LC-MS-Analyse von menschlichen Blutplättchen als Plattform für ein Studium Mitochondrial Metabolism

Zusammenfassung

Hier zeigen wir isolierten menschlichen Blutplättchen kann als zugänglich ex vivo - Modell verwendet werden metabolische Anpassungen in Antwort auf den Komplex I Rotenon Inhibitor zu studieren. Dieser Ansatz beschäftigt Isotopenverfolgung und relative Quantifizierung durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und kann auf eine Vielzahl von Studiendesigns angewendet werden.

Zusammenfassung

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Einleitung

Dysfunctional mitochondrialen Stoffwechsel wurde in einer Vielzahl von Krankheiten , einschließlich Neurodegeneration, Krebs und Herz - Kreislauferkrankungen ³⁰ gebracht. Als solche große Anstrengungen unternommen, auf die Charakterisierung metabolische Defekte wurden platziert, die Pathogenese der Erkrankung beitragen. Flüssigchromatographie-Tandem - Massenspektrometrie (LC-MS / MS) ist der Goldstandard für die Quantifizierung von Analyten aus komplexen biologischen Matrizen betrachtet und wird häufig für metabolische Studien beschäftigt ^8. Doch wie es oft der Fall mit biomedizinischen Studien, eine leicht zugängliche und gut definierte Modell relevant für die menschliche Krankheit zu erreichen, ist eine Herausforderung.

Viele Studien beschäftigen für die Erforschung der Wirkung von Xenobiotika oder genetische Anomalien auf den Zellstoffwechsel ^7,9 zellulären Modellen umgewandelt. Die metabolische Neuprogrammierung , die in Krebszellen auftritt , kann confounding einzuführen Faktoren ²¹ und sind daher nicht ideal. Diese Probleme können sein circumvented mit primären Zellmodellen, obwohl sich eine ausreichende Biomasse für metabolische Analysen kann eine Herausforderung sein. Darüber hinaus verwendet die Auswirkungen der hohen Mengen an Antibiotika in der Kultur wurde als potentiell verwirrende mitochondrialen Studien ¹⁶ hervorgehoben.

Menschliche Blutplättchen die Chance zu einer primären Zellmodell mit ausreichender mitochondrialen Inhalt für metabolische Studien ^5,22,27,32 zu nutzen. Erstens können Blutplättchen leicht erworben werden, durch Blut von einzelnen Spendern anfertigt oder in großen Mengen von Blutbanken und bieten daher ein Modell, in dem externe Faktoren leicht gesteuert werden. Zweitens, die aufgrund ihrer geringen Größe, Plättchen kann leicht von anderen Blutbestandteilen mit minimaler Vorbereitungsarbeiten auch nur minimal ausgestatteten Labors ⁵ isoliert werden. unabhängig von der Transkriptionsregulation der Anmerkung, Blutplättchen enthalten keine Kerne und kann daher verwendet werden, Änderungen an den Stoffwechsel zu studieren. Hier zeigen wir, dassZusätzlich zur relativen Quantifizierung der Acyl-Coenzym A (CoA) Thioester kann das isolierte Thrombozyten-System verwendet werden Kohlenstoffmetabolismus zu untersuchen. Insbesondere stellen wir die Verwendung von metabolischer Markierung mit stabilen Isotopen (nicht radioaktiv) markiert ^[13 C _6] -Glucose und ^[13 C _16] -Palmitat Sonde Einbau des ^[13 C] -markierten in den wichtigen Metaboliten acetyl- CoA durch Oxidation Glykolyse oder Fettsäure. Dies bietet eine leistungsstarke, verallgemeinerbar und vielseitige Plattform auf Grund der umfangreichen Beteiligung von Acyl-CoA - Spezies in biochemischen Wege ^13,24 und die Lenkbarkeit dieses Systems zu testen anderen Variablen, wie die Hemmung der Komplex I mit Rotenon ^3,33. Zusätzlich zu den Informationen im Protokoll unten vorgesehen ist , eine ausführliche Beschreibung der Methoden zur Isotopenmarkierung verwendet und für die LC-MS-basierte Analysen in Basu und Blair ^4.

Protokoll

Ethikerklärung: Alle Protokolle, die die Behandlung von menschlichen Proben über folgen den Richtlinien der University of Pennsylvania des Komitees Forschung mit menschlichen Ethik.

