متعدد الألوان كشف الإسفار عن القطرة على microfluidics عن طريق الألياف البصرية

Summary

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Abstract

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Introduction

توفر على microfluidics الحبرية منبرا للعلم الأحياء إنتاجية عالية من compartmentalizing التجارب في عدد كبير من قطرات مائية معلقة في الناقل للنفط ^1. وقد استخدمت قطرات لتطبيقات متنوعة مثل تحليل خلية واحدة ^2، البلمرة الرقمي سلسلة من ردود الفعل (PCR) ^3، وانزيم تطور ^4. المقايسات الفلورسنت هي الوضع العادي من الكشف عن على microfluidics الحبرية، وإشاراتها مشرقة وزمن الاستجابة سريعة متوافقة مع اكتشاف كميات قطرات نانولتر الفرعي في معدلات كيلوهيرتز. تتطلب العديد من التطبيقات الكشف عن مضان لمدة سنتين على الأقل الألوان في وقت واحد. على سبيل المثال، لدينا مختبر يؤدي عادة PCR تنشيط قطرة فرز التجارب التي تستخدم القناة كشف واحد لنتيجة لفحص، ويستخدم صبغة خلفية الثانوي لجعل-فحص سلبي قطرة قابل للعد ^5.

محطات الكشف نموذجية لعلى microfluidics الحبرية هي باالحوار الاقتصادي الاستراتيجي على المجاهر epifluorescence، وتتطلب معقدة مخططات التلاعب الخفيفة لإدخال ضوء الإثارة من الليزر مساحة حرة داخل المجهر لأن تركز على العينة. بعد خروجه مضان من قطرات، يتم تصفية ضوء fluoresced المنبعثة بحيث تستخدم كل قناة الكشف عن أنبوب مضخم واحد (PMT) تركزت على نطاق الطول الموجي. توفر أنظمة الكشف البصري Epifluorescence أساس المجهر عائقا أمام دخول السوق بسبب نفقتهم والتعقيد، وتتطلب صيانة. توفر الألياف البصرية وسيلة لبناء نظام كشف مبسط وقوية، منذ الألياف يمكن إدراجها يدويا في أجهزة ميكروفلويديك، وإزالة الحاجة لالقائم على مرآة ضوء التوجيه، والسماح للمسارات الضوء على أن ربطه باستخدام موصلات الألياف البصرية.

في هذه الورقة، ونحن تصف الجمعية والمصادقة على مخطط صغير وحدات لأداء كشف مضان متعدد الألوان من خلال الاستفادة من مجموعة من الألياف البصرية لدا مكشاف ضوئي واحد ^(6). تقترن الألياف البصرية ليزر الفردية وإدراج طبيعية لقناة تدفق شكل حرف L في إزاحة المكانية العادية. وتوجه والألياف جمع مضان موازية للمناطق الإثارة ويرتبط إلى PMT واحد. لأن قطرات يمر عبر أشعة الليزر في أوقات مختلفة، والبيانات التي سجلتها PMT يظهر الزمنية تعويض التي تسمح للمستخدم للتمييز بين مضان المنبعثة بعد هو متحمس الحبرية كل شعاع الليزر واضح. هذا التحول الزمني يلغي الحاجة لفصل الضوء المنبعث من هذه الفرق منفصلة باستخدام سلسلة من المرايا مزدوج اللون والمرشحات ممر الموجة. للتحقق من صحة فعالية للكشف، ونحن quantitate مضان في السكان قطرة التغليف الأصباغ من لون مختلف والتركيز. تم دراسة حساسية نظام واحد كشف اللون فلوريسئين، ويظهر القدرة على الكشف عن قطرات مع تركيزات الى 0.1 نانومتر، حساسية الظهور 200Xovement بالمقارنة مع النهج الألياف مقرها الأخيرة التي أعلن عنها في الأدب ^7.

Protocol

1. SU8 تصنيع ماستر

1. تصميم الهياكل الموائع الدقيقة لمدة ثلاثة طبقة تلفيق باستخدام برامج التصميم ولها التصميمات المطبوعة من قبل بائع على الفيلم لوحة الدوائر مع 10 ميكرون القرار. وترد تفاصيل تصميم الجهاز في إشارة تعلق ⁶ وترد في هندستها القناة في الشكل 1. وينبغي أن تشمل طبقات علامات المحاذاة للمساعدة في رصف الميزات من كل طبقة تلفيق ^8.
2. وضع 3 بوصة قطرها رقاقة السيليكون تنظيفها مسبقا على المغطي تدور وتشغيل فراغ ليضعوا لها تشوك. تطبيق 1 مل من SU8-3050 في وسط رقاقة وتدور لمدة 20 ثانية في 500 دورة في الدقيقة، ثم 30 ثانية في 1750 دورة في الدقيقة، وتوفير سماكة طبقة من 80 ميكرون.
3. إزالة الرقاقة وتخبز على 135 درجة مئوية موقد لمدة 30 دقيقة. تسمح الرقاقة لتبريد لRT قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
4. فضح الرقاقة المغلفة ^للشارع قناع طبقة 1 تحت موازى 190 مترW، 365 نانومتر الصمام لمدة 3 دقائق. بعد التعرض، ووضع رقاقة على 135 درجة مئوية موقد لمدة 1 دقيقة، ثم بارد لRT قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
5. وضع رقاقة على المغطي تدور وتشغيل فراغ ليضعوا لها تشوك. تطبيق 1 مل من SU8-3050 في وسط رقاقة وتدور لمدة 20 ثانية في 500 دورة في الدقيقة، ثم 30 ثانية في 5000 دورة في الدقيقة، مما أدى إلى الطبقة التي توفر سمك إضافي من 40 ميكرون.
6. إزالة الرقاقة وتخبز على 135 درجة مئوية موقد لمدة 30 دقيقة، ثم بارد لRT قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
7. محاذاة قناع طبقة ^{الثانية} 2 على هندسة نمط 1.3 وفضح الرقاقة المغلفة لموازى 190 ميغاواط، 365 نانومتر الصمام لمدة 3 دقائق. بعد التعرض، ووضع على 135 درجة مئوية موقد لمدة 4 دقائق و 30 ثانية، ثم بارد لRT قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
8. وضع رقاقة على المغطي تدور وتشغيل فراغ ليضعوا لها تشوك. تطبيق 1 مل من SU8-3050 في وسط رقاقة وتدور لمدة 20 ثانية في 500 دورة في الدقيقة، ثم 30ثانية في 1000 دورة في الدقيقة، مما أدى إلى الطبقة التي توفر سمك إضافي من 100 ميكرون.
9. إزالة الرقاقة وتخبز على 135 درجة مئوية موقد لمدة 30 دقيقة، ثم بارد لRT قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
10. محاذاة قناع طبقة 3 ^{الثالثة} على هندسة نمط 1.3 وفضح الرقاقة المغلفة لموازى 190 ميغاواط، 365 نانومتر الصمام لمدة 3 دقائق. بعد التعرض، ووضع على 135 درجة مئوية موقد لمدة 9 دقائق، ثم تبرد لRT قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
11. تطوير الأقنعة عن طريق غمر في حمام أثار من البروبيلين غليكول monomethyl الأثير خلات لمدة 30 دقيقة. غسل الرقاقة في الأيسوبروبانول وتخبز على 135 درجة مئوية موقد لمدة 1 دقيقة. وضع سيد وضعت في صحن 100 ملم بيتري لثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) صب.

2. PDMS تصنيع الأجهزة

1. إعداد 10: 1 PDMS من خلال الجمع بين 50 غراما من قاعدة السيليكون مع 5 غرام من وكيل علاج في كوب من البلاستيك. خلط المحتويات مع أداة دوارة مزودة عصا ضجة. درجةكما الخليط داخل المجفف لمدة 30 دقيقة، أو حتى يتم إزالة جميع فقاعات الهواء.
2. صب PDMS لإعطاء سماكة 3 ملم على الماجستير والمكان مرة أخرى في مجفف لمزيد من التفريغ. حالما تتم إزالة جميع فقاعات، خبز الجهاز على 80 درجة مئوية لمدة 80 دقيقة.
3. قطع الجهاز من العفن باستخدام مشرط ومكان على سطح نظيف مع الجانب منقوشة صعودا ولكمة مداخل ومنافذ الموائعية مع خزعة لكمة 0.75 مم. يجب أن تقطع الجهاز بحيث 120 ميكرون و 220 ميكرون هندستها طويل القامة يمكن الوصول إليها من جانب الجهاز.
4. البلازما علاج الجهاز، مع الجانب ميزة تصل، جنبا إلى جنب مع ما قبل تنظيفها 2 بوصة بنسبة 3 بوصة شريحة زجاجية في 1 مللي بار O ₂ البلازما لمدة 20 ثانية في نظافة البلازما 300 واط. السندات الجهاز PDMS عن طريق وضع الجانب منقوشة من الجهاز PDMS على الجانب المعالجة البلازما من شريحة زجاجية. وضع الجهاز في C الفرن 80 درجة وتخبز الجهاز تجميعها لمدة 40 دقيقة.
5. جعل قنواتمسعور باستخدام حقنة لمسح الجهاز مع المفلورة سائل المعالجة السطحية. على الفور خبز الجهاز على 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتتبخر المذيب.

