Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

Resumo

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Resumo

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Introdução

Microfluídica gotículas fornecer uma plataforma em alta biologia rendimento por compartimentar experimentos em um grande número de gotículas aquosas suspensas em uma transportadora de petróleo ^1. Gotas têm sido utilizados para aplicações tão variadas como a análise de células individuais ^2, reacção em cadeia da polimerase digitais (PCR), ^3, e ⁴ evolução da enzima. ensaios fluorescentes são o modo padrão de detecção para microfluídica gota, como os seus sinais luminosos e tempo de resposta rápido são compatíveis com a detecção de volumes de gotículas sub-nanolitros a taxas kilohertz. Muitas aplicações exigem a detecção de fluorescência de pelo menos duas cores em simultâneo. Por exemplo, o nosso laboratório vulgarmente PCR realiza-activada de gotículas triagem experiências que utilizam um canal de detecção para o resultado de um ensaio, e utiliza um corante de fundo secundário para fazer gota-ensaio negativo contáveis ^​​5.

estações de detecção típicos para microfluídica gotículas são based em microscópios de epifluorescência, e exigem complicados esquemas de manipulações de luz para introduzir luz de excitação de lasers de espaço livre no microscópio a ser focada na amostra. Depois de fluorescência é emitida a partir de uma gotícula, a luz de fluorescência emitida é filtrada de modo a que cada canal de detecção utiliza um tubo fotomultiplicador (PMT) centrada sobre uma banda de comprimento de onda. sistemas de detecção óptica de epifluorescência baseado em microscópio fornecer uma barreira à entrada devido à sua custa, a complexidade ea manutenção necessária. As fibras ópticas dispõem de meios para construir um esquema de detecção simplificada e robusto, uma vez que as fibras podem ser inseridas manualmente em dispositivos de microfluidos, eliminando a necessidade de encaminhamento de luz à base de espelho, e permitindo caminhos de luz para ser interligado através de conectores de fibra óptica.

Neste trabalho, nós descrevemos a montagem e validação de um sistema compacto e modular para realizar detecção de fluorescência multicolor, utilizando uma rede de fibras ópticas de umda fotodetector única ^6. As fibras ópticas são acoplados aos lasers individuais e são inseridos normal a um canal de escoamento em forma de L em deslocamentos espaciais regulares. Uma fibra de recolha de fluorescência é orientada paralelamente às regiões de excitação e é ligado a um único PMT. Uma vez que uma gotícula passa através dos feixes de laser em momentos diferentes, os dados registados pelo PMT mostra um deslocamento temporal, que permite ao utilizador fazer a distinção entre a fluorescência emitida após a gotícula é excitada por cada feixe de laser distinta. Este deslocamento temporal, elimina a necessidade de separar a luz emitida PMTs separadas utilizando uma série de espelhos dicróicos e filtros passa-banda. Para validar a eficácia do detector, que quantificar fluorescência em populações de gotículas de encapsulação de corantes de cor diferente e concentração. A sensibilidade do sistema é investigada para detecção de cor única fluoresceína, e mostra a capacidade de detectar gotículas com concentrações de até 0,1 nm, uma sensibilidade impr 200xovement quando comparado a uma fibra baseada recentes relatados na literatura ^7.

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Protocolo

1. SU8 Fabricação Mestre

1. Projetar as estruturas microfluídicos para fabricação de três camadas usando software de design e têm os desenhos impressos por um fornecedor em filme placa de circuito com resolução de 10 m. Os detalhes da concepção do dispositivo são dadas em uma referência em anexo ⁶ e as geometrias de canal são mostradas na Figura 1. As camadas deverá incluir marcas de alinhamento para ajudar a colocar características de cada camada de fabricação ^8.
2. Coloque um wafer de silício diâmetro pré-limpeza de 3 polegadas em um revestidor de rotação e ligar o vácuo para apor-lo para o mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 no centro da bolacha e centrifugação durante 20 segundos a 500 rpm, em seguida 30 segundos a 1750 rpm, proporcionando uma espessura de camada de 80 um.
3. Remover a bolacha e assar em uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 30 min. Permitir que o wafer arrefecer à RT antes de passar para a próxima etapa.
4. Expor o wafer revestido para o ^st máscara 1 camada sob a colimado 190 mW, LED 365 nm durante 3 minutos. Após a exposição, colocar a pastilha em uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 1 min, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de prosseguir para o passo seguinte.
5. Coloque o wafer sobre o coater rotação e ligar o vácuo para apor-lo para o mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 no centro da bolacha e centrifugação durante 20 segundos a 500 rpm, em seguida 30 segundos a 5000 rpm, o que resulta em uma camada que proporciona uma espessura adicional de 40 uM.
6. Remover a bolacha e coza numa placa de aquecimento 135 ° C durante 30 min, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de passar para a próxima etapa.
7. Alinhar a camada de máscara 2 ^nd para a geometria modelada em 1.3 e expor a pastilha revestida a uma colimado 190 mW, a 365 nm LED durante 3 min. Após a exposição, colocar sobre uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 4 min 30 s, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de prosseguir para o passo seguinte.
8. Coloque o wafer sobre o coater rotação e ligar o vácuo para apor-lo para o mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3050 no centro da bolacha e centrifugação durante 20 segundos a 500 rpm, em seguida, 30segundos a 1000 rpm, o que resulta em uma camada que proporciona uma espessura adicional de 100 um.
9. Remover a bolacha e coza numa placa de aquecimento 135 ° C durante 30 min, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de passar para a próxima etapa.
10. Alinhar a camada de máscara 3 ^rd na geometria modelada em 1.3 e expor a pastilha revestida a uma colimado 190 mW, a 365 nm LED durante 3 min. Após a exposição, colocar sobre uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 9 minutos, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de prosseguir para o passo seguinte.
11. Desenvolver as máscaras por imersão num banho em agitação de acetato de éter propilenoglicol monometílico, durante 30 min. Lava-se a bolacha em isopropanol e coza numa placa de aquecimento 135 ° C durante 1 min. Coloque o mestre desenvolvido em uma placa de Petri de 100 mm para polidimetilsiloxano moldagem (PDMS).

2. PDMS fabricação de dispositivos

1. Preparar 10: 1 PDMS pela combinação de 50 g de base de silicone com 5 g de agente de cura em um copo de plástico. Misture o conteúdo com uma ferramenta rotativa equipada com uma vareta. degmedida que a mistura no interior de um exsicador durante 30 minutos, ou até que todas as bolhas de ar são removidas.
2. Despeje o PDMS para dar uma espessura de 3 mm sobre o mestre e coloque de volta para o secador durante mais de desgaseificação. Uma vez que todas as bolhas são removidas, o dispositivo de cozer a 80 ° C durante 80 min.
3. Cortar o dispositivo a partir do molde utilizando um bisturi e coloque sobre uma superfície limpa com o lado estampado para cima e perfurar as entradas e saídas fluídicos com um soco biópsia 0,75 mm. O dispositivo tem de ser cortado de modo a que os 120 uM e 220 uM geometrias altos são acessíveis a partir do lado do dispositivo.
4. Plasma tratar o dispositivo, com o lado recurso acima, juntamente com um pré-limpas 2 polegadas por 3 polegadas lâmina de vidro a 1 mbar O ₂ plasma durante 20 segundos em um aspirador de plasma 300 W. Unir o dispositivo de PDMS, colocando o lado modelado do dispositivo PDMS para o lado tratado com plasma da lâmina de vidro. Colocar o dispositivo num forno de 80 ° C e assar o dispositivo montado, durante 40 min.
5. Tornar os canaishidrofóbica usando uma seringa para irrigar o dispositivo com um fluido de tratamento de superfície fluorado. Imediatamente cozer o dispositivo a 80 ° C durante 10 minutos para evaporar o solvente.

3. Preparação de componentes ópticos

1. Prepara-se o laser de fibra de excitação através da remoção do isolamento a partir da última 5mm de um núcleo 105 uM, 125 uM de revestimento, NA = 0,22 fibra óptica.
2. Prepare a fibra de excitação laser a cores 2 ^nd repetindo 3.1 para uma fibra idêntica ^2º.
3. Preparar a fibra de recolha do sinal de fluorescência pela repetição 3,1 para um núcleo de 200 um, 225 uM de revestimento, NA = 0,39 fibra óptica.
4. Inspecione as pontas de todas as fibras - se as dicas não terminam em uma superfície plana, re-unir as extremidades com um escriba fibra.
5. Anexar um acoplador de fibra de laser a um 50 mW, 405 nm do laser e anexar um dos 105 mm fibras do núcleo para o laser. Direcionar a extremidade descarnada para o sensor da potência do lasermetro, e usar os ajustes finos do acoplador laser para maximizar a potência do laser.
6. Repetir para 3,5 nm de um laser de 50 mW, 473.
7. Montar uma 446/510/581/703 filtros de banda quad nm na PMT utilizando tubos de lente para bloquear a luz do laser e transmitir fluorescência emitida. Ajustar o engate de fibra de modo que a luz viaja através dos filtros antes de bater a PMT.
8. Anexar a fibra de 3,3 a unidade montada em 3.7.

4. offline Mixed Geração Emulsion

1. Obter um dispositivo de microfluidos dropmaker foco de fluxo com um orifício de 60 x 60 mm uM.
2. Encha uma seringa de 1 ml com HFE 7500 óleos com 2% fluorado iônica ^9.
3. Encha uma série de seringas de 1 ml com as seguintes combinações de fluoresceína (FITC) e corantes azul de dextrano conjugado (CB) em PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM de FITC / 10 nM CB, 1 nM de FITC / 100 nM CB, e 10 nM com FITC / 100 nM CB.
4. Montar o dispositivo dropmaker no palco de um micros invertidaslidar e as seringas aquosos e óleo sobre bombas de seringa. Casal das seringas para os dispositivos que utilizam tubos PE-2.
5. Executando bombas de seringa a 500 mL / h para o óleo e 250 ul / h durante as soluções aquosas, criar uma mistura de 80 uM gotículas contendo as soluções de 4,3. Para cada tipo de amostra aquosa, utilizar um dispositivo dropmaker fresco para eliminar a contaminação cruzada. Recolhe ~ 200 ul de emulsão a partir de cada combinação de corante para uma seringa vazia.
6. Após os 4 tipos gotas foram coletadas em uma única seringa coleção, misturar a emulsão girando repetidamente a seringa.
7. Repita os passos 4,2-4,6 com soluções aquosas contendo 0,1, 1, 10, e 100 nM com FITC em PBS.

5. Optical Fiber Inserção

1. Coloque o chip microfluídico fabricados no passo 2 no palco de um microscópio invertido acoplado com uma câmera digital capaz de <100 ms velocidades do obturador.
2. Trabalhando com cuidado de lado, inseta a fibra acoplado ao laser de 473 nm no montante de 120 canais mais distante mm, tomando cuidado para não perfurar até o canal de fluxo principal.
3. Inserir a fibra acoplado ao laser de 405 nm no canal 120 uM alta lado mais distante a jusante, fornecendo o espaçamento da fibra de 300 mm.
4. Inserir a fibra PMT-associado no canal 220 uM de altura normal, para as duas fibras de excitação de laser.

6. detecção de fluorescência de emulsões mistas

1. Montar uma seringa de 5 ml cheio com HFE 7500 com 2% de surfactante fluorado iónica à entrada de óleo espaçador do dispositivo de detecção com tubagem PE-2.
2. Monte a seringa contendo a emulsão / CB mista FITC em uma bomba de seringa orientado verticalmente e casal a entrada de gota reinjeção do dispositivo utilizando tubagem PE-2. Conectar um comprimento de tubagem PE-2 a partir da saída do dispositivo a um recipiente de resíduos.
3. Primeiro o dispositivo rodando cada uma das bombas em 1000 uL / ​​hr até tantoóleo e as gotas são vistos para ser combinando regularmente no dispositivo e de fluxo a jusante.
4. Ajustar as taxas de fluxo de modo que o óleo espaçador funciona a 6.000 l / h e as gotas a 100 l / h, proporcionando espaçamento significativa entre gotículas viajam através da região de detecção.
5. Ligue os lasers, iniciar o programa de aquisição de dados e ajustar o ganho de PMT para fornecer sinais que são mais de 100 vezes o ruído da linha de base. Ajustar a potência do laser de modo a que todos os picos doublet são claramente visíveis em um único timetrace, linearmente dimensionado.
6. Adquirir 60 seg do timetrace tensão PMT em pelo menos 20 kHz. Importe os dados em programa de computação, tais como Matlab e medir as alturas dos picos das dobletes gravados a partir do roteiro de programa de computação personalizado.
   NOTA: Este é fornecido como informação suplementar.
7. Repita os passos de 6,2-6,7 usando o FITC-only emulsão mista criada em 4.7, com o laser de 405 nm desligado.

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Resultados

A fabricação de um dispositivo de PDMS que permite a inserção de fibras ópticas exige um processo de passos múltiplos a fotolitografia para criar canais de altura variável (Figura 1). Em primeiro lugar, uma camada de 80 um de altura de SU-8 é girada sobre uma bolacha de silício e modelado utilizando uma máscara para criar a geometria de manipulação de fluidos. Em seguida, um 40 um camada adicional de SU-8 é girado para a bolacha, e modelado usando uma segund...

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Discussão

detecção de fibra óptica requer o alinhamento das fibras ópticas com respeito a canais de fluido. Uma vez que o nosso dispositivo utiliza canais de guia fabricadas com fotolitografia multicamada, a colocação de máscaras com relação um ao outro é de grande importância. Se os canais de guia de fibra são demasiado perto do canal de fluido, existe um potencial para a fuga de fluido; Se os canais de guia estão localizados muito longe ou desalinhado, o sinal de fluorescência recolhida pela fibra de detecção po...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Photomasks	CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade	University Wafers	447
SU-8 3035	Microchem	Y311074
SU-8 2050	Microchem	Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Krayden	4019862
1 ml syringes	BD	309628
10 ml syringes	BD	309604
27 gaugue needles	BD	305109
PE 2 polyethylene tubing	Scientific Commodities, Inc.	B31695-PE/2
Novec 7500	Fisher Scientific	98-0212-2928-5	Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant			Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye	Life Technologies	D-1976
Fluorescein sodium salt	Sigma	28803
Quad bandpass filter	Semrock	FF01-446/510/581/703-25
PMT	Thorlabs	PMM02
Fiber port	Thorlabs	PAFA-X-4-A
lens tube	Thorlabs	SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector	Thorlabs	Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector	Thorlabs	Custom
125 μm fiber stripping tool	Thorlabs	T08S13
225 μm fiber stripping tool	Thorlabs	T10S13
laser fiber adapter	OptoEngine	FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW	OptoEngine	MDL-III-405	Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW	OptoEngine	MLL-FN-473-50