JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Аннотация

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Введение

Капельные микрофлюидики обеспечивают платформу для высокой пропускной способности биологии путем compartmentalizing экспериментов в большом количестве водных капелек , взвешенных в носителе масла 1. Капельки использовались для применения в качестве различных как одного клеточного анализа 2, цифровой полимеразной цепной реакции (ПЦР) 3, и фермент эволюции 4. Флуоресцентные анализы стандартный режим обнаружения для микрофлюидики капель, так как их яркие сигналы и быстрого времени отклика совместимы с определением объемов капельные суб-nanoliter по ставкам килогерц. Многие приложения требуют обнаружения флуоресценции в течение по крайней мере двух цветов одновременно. Например, наша лаборатория обычно выполняет ПЦР-активированный капельные сортировки экспериментов , которые используют один канал обнаружения для результата анализе, и использует вторичный фон краситель , чтобы сделать тест-отрицательный капелька счетная 5.

Типичные станции обнаружения для микрофлюидики капельных являются баСЭД на эпифлуоресцентной микроскопов, и требуют сложных световых схем манипуляции, чтобы ввести свет возбуждения от свободных космических лазеров в микроскоп, чтобы быть сфокусирован на образце. После того, как флуоресценция испускается из капелькой, испускаемый флуоресцирующих свет фильтруется таким образом, чтобы каждый канал обнаружения использует один фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), завязанный на полосе длин волн. Эпифлуоресцентной микроскоп на основе оптических систем обнаружения обеспечивают барьер для выхода на рынок из-за их счет, сложности и необходимости технического обслуживания. Оптические волокна обеспечивают средства для создания упрощенной и надежной схемы обнаружения, так как волокна могут быть вручную вставлены в микрожидкостных устройств, устраняя необходимость прокладки света зеркала на основе, и позволяя легкие пути к сопрягаться с использованием волоконно-оптических соединителей.

В этой статье мы опишем сборку и проверку компактной и модульной схемы для выполнения многоцветной флуоресцентной детекции с использованием массива оптических волокон апда одиночный фотодетектор 6. Оптические волокна связаны с отдельными лазерами и вставлены нормально к форме L канала потока при регулярных пространственных смещений. Коллекция флюоресценции волокна ориентированы параллельно областей возбуждения и подключен к одному ФЭУ. Поскольку капелька проходит через лазерные лучи в разные моменты времени, данные, записанные с помощью ФЭУ показывает временное смещение, которое позволяет пользователю различать флуоресценции, испускаемой после того, как капелька возбуждается каждого отдельного лазерного луча. Этот временной сдвиг исключает необходимость разделения излучаемого света для отдельных ФЭУ с использованием ряда дихроичных зеркал и полосовых фильтров. Для того, чтобы проверить эффективность детектора, мы количественной оценки флуоресценции в популяциях капельных заключающих красители разного цвета и концентрации. Чувствительность системы исследуется для обнаружения одного цвета флуоресцеина, и показывает способность обнаруживать капли с концентрацией до 0,1 нМ, в 200х чувствительности улучшения мovement по сравнению с последними подходами волокна на основе описанных в литературе 7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. SU8 Мастер изготовления

  1. Конструкция Микрожидкостных структуры для изготовления трехслойного с помощью разработки программного обеспечения и имеют конструкции напечатанные поставщика на печатной плате пленки с разрешением 10 мкм. Детали конструкции прибора приведены в прилагаемой ссылке 6 и геометрические формы каналов показаны на рисунке 1. Слои должны включать меток выравнивания , чтобы помочь расстанавливать функции от каждого изготовления слоя 8.
  2. Поместите предварительно очищенную 3 дюйма диаметром кремниевой пластины на спин для нанесения покрытий и включите вакуум, чтобы прикрепить ее к патроне. Нанести 1 мл SU8-3050 в центре пластины и спина в течение 20 сек при 500 оборотах в минуту, а затем 30 с при 1750 оборотах в минуту, обеспечивая толщину слоя 80 мкм.
  3. Удалите пластину и выпекать на 135 & deg; C плитке в течение 30 мин. Дайте вафля остыть до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
  4. Выставляют пластины на 1 - й маски слоя , покрытого под коллимирован- 190 мВт, 365 нм светодиод в течение 3 мин. После экспозиции, поместите пластину на C конфорки 135 ° в течение 1 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
  5. Поместите пластину на спин для нанесения покрытий и включите вакуум, чтобы прикрепить ее к патроне. Нанести 1 мл SU8-3050 в центре пластины и спина в течение 20 сек при 500 оборотах в минуту, а затем 30 с при 5000 оборотах в минуту, в результате чего слой, который обеспечивает дополнительную толщину 40 мкм.
  6. Удалите пластину и испечь на 135 ° C плитке в течение 30 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
  7. Совместите маску 2 - й слой на геометрии узорной в 1.3 и подвергать пластины с покрытием коллимированному 190 мВт, 365 нм светодиода в течение 3 мин. После экспозиции, поместите на 135 ° C плитке в течение 4 мин 30 сек, а затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
  8. Поместите пластину на спин для нанесения покрытий и включите вакуум, чтобы прикрепить ее к патроне. Нанести 1 мл SU8-3050 в центре пластины и спина в течение 20 сек при 500 оборотах в минуту, а затем 30сек при 1000 оборотах в минуту, в результате чего слой, который обеспечивает дополнительную толщину 100 мкм.
  9. Удалите пластину и испечь на 135 ° C плитке в течение 30 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
  10. Совместите маску 3 - го слоя на геометрию узорной в 1.3 и подвергать пластины с покрытием коллимированному 190 мВт, 365 нм светодиода в течение 3 мин. После экспозиции, поместите на 135 ° C плитке в течение 9 мин, а затем охлаждают до комнатной температуры, прежде чем перейти к следующему шагу.
  11. Разработка маски, погружая в перемешиваемой бане монометилового эфира пропиленгликоля ацетата в течение 30 мин. Промыть пластины в изопропаноле и выпекать на 135 ° C плитке в течение 1 мин. Поместите разработанный мастером в 100 мм чашки Петри для полидиметилсилоксана (PDMS) под давлением.

