LC-MS Analyse des plaquettes humaines en tant que plate-forme pour l'étude du métabolisme mitochondrial

Résumé

Ici , nous montrons les plaquettes humaines isolées peuvent être utilisées comme accessibles modèle ex vivo pour étudier les adaptations métaboliques en réponse au complexe I inhibiteur de la roténone. Cette approche utilise le traçage isotopique et la quantification relative par spectrométrie de masse Chromatographie en phase liquide, et peut être appliquée à une variété de modèles d'étude.

Résumé

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Introduction

Le métabolisme mitochondrial dysfonctionnelle a été impliquée dans un large éventail de maladies , y compris la neurodégénérescence, le cancer et les maladies cardiovasculaires ^30. En tant que tel, un grand effort a été mis sur la caractérisation des défauts métaboliques qui contribuent à la pathogenèse de la maladie. Chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse tandem (LC-MS / MS) est considéré comme l'étalon-or pour la quantification des analytes de matrices biologiques complexes et est souvent utilisé pour les études métaboliques ^8. Cependant, comme cela est souvent le cas avec des études biomédicales, la réalisation d'un modèle accessible et bien défini pertinents à la maladie humaine est un défi.

De nombreuses études emploient des modèles cellulaires transformées pour sonder l'impact des xénobiotiques ou des anomalies génétiques sur le métabolisme cellulaire ^7,9. La reprogrammation métabolique qui se produit dans les cellules cancéreuses peuvent introduire des facteurs de confusion ²¹ et ne sont donc pas idéales. Ces questions peuvent être circumvented avec des modèles de cellules primaires, bien que l'obtention d'une biomasse suffisante pour les analyses métaboliques peut être difficile. En outre, l'impact de grandes quantités d'antibiotiques utilisés dans la culture a été mis en évidence que des études mitochondriales potentiellement confondants ^16.

Des plaquettes humaines offrent la possibilité d'utiliser un modèle de cellules primaires avec un contenu mitochondrial suffisante pour les études métaboliques ^5,22,27,32. Tout d'abord, les plaquettes peuvent être facilement acquis, par le sang attire de donateurs individuels, ou dans de grands volumes de banques de sang, et donc fournir un modèle dans lequel les facteurs externes peuvent être facilement contrôlés. Deuxièmement, en raison de leur petite taille, les plaquettes peuvent être facilement isolés des autres composants du sang avec le travail préparatoire minimale dans les laboratoires même peu équipés ^5. Il faut noter que les plaquettes ne contiennent pas de noyaux et peuvent donc être utilisés pour étudier les altérations du métabolisme indépendamment de la régulation de la transcription. Ici, nous montrons queen plus de la quantification relative de l'acyl-coenzyme A (CoA-thioesters), le système plaquettaire isolé peut être utilisé pour étudier le métabolisme du carbone. Plus précisément, nous rapportons l'utilisation de marquage métabolique avec des isotopes stables (non radioactif) marqué ^[13 C _6] Glucose et ^[13 C _16] palmitate pour sonder l' incorporation de la ^[13 C] -label dans l'importante acétyl métabolite CoA par l'intermédiaire de la glycolyse ou l'oxydation des acides gras. Ceci fournit une plate - forme puissante, généralisable, et polyvalent en raison de la forte implication des espèces acyl-CoA dans les voies biochimiques ^13,24 et la traçabilité de ce système à l' essai d' autres variables, telles que l' inhibition de I complexe avec roténone ^3,33. En plus des informations fournies dans le protocole ci - dessous, une description détaillée des méthodes utilisées pour le marquage isotopique et pour les analyses basées sur LC-MS peut être trouvée dans Basu et Blair ^4.

Protocole

Déclaration éthique: Tous les protocoles concernant le traitement des échantillons humains suivent les directives de l'Université de Pennsylvanie comité d'éthique de la recherche humaine.

