Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche

Riepilogo

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Abstract

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Introduzione

Microfluidica gocciolina forniscono una piattaforma per alta biologia throughput compartimenti esperimenti in un gran numero di goccioline acquose sospese in un olio vettore ^1. Goccioline sono stati utilizzati per applicazioni vari come singola analisi cella ^2, la reazione a catena della polimerasi digitale (PCR) ^3, ed enzimi evoluzione ^4. saggi fluorescenti sono la modalità standard di rilevamento per microfluidica di gocce, come i loro segnali luminosi e tempo di risposta veloce sono compatibili con la rilevazione dei volumi goccioline sub-nanolitri a tassi kilohertz. Molte applicazioni richiedono il rilevamento della fluorescenza per almeno due colori simultaneamente. Per esempio, il nostro laboratorio esegue comunemente PCR-attivata esperimenti gocciolina ordinamento che utilizzano un canale di rilevamento per il risultato di un test, e utilizza uno sfondo tintura secondaria per rendere gocciolina test negativo numerabile ^5.

stazioni di rilevamento tipiche per microfluidica droplet sono based su microscopi epifluorescenza, e richiedono complicati sistemi di manipolazioni di luce per introdurre luce di eccitazione da laser spazio libero nel microscopio ad essere focalizzata sul campione. Dopo fluorescenza viene emessa da una goccia, la luce emessa fluoresced è filtrato in modo che ciascun canale di rilevamento utilizza un tubo fotomoltiplicatore (PMT) centrata su una banda di lunghezze d'onda. sistemi di rilevamento ottico epifluorescenza microscopio a base di fornire una barriera all'ingresso a causa della loro spese, la complessità e la manutenzione necessari. Fibre ottiche forniscono i mezzi per costruire un sistema di rilevamento semplificata e robusta, in quanto le fibre possono essere inseriti manualmente in dispositivi microfluidici, eliminando la necessità di instradamento specchio luce-based, e consentendo percorsi di luce da interfacciare tramite connettori di fibre ottiche.

In questo articolo, si descrive l'assemblaggio e la validazione di un sistema di compatto e modulare per eseguire il rilevamento della fluorescenza multicolore utilizzando una vasta gamma di fibre ottiche unda singola cellula fotoelettrica ^6. Le fibre ottiche sono accoppiati alle singole laser e sono inseriti normale ad un canale di flusso a forma di L in offset spaziali regolare. Una fibra raccolta fluorescenza è orientato parallelamente alle regioni di eccitazione ed è collegato ad un singolo PMT. Poiché una gocciolina passa attraverso i raggi laser in tempi diversi, i dati registrati dal PMT mostra un temporale di offset che consente all'utente di distinguere tra la fluorescenza emessa dopo la gocciolina viene eccitato da ciascun fascio laser distinti. Questo spostamento temporale elimina la necessità di separare la luce emessa PMT separate mediante una serie di specchi dicroici e filtri passa-banda. Per convalidare l'efficacia del rivelatore, abbiamo quantificare la fluorescenza nelle popolazioni gocciolina incapsulanti tinture di colore e concentrazione diversa. La sensibilità del sistema è studiato per il rilevamento singolo colore fluoresceina, e dimostra la capacità di rilevare goccioline con concentrazioni fino a 0,1 nM, una sensibilità impr 200xovement rispetto agli approcci a base di fibre recenti riportati in letteratura ^7.

Protocollo

1. SU8 Maestro Fabrication

1. Progettare le strutture microfluidica per la fabbricazione di tre strati che utilizzano software di progettazione e hanno i disegni stampati da un fornitore su pellicola circuito con risoluzione di 10 micron. I dettagli della progettazione dei dispositivi sono forniti in un riferimento collegato ⁶ e le geometrie dei canali nella figura 1. Gli strati dovrebbero includere segni di allineamento per aiutare colloca caratteristiche di ogni strato fabbricazione ^8.
2. Posizionare un wafer di silicio del diametro di 3 pollici di pre-pulizia su un dispositivo a induzione giro e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, poi 30 sec a 1.750 rpm, fornendo uno spessore di 80 micron.
3. Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 min. Lasciare il wafer raffreddare a RT prima di passare alla fase successiva.
4. Esporre il wafer rivestito alla ^st maschera 1 strato sotto un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l'esposizione, posizionare il wafer su una piastra C 135 ° per 1 min, poi raffreddare a RT prima di procedere alla fase successiva.
5. Posizionare la cialda sul dispositivo a induzione di spin e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, quindi 30 secondi a 5000 rpm, risultando in un livello che fornisce uno spessore supplementare di 40 micron.
6. Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 minuti, poi raffreddare per RT prima di passare alla fase successiva.
7. Allineare la maschera di livello 2 ^° sulla geometria di fantasia in 1.3 ed esporre il wafer rivestito per un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l'esposizione, posto su una piastra C 135 ° per 4 minuti e 30 secondi, poi raffreddare per RT prima di procedere alla fase successiva.
8. Posizionare la cialda sul dispositivo a induzione di spin e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, poi 30sec a 1.000 giri, risultando in un livello che fornisce uno spessore supplementare di 100 micron.
9. Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 minuti, poi raffreddare per RT prima di passare alla fase successiva.
10. Allineare la maschera di livello 3 ^° sulla geometria di fantasia in 1.3 ed esporre il wafer rivestito per un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l'esposizione, posto su una piastra C 135 ° per 9 minuti, poi raffreddare per RT prima di procedere alla fase successiva.
11. Sviluppare le maschere immergendo in un bagno agitata di propilenglicole monometiletere acetato per 30 min. Lavare il wafer in isopropanolo e cuocere su una piastra C 135 ° per 1 min. Posizionare il maestro sviluppato in una capsula di Petri 100 mm per polidimetilsilossano (PDMS) stampaggio.