2. PDMS изготовления приборов

  1. Подготовка 10: 1 PDMS путем объединения 50 г силиконового основания с 5 г отвердителя в пластиковую чашку. Смешайте содержимое с помощью роторного инструмента, снабженного перемешивающим палочкой. градусне в качестве смеси внутри эксикаторе в течение 30 мин, или пока все пузырьки воздуха не будут удалены.
  2. Налить PDMS, чтобы дать толщину 3 мм над мастером и поместите обратно в эксикатор для дальнейшей дегазации. После того, как все пузырьки будут удалены, выпекать устройство при температуре 80 ° С в течение 80 мин.
  3. Обрежьте устройство из пресс-формы, используя скальпель и место на чистой поверхности с узорной стороной вверх и удар жидкостный впускные и выпускные отверстия с трепанобиопсия 0,75 мм. Устройство должно быть разрезан таким образом, что высокие геометрий 120 мкм и 220 мкм, доступны со стороны устройства.
  4. Плазменный лечить устройство, с помощью функции стороной вверх, вместе с предварительно очищенную 2 дюйма на 3 дюйма стекло на 1 мбар O 2 плазмы в течение 20 секунд в плазме очиститель 300 Вт. Скрепить устройство PDMS, помещая узорчатую сторону устройства PDMS на плазменной обработки стороне предметного стекла. Поместите устройство в C духовке 80 ° и выпекать собранное устройство в течение 40 мин.
  5. Рендер каналыгидрофобный с помощью шприца для промывки устройства с фторированной обработки поверхности жидкости. Сразу же выпекать устройство при температуре 80 ° С в течение 10 мин для испарения растворителя.

3. Получение оптических компонентов

  1. Подготовьте лазерное волокно возбуждения путем удаления изоляции от последнего 5 мм сердцевины 105 мкм, оболочки 125 мкм, NA = 0,22 оптическое волокно.
  2. Подготовьте 2 - й цветной лазерный волокно возбуждения путем повторения 3.1 для 2 - го идентичного волокна.
  3. Подготовьте волокно для сбора сигнала флуоресценции путем повторения 3.1 для сердцевины 200 мкм, оболочки 225 мкм, NA = 0,39 оптическое волокно.
  4. Проверьте кончики всех волокон - если кончики не заканчиваются на плоской поверхности, повторно расщепляют концы с волокном писца.
  5. Приложить лазерный волоконный ответвитель 50 мВт, 405 нм лазера и прикрепить один из основных волокон к лазеру 105 мкм. Прямой зачищенный конец на датчике мощности лазераметр, и использовать точную настройку лазерного ответвителя, чтобы максимизировать мощность лазера.
  6. Повторите 3.5 для нм лазера 50 мВт, 473.
  7. Смонтировать 446/510/581/703 нм квадроциклов полосовых фильтров на ФЭУ с помощью объектива трубы, чтобы блокировать лазерный луч и передавать испускаемый флуоресценции. Прикрепите волоконный ответвитель так, что свет проходит через фильтры прежде, чем поразить ФЭУ.
  8. Приложите волокно от 3,3 до блока собранного в 3.7.