1. Préparation de Tampons et 100x Stock Solutions

1. Préparer 1 L de tampon de base de Tyrode. Combinez 8.123 g NaCl, 1,428 g de NaHCO _3, 0,466 g _CaCl2 ∙ 2 H ₂ O, 0,224 g de KCl, et 0,095 g MgCl _2. Régler le volume total à 1 L avec ddH ₂ O. Filtre stériliser le tampon de base de Tyrode.
2. Préparer des solutions de 100x de glucose et de l'acide palmitique. Pour 100x solutions mères de glucose, on dissout 100 mg de glucose ou de ^[13 C _6] -glucose dans 1 ml de ddH ₂ O. Pour les solutions palmitate 100x, on dissout 2,56 mg d'acide palmitique ou 2,72 mg de ^[13 C _16] acide -palmitic dans 1 ml d'éthanol. Filtre stériliser 100x solutions mères.
3. Préparer Tampons de Enriched appropriée Tyrode
   1. Pour les études non-étiquetage, ajouter 1 ml de glucose 100x solution mère et 1 ml de 100x palmitique solution stock d'acide à 98 ml de tampon de base de Tyrode.
   2. Pour les études d'étiquetage glucose, ajouter 1 ml de 100x _[6 ¹³ C] solution mère -glucose et 1 ml de 100x palmitique solution stock d' acide à 98 ml de tampon de base de Tyrode.
   3. Pour des études de marquage d'acide palmitique, ajouter 1 ml de solution mère 100x glucose et 1 ml de ^[13 C _16] -palmitic solution mère d' acide à 98 ml de tampon de base de Tyrode.
4. Préparer des solutions pour le traitement roténone
   1. Préparer une solution mère 10 mM de roténone dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).
   2. Pour les études de dose-réponse non-étiquetage, passez à 1.4.3. Pour les études d'étiquetage à une seule dose, passez à 1.4.5.
   3. Effectuer une dilution en série de 10 mM roténone dans du DMSO pour obtenir des solutions avec des concentrations de roténone allant de 1 nM à 100 uM. Ce sont 100x actionss.
   4. Ajouter 50 ul de chaque stock à 5 ml de tampon de base de Tyrode + glucose + acide palmitique de 1.3.1 pour préparer des solutions avec des concentrations de roténone allant de 10 pM à 1 pM. En variante, ajouter 50 ul de DMSO pour servir de contrôle du véhicule. Passez à 2.1.
   5. Diluer la solution mère 10 mM 1000 fois dans du DMSO pour obtenir une solution de travail de 10 uM.
   6. Ajouter 50 pi de ce stock à 5 ml chacun de tampon de base de Tyrode + ^[13 C _6] -glucose + acide palmitique de 1.3.2 et de la base tampon Tyrode + glucose + ^[13 C _16] d'acide -palmitic de 1.3.3. La concentration finale est de 100 nM roténone. En variante, ajouter 50 ul de DMSO à chaque tampon pour servir de contrôle du véhicule.

2. Platelet Isolation

Note: Cette méthode se prête à des plaquettes dérivées de sang total ou à partir de sacs de plaquettes. Les données d'exemple dans le présent document a été préparéen utilisant les plaquettes dérivées de sacs de plaquettes. S'il vous plaît voir Basu et al. ⁵ pour plus de détails concernant l' utilisation de plaquettes isolées à partir du sang total.

1. Isolement Platelet de sang total
   NOTE: Si l'isolement des plaquettes d'un sac de plaquettes, passez à 2.2.1.
   1. Toute Centrifugeuse de sang à 175 x g pendant 15 min sans freins.
   2. Transfert 1 ml de plasma riche en plaquettes supérieur (PRP) couche à un tube de 1,5 ml.
   3. Centrifuger le PRP à 400 x g pendant 5 min.
   4. Aspirer le surnageant et passez à l'étape 3.1 ou 3.2.
2. Isolation Platelet à partir d'un sac Platelet
   1. Transfert 1 ml de la suspension de plaquettes à un tube de 1,5 ml.
   2. Centrifuger la suspension à 400 g pendant 5 min.
   3. Aspirer le surnageant et passez à l'étape 3.1. ou 3.2.

