire le indicazioni del produttore, e la conseguente effluente deve essere deviato da perdere.
   Nota: Consultare Basu e Blair ⁵ per maggiori dettagli per quanto riguarda le impostazioni HPLC.

Setup 6. spettrometro di massa

1. Utilizzando il software di controllo per lo spettrometro di massa, creare un metodo mirato per la rilevazione di forme ionizzate dei composti di interesse. I parametri sono presentatiin Tabella 2.
   Nota: stabili analoghi isotopici di questi composti devono essere utilizzati per determinare se un modo positivo o negativo dà sensibilità superiore e di ottimizzare la sorgente e la condizione ottica di rilevazione. Il tempo di rilevamento totale del metodo spettrometro di massa deve corrispondere al componente temporale del metodo HPLC associato.
   Nota: Come precedentemente accennato, sono stati riportati diversi metodi di analisi acil-CoA, compresi positivi e negativi ¹⁴ ionizzazione ¹⁵ modalità e l'uso di una massa spettrometro ad alta risoluzione ^17, piuttosto che uno strumento triplo quadrupolo ^28.
2. Pulire e calibrare lo strumento, stabilire uno spruzzo stabile nello spettrofotometro, e lasciare il tempo per la soluzione di taratura per dissipare adeguatamente dalla sorgente e ottica secondo le istruzioni del produttore.
3. Impostare una sequenza per tutti i campioni con il software di controllo spettrometro di massa. include il nome o identificatori numerici e indicare il metodo di volume di iniezione e strumento appropriato. Eseguire un vuoto prima del primo campione, ed eseguire altri spazi e lavaggi tra i campioni come necessario per ridurre di riporto o di matrice effetti.
   Nota: Un metodo di lavorazione per il picco di integrazione dei cromatogrammi liquidi analiti selezionati 'spesso può essere impostata all'interno di questa sequenza o successivamente applicato nel trattamento dei dati.
4. Iniziare la sequenza e monitorare il sistema spettrometro e HPLC di massa periodicamente per problemi tra cui variazioni di pressione o di guasti del sistema e la perdita di intensità del segnale durante la corsa.
   Nota: Gravi problemi o guasti run persistenti possono richiedere l'arresto della corsa e spurgo e ri-equilibrante del sistema HPLC così come la pulizia e la taratura dello spettrometro di massa. Consultare Basu e Blair ⁵ per ulteriori dettagli riguardanti le impostazioni ei dati MS trattamento.

Risultati

Per dimostrare l'utilità di questa metodologia abbiamo riprodotto la generalizzabilità dei precedentemente descritto adattamento metabolico compensativo esposizione al rotenone. Questo risultato è stato precedentemente identificato in modelli di coltura cellulare e questa indagine aveva lo scopo di verificare se questo cambiamento metabolico si verifica anche nelle piastrine, che sono anuclear e non incline agli stessi artefatti sperimentali come coltura cellulare. Questo lavoro ?...

Discussione

Qui abbiamo dimostrato l'utilità delle piastrine isolate come piattaforma per lo studio del metabolismo mitocondriale perturbato. In particolare, abbiamo caratterizzato adattamento metabolico in risposta alla inibizione del complesso I da rotenone.

Il presente studio ha esteso risultati precedentemente segnalati sul ruolo di inibizione del complesso da rotenone in linee cellulari di piastrine umane. È importante sottolineare che questo ha rivelato che la formazione delle piastrine rote...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	746398
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O)	Sigma-Aldrich	223506
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	208337
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
13C6-Glucose	Sigma-Aldrich	389374
Palmitic acid	Cayman	10006627
13C16-Palmitic Acid	Sigma-Aldrich	605573
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Trichloro Acetic Acid	Sigma-Aldrich	T6399
5-Sulfosalicylic Acid	Sigma-Aldrich	390275
Acetonitirle	Fischer Scientific	A996-4	(optima)
Water (H2O)	Fischer Scientific	W7-4	(optima)
Formic acid	Fischer Scientific	85171	(optima)
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301
Ethanol	Fischer Scientific	04-355-222
Methanol	Fischer Scientific	A454-4	(optima)
Ammonium Acetate	Fischer Scientific	A639-500
2 ml Eppendorf Tubes	BioExpress	C-3229-1
LC vials (plastic)	Waters	186002640
10 ml Glass Centrifuge Tubes	Kimble Chase	73785-10
Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns	Waters	WAT094225
Pastuer Pipets	Fischer Scientific	13-678-200
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
CO2 Water-Jacketed Incubator	Nuaire	AutoFlow NU-8500
Triple Quadropole Mass Spectrometer	Thermo Scientific	Finnigan TSQ Quantum
HPLC	Thermo Scientific	Dionex Ultimate 3000
Source	Thermo Scientific	HESI II
HPLC Column	Phenomenex	Luna C18	3 μm particle size, 200 mm x 2 mm