1. Herstellung von Puffern und 100x Stammlösungen

1. Bereiten Sie 1 l Basis Tyrode-Puffer. Kombinieren 8,123 g NaCl, 1,428 g NaHCO _3, 0,466 g CaCl ₂ ∙ 2 H ₂ O, 0,224 g KCl und 0,095 g MgCl _2. Stellen Sie ein Gesamtvolumen von 1 l mit ddH ₂ O. Filter sterilisieren Basis Tyrode-Puffer.
2. Bereiten Sie 100x Stammlösungen von Glukose und Palmitinsäure. Für 100x Glucose - Stammlösungen auflösen 100 mg Glucose oder ^[13 C _6] -Glucose in 1 ml ddH ₂ O. Für 100x Palmitat Lösungen, 2,56 mg Palmitinsäure oder 2,72 mg ^[13 C _16] -palmitic Säure in 1 ml Ethanol lösen. Filter sterilisieren 100x Stammlösungen.
3. Bereiten Geeignete Enriched Tyrode-Puffer
   1. Für Nicht-Markierungsstudien, 1 ml 100x Glucose-Stammlösung und 1 ml 100x Palmitinsäure Stammlösung zu 98 ml Basis Tyrode-Puffer.
   2. Für Glukose Markierungsstudien, 1 ml 100x ^[13 C _6] -Glucose Stammlösung und 1 ml 100x Palmitinsäure Stammlösung zu 98 ml Basis Tyrode-Puffer.
   3. Für Palmitinsäure Studien Kennzeichnung Säure, 1 ml 100x Glucose - Stammlösung und 1 ml ^[13 C _16] -palmitic Säure - Stammlösung auf 98 ml Basis Tyrode-Puffer.
4. Bereiten Sie Lösungen für Rotenon Behandlung
   1. Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von Rotenon in Dimethylsulfoxid (DMSO).
   2. Für Nicht-Kennzeichnung Dosis-Wirkungs-Studien, auf 1.4.3 gehen. Für die Kennzeichnung Studien in einer einzelnen Dosis, fahren Sie mit 1.4.5.
   3. Führen Sie eine serielle Verdünnung der 10 mM Rotenon Lager in DMSO-Lösungen mit Rotenon Konzentrationen von 1 nM bis 100 & mgr; M bis hin zu erhalten. Dies sind 100x Lagers.
   4. In 50 ul jeder Aktie zu 5 ml Basis Tyrode-Puffer + Glukose + Palmitinsäure aus 1.3.1 Lösungen mit Rotenon Konzentrationen von 10.00 Uhr bis 1 & mgr; M bis hin vorzubereiten. Alternativ werden 50 & mgr; l DMSO als Vehikel Kontrolle zu dienen. Fahren Sie mit 2.1.
   5. Verdünne die 10 mM Stammlösung 1000-fach in DMSO 10 & mgr; M-Arbeitslösung zu erhalten.
   6. In 50 ul dieser Lager zu je 5 ml Basis Tyrode-Puffer + ^[13 C _6] -Glucose + Palmitinsäure aus 1.3.2 und Basis Tyrode-Puffer + Glukose + ^[13 C _16] -palmitic Säure aus 1.3.3. Die Endkonzentration beträgt 100 nM Rotenon. Alternativ werden 50 & mgr; l DMSO zu jedem Puffer als Fahrzeugsteuerungen zu dienen.

2. Platelet Isolation

Hinweis: Diese Methode an Blutplättchen von entweder Vollblut oder aus Blutplättchen Taschen abgeleitet zugänglich ist. Die Beispieldaten enthalten sind hierin hergestelltVerwendung von Thrombozyten-Taschen abgeleitet Blutplättchen. Bitte beachten Sie Basu et al. ⁵ weitere Einzelheiten bezüglich Blutplättchen isoliert aus Vollblut verwendet.

1. Platelet-Isolierung aus Vollblut
   HINWEIS: Wenn Plättchen aus einem Beutel von Blutplättchen, gehen Sie auf 2.2.1 zu isolieren.
   1. Zentrifuge Vollblut bei 175 x g für 15 min ohne Bremse.
   2. 1 ml der oberen plättchenreiches Plasma (PRP) -Schicht in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   3. Zentrifugieren Sie das PRP bei 400 x g für 5 min.
   4. Überstand entfernen und gehen 3.1 oder 3.2 zu treten.
2. Platelet-Isolierung aus einer Platelet-Tasche
   1. 1 ml der Blutplättchensuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 400 xg für 5 min.
   3. Überstand entfernen und gehen 3,1 Schritt. oder 3.2.

3. Durchführung eines Tests

1. Um die Wirkung von xenobiotischen bestimmen,Behandlung (zB Rotenon) auf dem Niveau eines Metaboliten von Interesse (zB Acetyl-CoA), 3.1.1 fortfahren. Um die Wirkung einer xenobiotischen (z. B. Rotenon) auf dem Einbau eines metabolischen Vorläufers in einem nachgeschalteten Metaboliten von Interesse zu bestimmen, gehen zu 3.2.1.
   1. Mit nicht weniger als drei biologischen Replikaten für jede Bedingung, resuspendieren Blutplättchen-Pellet aus Schritt 2.1.4 oder 2.2.3 in 1 ml jeder Lösung aus Schritt 1.4.4.
   2. Inkubieren resuspendierten Blutplättchen in einem mit Wassermantel CO ₂ Inkubator auf 95% Feuchtigkeit, 5% CO ₂ und 37 ° C für 1 Stunde. Gehen Sie zu Schritt 4.1
      Hinweis: Hier haben wir eine Dosis-Wirkungs-Experiment beschreiben. Alternativ könnte ein Zeitverlaufsexperiment, in dem durchgeführt werden wurde die Dosis festgelegt und die Länge der Inkubation statt variiert wurde.
2. Um die Wirkung von xenobiotischen Behandlung auf den Einbau von einem metabolischen Precursor in einen nachgeschalteten Metaboliten von Interesse bestimmen.
   1. Usingen nicht weniger als drei biologischen Replikaten für jede Bedingung, resuspendieren Blutplättchen-Pellet aus Schritt 2.1.4 oder 2.2.3 in 1 ml jeder Formulierung des Puffers von Tyrode-markierten Schritt 1.4.6.
   2. Inkubieren resuspendierten Blutplättchen in einem mit Wassermantel CO ₂ Inkubator auf 95% Feuchtigkeit, 5% CO ₂ und 37 ° C für 1 Stunde. Gehen 4.1 zu treten.

4. Lösch- und CoA-Extraktion

1. Pellet Blutplättchen durch bei 3000 × g für 3 min zentrifugiert.
2. Überstand entfernen.
3. Resuspendieren Blutplättchen in 750 ul eiskalter 10% Trichloressigsäure (w / v).
4. In geeigneten stabilen isotopenmarkierten internen Standards. Wenn beispielsweise das Ziel ist , die Ebenen von CoA Spezies in Proben zu vergleichen, verwenden 100 & mgr; l einer Mischung von mit stabilen Isotopen markierten CoA Thioester aus Hefe , erhalten wie zuvor (SILEC Technik) ²⁹ beschrieben.
5. Pulse-beschallen jede Probe 30-mal mit 0,5 sec Impulsen.
6. Zentrifuge Proben bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C.
7. Affix C18-Festphasenextraktion (SPE) Spalten Vakuumkammer.
8. Voraussetzung für die Spalten mit 1 ml Methanol.
9. Äquilibrieren die Spalten mit 1 ml ddH ₂ O.
10. Führen Probe abgeleiteten Überstand (etwa 850 & mgr; l in diesem Fall) durch die Säulen.
11. Waschen Sie die Spalten mit 1 ml Wasser.
12. Last 10 ml Glaszentrifugenröhrchen in die Vakuumkammer Elutionsfraktion zu sammeln.
13. Eluieren der Säulen mit 1 ml 25 mM Ammoniumacetat in Methanol.
14. Trockene Eluat unter Stickstoffgas.
15. Resuspendieren getrockneten Rückstände in 50 ul 5% (w / v) 5-Sulfosalicylsäure und Transfer in HPLC-Ampullen.

5. HPLC-Setup

1. Verwendung der Steuerungssoftware für das HPLC - System erstellen , ein Verfahren mit HPLC - Bedingungen für die Zielanalyten optimiert und verwendeten Säule, wie in Tabelle 1 aufgelistet.
   Hinweis: Die Spalte temperature für die Erzeugung dieser Daten war C 25 ° verwendet, aber die spezifischen Parameter nach Instrument variieren und in Bezug auf die Verbindungen von Interesse. Für Acyl-CoA - Quantifizierung wurden mehrere Methoden der LC-MS - Analyse berichtet worden, und für unterschiedliche Analyte in unterschiedlichen LC Bedingungen ^14,19,20 validiert.
2. Lassen Sie die HPLC adäquat zu äquilibrieren.
   Hinweis: Dies sollte sowohl die Grundierung von Lösungsmitteln umfassen, bevor eine Spalte und die Äquilibrierung der Säule in den Startlösungsmittelbedingungen für das Verfahren anzubringen. Der Ausgleichsvolumen sollte den Anweisungen des Herstellers folgen, und die daraus resultierende Abwasser sollte Abfall umgeleitet werden.
   Hinweis: Bitte Basu und Blair ⁵ , um weitere Informationen in Bezug auf die HPLC - Einstellungen.

6. Massenspektrometer-Setup

1. Mit Hilfe der Steuerungssoftware für das Massenspektrometer, erstellen Sie eine gezielte Methode zur Detektion von ionisierten Formen der Verbindungen von Interesse. Die Parameter werden vorgestelltin Tabelle 2.
   Hinweis: Stabil Isotop Analoga dieser Verbindungen verwendet werden sollte, um zu bestimmen, ob ein positiver oder negativer Modus überlegene Empfindlichkeit verleiht und die Quelle und der Optik Bedingung für deren Nachweis zu optimieren. Die Gesamterfassungszeit des Massenspektrometers Verfahren sollte auf die Zeitkomponente der zugehörigen HPLC-Methode entsprechen.
   Anmerkung: Wie bereits erwähnt, mehrere Methoden der Acyl-CoA Analyse berichtet worden, einschließlich positive ¹⁴ und negative Ionisierung ¹⁵ Modi und die Verwendung eines hochauflösenden Massenspektrometer ¹⁷ anstelle eines Triple - Quadrupol - Instrument ^28.
2. Sauber und das Instrument zu kalibrieren, stellen Sie eine stabile Spray in das Spektrometer, und genügend Zeit für die Kalibrierungslösung ausreichend von der Quelle abzuleiten und Optik den Anweisungen des Herstellers entsprechend.
3. Stellen Sie eine Sequenz für alle Proben mit dem Massenspektrometer Steuerungssoftware auf. include den Namen oder die numerische Kennungen und geben Sie die entsprechende Injektionsvolumen und Instrument-Methode. Führen Sie einen Rohling vor der ersten Probe und führen andere Zuschnitte und Waschungen zwischen den Proben nach Bedarf Verschleppung oder Matrixeffekte zu mildern.
   Hinweis: Ein Verarbeitungsverfahren zur Peak-Integration ausgewählter Analyten 'Flüssigkeit Chromatogramme können oft innerhalb dieser Sequenz oder später in der Datenverarbeitung angewendet eingestellt werden.
4. Beginnen Sie mit der Sequenz und überwachen das Massenspektrometer und HPLC-System regelmäßig für Probleme, einschließlich Druckschwankungen oder Systemausfälle und der Verlust der Signalintensität während des Laufs.
   Hinweis: Schwere Probleme oder persistent Lauf Ausfälle erfordern den Lauf und Spülen zu stoppen und neu Äquilibrieren der HPLC-System sowie die Reinigung und Kalibrierung des Massenspektrometers. Consult Basu und Blair ⁵ , um weitere Informationen über die MS - Einstellungen und Datenverarbeitung.

Ergebnisse

Zur Demonstration der Nützlichkeit dieser Methode wir die Verallgemeinerung der zuvor beschriebenen Ausgleichs metabolische Adaptation reproduziert aus der Exposition gegenüber Rotenon. Dieser Befund wurde zuvor in Zellkulturmodelle identifiziert und diese Untersuchung zielte darauf ab, zu testen, ob diese metabolische Verschiebung tritt auch in Blutplättchen, die kernlose und nicht anfällig für den gleichen experimentellen Artefakte wie Zellkultur sind. Diese Arbeit wurde mit 6-Tag...

Diskussion

Hier haben wir die Nützlichkeit von isolierten Blutplättchen als Plattform gezeigt für das Studium gestörte mitochondriale Stoffwechsel. Insbesondere haben wir metabolische Anpassung in Antwort auf komplexe I Hemmung durch Rotenon gekennzeichnet.

Die vorliegende Studie wurde erweitert zuvor berichteten Ergebnisse über die Rolle der Komplex I-Hemmung durch Rotenon in Zelllinien menschlichen Blutplättchen. Wichtig ist, dass dies zeigte, dass Rotenon auch inhibierte Plättchen Succinyl-Co...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	746398
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O)	Sigma-Aldrich	223506
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	208337
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
13C6-Glucose	Sigma-Aldrich	389374
Palmitic acid	Cayman	10006627
13C16-Palmitic Acid	Sigma-Aldrich	605573
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Trichloro Acetic Acid	Sigma-Aldrich	T6399
5-Sulfosalicylic Acid	Sigma-Aldrich	390275
Acetonitirle	Fischer Scientific	A996-4	(optima)
Water (H2O)	Fischer Scientific	W7-4	(optima)
Formic acid	Fischer Scientific	85171	(optima)
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301
Ethanol	Fischer Scientific	04-355-222
Methanol	Fischer Scientific	A454-4	(optima)
Ammonium Acetate	Fischer Scientific	A639-500
2 ml Eppendorf Tubes	BioExpress	C-3229-1
LC vials (plastic)	Waters	186002640
10 ml Glass Centrifuge Tubes	Kimble Chase	73785-10
Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns	Waters	WAT094225
Pastuer Pipets	Fischer Scientific	13-678-200
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
CO2 Water-Jacketed Incubator	Nuaire	AutoFlow NU-8500
Triple Quadropole Mass Spectrometer	Thermo Scientific	Finnigan TSQ Quantum
HPLC	Thermo Scientific	Dionex Ultimate 3000
Source	Thermo Scientific	HESI II
HPLC Column	Phenomenex	Luna C18	3 μm particle size, 200 mm x 2 mm