2. PDMS fabbricazione di dispositivi

1. Preparare 10: 1 PDMS combinando 50 g di base siliconica con 5 g di catalizzatore in una tazza di plastica. Mescolare il contenuto con un utensile rotante dotato di un bastoncino. degquando la miscela in un essiccatore per 30 minuti, o fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse.
2. Versare il PDMS per dare uno spessore di 3 mm sopra il master e inserire di nuovo nel essiccatore per un ulteriore degasaggio. Una volta che tutte le bolle vengono rimossi, cuocere il dispositivo a 80 ° C per 80 min.
3. Tagliare il dispositivo dallo stampo utilizzando un bisturi e posto su una superficie pulita con il lato modellato e pugni gli ingressi e le uscite fluidici con un pugno biopsia 0,75 millimetri. Il dispositivo deve essere tagliato in modo che i 120 micron e 220 micron geometrie alte sono accessibili dal lato del dispositivo.
4. Plasma trattare il dispositivo, con il lato caratteristica, insieme con un pre-puliti 2 pollici da 3 pollici vetrino a 1 mbar O ₂ al plasma per 20 secondi in un pulitore di plasma di 300 W. Incollare il dispositivo PDMS ponendo il lato modellato del dispositivo PDMS sul lato plasma trattata del vetrino. Posizionare il dispositivo in forno a 80 ° e cuocere il dispositivo montato per 40 min.
5. Render i canaliidrofobica utilizzando una siringa per sciacquare il dispositivo con un fluido di trattamento superficiale fluorurato. cuocere immediatamente il dispositivo a 80 ° C per 10 minuti per evaporare il solvente.

3. Preparazione di componenti ottici

1. Preparare la fibra di eccitazione laser rimuovendo l'isolamento dall'ultima 5 mm a 105 micron nucleo, 125 rivestimento micron, NA = 0,22 fibra ottica.
2. Preparare il 2 ^° laser a colori in fibra di eccitazione ripetendo 3.1 per un 2 ^° fibra identici.
3. Preparare la fibra per raccogliere il segnale di fluorescenza ripetendo 3.1 di 200 micron nucleo, 225 rivestimento micron, NA = 0,39 fibra ottica.
4. Ispezionare le punte di tutte le fibre - se le punte non terminano in una superficie piana, ri-fendere le estremità con uno scriba fibra.
5. Attaccare un accoppiatore fibra laser a 50 mW, 405 nm laser e collegare uno dei 105 micron fibre nucleo al laser. Dirigere il fine spogliato verso il sensore della potenza del lasermetro, e usare le regolazioni fini del copulante laser per massimizzare la potenza del laser.
6. Ripetere 3.5 per un laser nm 50 mW, 473.
7. Montare un 446/510/581/703 nm filtri passa-banda quad sulla PMT utilizzando tubi di lenti per bloccare la luce del laser e trasmettere fluorescenza emessa. Fissare fibra accoppiatore in modo che la luce viaggia attraverso i filtri prima di colpire il PMT.
8. Fissare la fibra da 3,3 all'unità assemblati in 3.7.

4. Offline misto Emulsione Generation

1. Ottenere un dispositivo di microfluidica dropmaker fuoco flusso con un 60 micron x 60 micron orifizio.
2. Riempire una siringa da 1 ml con HFE 7500 oli con 2% fluoro ionico ^9.
3. Riempire una serie di 1 ml siringhe con le seguenti combinazioni di fluoresceina (FITC) e destrano coniugato coloranti blu (CB) in PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB, e 10 nM FITC / 100 nM CB.
4. Montare il dispositivo dropmaker sul palco di un micro invertitifar fronte e le siringhe acquosi e olio su pompe a siringa. Coppia le siringhe ai dispositivi che utilizzano PE-2 tubi.
5. Esecuzione pompe a siringa a 500 microlitri / hr per l'olio e 250 microlitri / hr per le soluzioni acquose, crea una miscela di 80 micron goccioline contenenti le soluzioni da 4.3. Per ogni tipo di campione acquoso, utilizzare un dispositivo dropmaker fresca per evitare contaminazioni. Raccogliere ~ 200 ml di emulsione da ogni combinazione colorante in una siringa vuota.
6. Dopo 4 tipi goccioline sono stati raccolti in una singola siringa raccolta, mescolare l'emulsione ripetutamente ruotando la siringa.
7. Ripetere i passaggi 4,2-4,6 con soluzioni acquose contenenti 0,1, 1, 10, e 100 nM FITC in PBS.