3. Réalisation d'une expérience

1. Pour déterminer l'effet de xénobiotiquestraitement (par exemple, la roténone) sur les niveaux d'un métabolite d'intérêt (par exemple, l' acétyl-CoA), passez à 3.1.1. Pour déterminer l'effet d'un xénobiotiques (par exemple., Roténone) sur l'incorporation d'un précurseur métabolique en un métabolite aval d'intérêt, passez à 3.2.1.
   1. En utilisant pas moins de trois répétitions biologiques pour chaque état, remettre en suspension plaquettaire culot de l'étape 2.1.4 ou 2.2.3 dans 1 ml de chaque solution de l'étape 1.4.4.
   2. Incuber plaquettes remises en suspension dans un incubateur à _CO2 chemisé d'eau fixé à 95% d' humidité, 5% de CO ₂ et 37 ° C pendant 1 heure. Passez à l'étape 4.1
      Note: Nous décrivons ici une expérience de dose-réponse. En variante, une expérience au cours du temps pourrait être fait dans lequel la dose a été fixée et la durée d'incubation, on fait varier la place.
2. Pour déterminer l'effet du traitement des xénobiotiques sur l'incorporation d'un précurseur métabolique en un métabolite aval d'intérêt.
   1. Uchante pas moins de trois répétitions biologiques pour chaque état, remettre en suspension plaquettaire culot de l'étape 2.1.4 ou 2.2.3 dans 1 ml de chaque formulation de tampon Tyrode marqué de l'étape 1.4.6.
   2. Incuber plaquettes remises en suspension dans un incubateur à _CO2 chemisé d'eau fixé à 95% d' humidité, 5% de CO ₂ et 37 ° C pendant 1 heure. Passez à l'étape 4.1.

4. Trempe et CoA Extraction

1. Pellet plaquettes par centrifugation à 3000 xg pendant 3 min.
2. surnageant Aspirer.
3. Remettre en suspension les plaquettes à 750 froide d'acide trichloroacétique à 10% pi de glace (p / v).
4. Ajouter norme marquée par un isotope stable interne appropriée. Par exemple, si l'objectif est de comparer les niveaux d'espèces CoA à travers des échantillons, utiliser 100 pl d'un mélange d'isotopes stables de thioesters CoA marqués obtenus à partir de la levure comme décrit précédemment (technique SILEC) ^29.
5. Impulsions de sonication chaque échantillon 30 fois avec des impulsions de 0,5 sec.
6. Centrifuger les échantillons à 16000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
7. Apposer C18 extraction en phase solide (SPE) colonnes à collecteur à vide.
8. Conditionner les colonnes avec 1 ml de méthanol.
9. Equilibrer les colonnes avec 1 ml ddH ₂ O.
10. Exécutez échantillon dérivé surnageant (environ 850 ul dans ce cas) à travers les colonnes.
11. Laver les colonnes avec 1 de l'eau.
12. Charge 10 ml de centrifugation en verre des tubes dans le collecteur à vide pour recueillir la fraction d'élution.
13. Éluer la colonne avec 1 ml d'acétate d'ammonium 25 mM dans le methanol.
14. éluat à sec sous azote gazeux.
15. Remettre en suspension les résidus séchés dans 50 ul de 5% (p / v) d'acide 5-sulfosalicylique et de transférer dans des flacons de HPLC.

Configuration 5. HPLC

1. En utilisant le logiciel de commande du système HPLC, de créer un procédé avec des conditions de HPLC optimisées pour les analytes cibles et la colonne utilisée, comme indiqué dans le tableau 1.
   Remarque: La colonne temperature utilisé pour la génération de ces données est de 25 ° C, mais les paramètres spécifiques variera par instrument et par rapport aux composés d'intérêt. Pour acyl-CoA quantification, plusieurs méthodes d'analyse LC-MS ont été signalés, et validés pour différents analytes dans différentes conditions LC ^14,19,20.
2. Laisser la HPLC pour équilibrer adéquatement.
   Note: Ceci doit inclure à la fois l'amorçage de solvants avant la fixation d'une colonne et équilibration de la colonne dans les conditions de solvant à partir de la méthode. Le volume d'équilibration doit suivre les instructions du fabricant, et l'effluent qui en résulte doit être détourné à perdre.
   Note: Consultez Basu et Blair ⁵ pour plus de détails concernant les paramètres de HPLC.

6. Mass Spectrometer Setup

1. En utilisant le logiciel de commande pour le spectromètre de masse, de créer un procédé pour la détection ciblée des formes ionisées des composés d'intérêt. Les paramètres sont présentésdans le tableau 2.
   Nota: Les produits analogues des isotopes stables de ces composés doivent être utilisés pour déterminer si un mode positif ou négatif donne une sensibilité supérieure et d'optimiser la source et l'état de l'optique pour leur détection. Le temps total de détection de la méthode de spectrométrie de masse doit correspondre à la composante temporelle de la méthode HPLC associée.
   Remarque: Comme mentionné précédemment, plusieurs méthodes d'analyse acyl-CoA ont été signalées, y compris ¹⁴ positifs et négatifs ionisation ¹⁵ modes et utilisation d'un spectromètre de masse à haute résolution ¹⁷ plutôt qu'un instrument triple quadripôle ^28.
2. Nettoyer et étalonner l'instrument, établir une pulvérisation stable dans le spectromètre, et laisser le temps pour la solution d'étalonnage pour dissiper adéquatement de la source et de l'optique selon les instructions du fabricant.
3. Mettre en place une séquence pour tous les échantillons avec le logiciel de contrôle de masse du spectromètre. includé le nom ou les identificateurs numériques et indiquer la méthode de volume d'injection et instrument approprié. Exécuter un vide avant le premier échantillon, et exécuter d'autres ébauches et lavages entre les échantillons au besoin pour atténuer report ou matrice effets.
   Note: Une méthode de traitement pour une intégration de crête des chromatogrammes liquides d'analytes sélectionnés peuvent souvent être réglé dans cette séquence ou appliquée ultérieurement dans le traitement des données.
4. Commencez la séquence et surveiller le système de spectromètre et HPLC masse périodiquement pour des problèmes, y compris les fluctuations de pression ou les défaillances du système et la perte d'intensité du signal pendant la course.
   Remarque: les problèmes graves ou les échecs d'exécution persistants peuvent nécessiter l'arrêt de la course et la purge et rééquilibrant le système HPLC, ainsi que le nettoyage et l'étalonnage du spectromètre de masse. Consultez Basu et Blair ⁵ pour plus de détails concernant les réglages et données MS traitement.

Résultats

Pour démontrer l'utilité de cette méthode, nous avons reproduit la généralisation de l'adaptation métabolique compensatoire décrit précédemment résultant de l'exposition à la roténone. Cette constatation a déjà été identifiée dans des modèles de culture cellulaire et cette enquête avait pour but de vérifier si ce changement métabolique se produit également dans les plaquettes, qui sont sujettes et non nucléaire est aux mêmes objets expérimentaux que l...

Discussion

Ici, nous avons démontré l'utilité des plaquettes isolées en tant que plate-forme pour étudier le métabolisme mitochondrial perturbé. Plus précisément, nous avons caractérisé l'adaptation métabolique en réponse au complexe I inhibition par la roténone.

La présente étude a étendu les résultats rapportés précédemment sur le rôle de I inhibition complexe par la roténone dans des lignées cellulaires à des plaquettes humaines. Surtout, ce qui a révélé que la fo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	746398
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O)	Sigma-Aldrich	223506
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	208337
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
13C6-Glucose	Sigma-Aldrich	389374
Palmitic acid	Cayman	10006627
13C16-Palmitic Acid	Sigma-Aldrich	605573
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Trichloro Acetic Acid	Sigma-Aldrich	T6399
5-Sulfosalicylic Acid	Sigma-Aldrich	390275
Acetonitirle	Fischer Scientific	A996-4	(optima)
Water (H2O)	Fischer Scientific	W7-4	(optima)
Formic acid	Fischer Scientific	85171	(optima)
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301
Ethanol	Fischer Scientific	04-355-222
Methanol	Fischer Scientific	A454-4	(optima)
Ammonium Acetate	Fischer Scientific	A639-500
2 ml Eppendorf Tubes	BioExpress	C-3229-1
LC vials (plastic)	Waters	186002640
10 ml Glass Centrifuge Tubes	Kimble Chase	73785-10
Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns	Waters	WAT094225
Pastuer Pipets	Fischer Scientific	13-678-200
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
CO2 Water-Jacketed Incubator	Nuaire	AutoFlow NU-8500
Triple Quadropole Mass Spectrometer	Thermo Scientific	Finnigan TSQ Quantum
HPLC	Thermo Scientific	Dionex Ultimate 3000
Source	Thermo Scientific	HESI II
HPLC Column	Phenomenex	Luna C18	3 μm particle size, 200 mm x 2 mm