3. إعداد مكونات البصرية

1. تحضير الألياف الإثارة ليزر عن طريق إزالة العزل من 5 ملم الأخير من 105 ميكرون الأساسية، 125 ميكرون الكسوة، NA = 0.22 الألياف البصرية.
2. إعداد 2 ^{الثانية} ليزر ملونة الألياف الإثارة بتكرار 3.1 لألياف متطابقة 2 ^{الثانية.}
3. تحضير الألياف لجمع إشارة مضان بتكرار 3.1 ل200 ميكرون الأساسية، 225 ميكرون الكسوة، NA = 0.39 الألياف البصرية.
4. تفقد النصائح من كل ألياف - إذا النصائح لا تنتهي في سطح مستو، وإعادة يلتصق-نهايات مع الكاتب الألياف.
5. إرفاق مقرنة الألياف الليزر إلى 50 ميغاواط، 405 نانومتر ليزر ونعلق واحدة من 105 ميكرون الألياف الأساسية لليزر. توجيه نهاية جردت على استشعار قوة الليزرمتر، واستخدام التعديلات غرامة مقرنة الليزر لتحقيق أقصى قدر من قوة الليزر.
6. كرر 3.5 لنانومتر الليزر 50 ميغاواط، 473.
7. شن 446/510/581/703 نانومتر مرشحات ممر الموجة رباعية على PMT باستخدام أنابيب عدسة لمنع ضوء الليزر ونقل مضان المنبعثة. إرفاق مقرنة الألياف بحيث ينتقل هذا الضوء من خلال مرشحات قبل أن تصل إلى PMT.
8. إرفاق الألياف من 3.3 إلى وحدة مجمعة في 3.7.

4. الجيل مستحلب مختلط غير متصل

1. الحصول على التركيز تدفق الجهاز على microfluidics dropmaker مع 60 ميكرون × 60 ميكرون فتحة.
2. ملء حقنة 1 مل مع HFE 7500 الزيوت مع 2٪ الفلورية الأيونية ^9.
3. ملء سلسلة من 1 مل المحاقن مع المجموعات التالية من فلوريسئين (FITC) وديكستران مترافق الأصباغ الزرقاء (CB) في برنامج تلفزيوني: 1 نانومتر FITC / 10 نانومتر CB، 10 نانومتر FITC / 10 نانومتر CB، 1 نانومتر FITC / 100 نانومتر CB، و 10 نانومتر FITC / 100 نانومتر CB.
4. تركيب جهاز dropmaker على مرحلة من مراحل ميكرو مقلوبمواجهة ومائي والنفط الحقن على مضخات الحقنة. زوجان المحاقن إلى الأجهزة التي تستخدم PE-2 الأنابيب.
5. تشغيل مضخات حقنة في 500 ميكرولتر / ساعة للنفط و 250 ميكرولتر / ساعة لالمحاليل المائية، وخلق مزيج من 80 ميكرون قطرات تحتوي على حلول من 4.3. لكل نوع من عينة المائية، واستخدام جهاز dropmaker جديدة للقضاء على انتقال التلوث. جمع ~ 200 ميكرولتر من مستحلب من كل مزيج صبغة في حقنة فارغة.
6. بعد أن تم جمع قطرات أنواع 4 في حقنة مجموعة واحدة، ومزيج مستحلب من قبل مرارا وتكرارا الدورية للحقنة.
7. كرر الخطوات من 4،2-4،6 مع المحاليل المائية التي تحتوي على 0.1، 1، 10، و 100 نانومتر FITC في برنامج تلفزيوني.

5. الألياف البصرية الإدراج

1. وضع رقاقة ميكروفلويديك ملفقة في الخطوة 2 على مرحلة مجهر مقلوب إلى جانب وجود كاميرا رقمية قادرة على <100 μsec سرعات مصراع.
2. العمل بعناية من جانب، INSERT الألياف بالإضافة إلى نانومتر ليزر 473 إلى أبعد المنبع قناة ميكرون 120، مع الحرص على عدم ثقب من خلال لقناة التدفق الرئيسية.
3. إدراج الألياف بالإضافة إلى نانومتر ليزر 405 إلى ابعد المصب 120 قناة ميكرون الجانب عالية، وتوفير التباعد الألياف من 300 ميكرون.
4. تضاف الألياف إلى جانب PMT-في قناة طويل القامة 220 ميكرون العادية لاثنين من الألياف الإثارة الليزر.

6. كشف الإسفار من المستحلبات المختلطة

1. جبل حقنة 5 مل مملوءة HFE 7500 مع 2٪ الفلورية الأيونية إلى مدخل النفط فاصل من جهاز الكشف مع PE-2 الأنابيب.
2. جبل حقنة تحتوي على المختلط FITC / CB مستحلب على ضخ حقنة موجه عموديا والزوجان إلى مدخل قطرة إعادة حقن الجهاز باستخدام PE-2 الأنابيب. توصيل طول أنابيب PE-2 من مخرج الجهاز إلى حاوية النفايات.
3. رئيس الجهاز عن طريق تشغيل كل من المضخات في 1000 ميكرولتر / ساعة حتى على حد سواءوينظر النفط وقطرات إلى أن الجمع بين بانتظام في الجهاز والتي تتدفق المصب.
4. ضبط معدلات التدفق بحيث النفط هل يعمل على 6000 ميكرولتر / ساعة وقطرات في 100 ميكرولتر / ساعة، وتوفير تباعد كبير بين قطرات السفر من خلال المنطقة الكشف.
5. بدوره على الليزر، بدء تشغيل البرنامج الحصول على البيانات، وضبط الربح PMT في تقديم إشارات التي هي أكثر من 100X الطابق ضجيج خط الأساس. ضبط قوة الليزر حتى يتسنى لجميع من قمم صدرة تكون مرئية بشكل واضح على واحدة، timetrace تحجيم خطيا.
6. الحصول على 60 ثانية من timetrace PMT الجهد في لا يقل عن 20 كيلو هرتز. استيراد البيانات إلى برنامج الحوسبة مثل ماتلاب وقياس ارتفاعات قمم الحلل سجلت باستخدام البرنامج النصي برنامج الحوسبة حسب الطلب.
   ملاحظة: يتم توفير هذه كمعلومات إضافية.
7. كرر الخطوات من 6،2-6،7 باستخدام FITC فقط مستحلب مختلطة تم إنشاؤها في 4.7، مع نانومتر ليزر 405 إيقاف.

النتائج

تصنيع جهاز PDMS التي تسمح لإدخال الألياف البصرية يتطلب إجراء ضوئيه متعددة الخطوات لإنشاء قنوات متفاوتة الارتفاع (الشكل 1). أولا، يتم نسج 80 ميكرون طبقة طويل القامة من SU-8 على رقاقة السيليكون ومنقوشة باستخدام قناع لخلق التعامل مع هندسة السوائل. ...

Discussion

كشف الألياف البصرية يتطلب محاذاة الألياف البصرية فيما يتعلق قنوات السوائل. لأن لدينا جهاز يستخدم القنوات دليل ملفقة مع ضوئيه متعدد الطبقات، وضع أقنعة مع الاحترام لبعضهما البعض هو من أهمية كبيرة. إذا كانت القنوات دليل الألياف هي قريبة جدا من قناة السوائل، وهناك احتم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Photomasks	CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade	University Wafers	447
SU-8 3035	Microchem	Y311074
SU-8 2050	Microchem	Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Krayden	4019862
1 ml syringes	BD	309628
10 ml syringes	BD	309604
27 gaugue needles	BD	305109
PE 2 polyethylene tubing	Scientific Commodities, Inc.	B31695-PE/2
Novec 7500	Fisher Scientific	98-0212-2928-5	Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant			Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye	Life Technologies	D-1976
Fluorescein sodium salt	Sigma	28803
Quad bandpass filter	Semrock	FF01-446/510/581/703-25
PMT	Thorlabs	PMM02
Fiber port	Thorlabs	PAFA-X-4-A
lens tube	Thorlabs	SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector	Thorlabs	Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector	Thorlabs	Custom
125 μm fiber stripping tool	Thorlabs	T08S13
225 μm fiber stripping tool	Thorlabs	T10S13
laser fiber adapter	OptoEngine	FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW	OptoEngine	MDL-III-405	Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW	OptoEngine	MLL-FN-473-50