5. Fibra ottica Inserimento

1. Posizionare il chip microfluidico fabbricato nella fase 2 sul palcoscenico di un microscopio invertito accoppiato con una fotocamera digitale in grado di <100 msec tempi di posa.
2. Lavorare con attenzione di lato, Insert la fibra accoppiata al laser 473 nm in 120 canale più lontano upstream micron, facendo attenzione a non forare attraverso il canale di flusso principale.
3. Inserire la fibra accoppiata al laser 405 nm nel 120 micron canale di alta lato più a valle, fornendo la spaziatura fibra di 300 micron.
4. Inserire la fibra PMT-accoppiato nel 220 micron di altezza canale normale per le due fibre di eccitazione laser.

6. Rilevazione fluorescenza di emulsioni misti

1. Montare una siringa da 5 ml riempito con HFE 7500 con 2% fluoro ionico all'ingresso dell'olio distanziale del dispositivo di rilevazione con PE-2 tubi.
2. Montare la siringa contenente il misto FITC / CB emulsione su una pompa a siringa con orientamento verticale e di coppia di ingresso di gocce di reiniezione del dispositivo utilizzando PE-2 tubi. Collegare un tratto di tubo PE-2 dall'uscita dispositivo ad un contenitore per rifiuti.
3. Prime dispositivo eseguendo ciascuna delle pompe a 1.000 ml / h fino a quando entrambipetrolio e goccioline sono visti da combinare regolarmente nel dispositivo e che scorre a valle.
4. Regolare le portate in modo tale che l'olio distanziale corre a 6.000 ml / hr e le goccioline a 100 l / h, che fornisce notevole spaziatura tra le goccioline che viaggiano attraverso la regione di rilevamento.
5. Accendere i laser, avviare il programma di acquisizione dei dati, e regolare il guadagno PMT per fornire segnali che sono più di 100 volte il rumore di fondo della linea di base. Regolare la potenza del laser in modo che tutti i picchi doppietto sono chiaramente visibili una singola, timetrace linearmente scalato.
6. Acquisire 60 sec del timetrace tensione di PMT ad almeno 20 kHz. Importare i dati in programma di calcolo come Matlab e misurare le altezze dei picchi dei doppietti registrati utilizzando lo script del programma di calcolo personalizzato.
   NOTA: Questo è fornito come informazioni supplementari.
7. Ripetere i passaggi 6,2-6,7 con il FITC solo emulsione mista creata in 4.7, con il laser 405 nm spento.

Risultati

Realizzazione di un dispositivo PDMS che permette l'inserimento di fibre ottiche richiede una procedura di fotolitografia multistep per creare canali di diversa altezza (figura 1). Innanzitutto, un 80 micron alto strato di SU-8 è filata su un wafer di silicio e modellato usando una maschera per creare la geometria gestione dei fluidi. Quindi, un ulteriore strato di 40 micron di SU-8 è filata sul wafer, e modellato usando una seconda maschera per creare caratteristi...

Discussione

rilevamento a fibre ottiche richiede l'allineamento delle fibre ottiche rispetto ai canali di fluido. Poiché il nostro dispositivo utilizza canali di guida fabbricati con fotolitografia multistrato, collocamento di maschere rispetto all'altro è di grande importanza. Se i canali di guida fibra sono troppo vicino al canale del fluido, vi è un potenziale di fuoriuscita di fluido; se i canali di guida sono situate troppo lontano o disallineata, il segnale di fluorescenza raccolte dalla fibra rilevamento può esse...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Photomasks	CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade	University Wafers	447
SU-8 3035	Microchem	Y311074
SU-8 2050	Microchem	Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Krayden	4019862
1 ml syringes	BD	309628
10 ml syringes	BD	309604
27 gaugue needles	BD	305109
PE 2 polyethylene tubing	Scientific Commodities, Inc.	B31695-PE/2
Novec 7500	Fisher Scientific	98-0212-2928-5	Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant			Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye	Life Technologies	D-1976
Fluorescein sodium salt	Sigma	28803
Quad bandpass filter	Semrock	FF01-446/510/581/703-25
PMT	Thorlabs	PMM02
Fiber port	Thorlabs	PAFA-X-4-A
lens tube	Thorlabs	SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector	Thorlabs	Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector	Thorlabs	Custom
125 μm fiber stripping tool	Thorlabs	T08S13
225 μm fiber stripping tool	Thorlabs	T10S13
laser fiber adapter	OptoEngine	FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW	OptoEngine	MDL-III-405	Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW	OptoEngine	MLL-FN-473-50