4. Offline Смешанная Эмульсия Generation

  1. Получить фокус потока микрофлюидики dropmaker устройство с отверстием мкм 60 мкм х 60.
  2. Заполните 1 мл шприц с HFE 7500 масла с 2% ионной фторсодержащего 9.
  3. Заполните серию 1 мл шприцы со следующими комбинациями флуоресцеина (FITC) и декстран-конъюгированные голубых красителей (CB) в PBS: 1 нМ ФИТЦ / 10 нМ CB, 10 нМ ФИТЦ / 10 нМ CB, 1 нМ ФИТЦ / 100 нМ CB, и 10 нМ ФИТЦ / 100 нМ СВ.
  4. Установите устройство dropmaker на сцене перевернутой микроновсправиться и водные и масляные шприцы на шприцевые насосы. Пара шприцы к устройствам с помощью PE-2 трубки.
  5. Запуск шприцевые насосы со скоростью 500 мкл / ч для масла и 250 мкл / ч для водных растворов, создать смесь 80 мкм капель, содержащих растворы с 4,3. Для каждого типа водного образца, используют свежий устройство dropmaker для устранения перекрестного загрязнения. Сбор ~ 200 мкл эмульсии из каждой комбинации красителя в пустой шприц.
  6. После того, как 4 типа капельки были собраны в единую коллекцию шприц, смешайте эмульсию путем многократного вращением шприца.
  7. Повторите шаги 4.2-4.6 с водными растворами, содержащими 0,1, 1, 10 и 100 нМ FITC в PBS.

5. Волоконно-оптические вставки

  1. Поместите микрожидкостных чип, изготовленный на шаге 2 на стадии инвертированного микроскопа в сочетании с цифровой камерой, способной <100 мкс скорости затвора.
  2. тщательно Работая со стороны, InSeк.т. волокно, соединенное с лазером 473 нм в дальний канал вверх по течению 120 мкм, следя за тем, чтобы не через прокол на основной канал потока.
  3. Вставьте волокно, соединенное с лазером 405 нм в самый дальний вниз по течению мкм высокого бокового канала 120, обеспечивая расстояние волокна 300 мкм.
  4. Вставьте ПМТ-соединенный волокно в 220 мкм высотой канала по нормали к двум волокнам лазерного возбуждения.

6. Флуоресцентная Обнаружение смешанных Эмульсии

  1. Монтирование 5 мл шприц, заполненный HFE 7500 с 2% ионной фторсодержащего к распорной входе масла устройства обнаружения с ПЭ-2 трубки.
  2. Установите шприц, содержащий смешанный FITC / CB эмульсии на вертикально ориентированной шприцевой насос, и пара на входе капелька реинжекции устройства с использованием PE-2 трубки. Подключите длину PE-2 трубки от выхода устройства в контейнер для отходов.
  3. Премьер-устройство с помощью не работает каждый из насосов при 1000 мкл / ч до тех пор, какмасла и капельки видно, регулярно совмещая в устройстве и течет вниз по течению.
  4. Регулировка скорости потока таким образом, чтобы распорки масло работает на частоте 6000 мкл / ч и капли в количестве 100 мкл / ч, что обеспечивает значительное расстояние между каплями, проходящих через область детектирования.
  5. Включите лазеров, запустите программу сбора данных, а также регулировки усиления ФЭУ, чтобы обеспечить сигналы, которые более чем 100x базового уровня шума. Регулировка мощности лазера, так что все пики дублетных отчетливо видны на одном, линейно масштабируется timetrace.
  6. Приобретать 60 сек timetrace PMT напряжения по меньшей мере, 20 кГц. Импорт данных в вычислительную программу, такие как Matlab и измерить высоту пиков регистрируемых дублетов с использованием сценария пользовательских вычислений программы.
    Примечание: Это предусмотрено в качестве дополнительной информации.
  7. Повторите шаги 6.2-6.7 с использованием FITC-только смешанную эмульсию, созданную в 4,7, с нм лазер 405 выключен.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Изготовление устройства PDMS , который позволяет для вставки оптических волокон требуется многоэтапную процедуру фотолитографии для создания каналов различной высоты (рисунок 1). Во-первых, высокий слой SU-8 80 мкм формуют на кремниевой подложке и с рисунком, исп?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Обнаружение Оптоволоконный требует выравнивания оптических волокон относительно каналов для текучей среды. Поскольку наше устройство использует каналы программы передач изготавливаемых с многослойным фотолитографии, размещение масок по отношению друг к другу имеет большое значен...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
PhotomasksCadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test gradeUniversity Wafers447
SU-8 3035MicrochemY311074
SU-8 2050MicrochemY111072
Sylgard 184 silicone elastomer kitKrayden4019862
1 ml syringesBD309628
10 ml syringesBD309604
27 gaugue needlesBD305109
PE 2 polyethylene tubingScientific Commodities, Inc.B31695-PE/2
Novec 7500Fisher Scientific98-0212-2928-5Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox SurfactantSynthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dyeLife TechnologiesD-1976
Fluorescein sodium saltSigma28803
Quad bandpass filterSemrockFF01-446/510/581/703-25
PMTThorlabsPMM02
Fiber portThorlabsPAFA-X-4-A
lens tubeThorlabsSM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connectorThorlabsCustom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connectorThorlabsCustom
125 μm fiber stripping toolThorlabsT08S13
225 μm fiber stripping toolThorlabsT10S13
laser fiber adapterOptoEngineFC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mWOptoEngineMDL-III-405Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mWOptoEngineMLL-FN-473-50

Ссылки

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
  3. Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
  4. Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004(2010).
  5. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
  6. Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
  7. Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
  8. Lithography. , Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
  9. DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
  10. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882(2012).
  11. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
  12. Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
  13. Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
  14. Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
  15. Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

111

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены