Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Özet

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Özet

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Giriş

Damlacık Mikroakiskan bir taşıyıcı yağ ¹ içinde süspansiyon haline sulu damlacıkların çok sayıda deney bölümlere yüksek verimli biyoloji için bir platform sağlar. Damlacıklar tek bir hücre analizi ^2, dijital polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ³ gibi çeşitli uygulamalarda kullanılan ve evrim ⁴ enzim edilmiştir. Parlak sinyaller ve hızlı zaman yanıtı kilohertz oranlarında alt nanoliter damlacık hacimleri tespit uyumlu olarak Floresan tahlilleri, damlacık Mikroakiskan için algılama standart modu bulunmaktadır. Birçok uygulama, aynı anda en az iki renk için floresans algılama gerektirir. Örneğin, bizim laboratuar yaygın bir tahlil sonucu için bir algılama kanalı kullanmak damlacık sıralama deneyleri PCR aktive gerçekleştirir ve ⁵ tahlil negatif damlacık sayılabilir yapmak için ikincil bir arka plan boya kullanır.

damlacık Mikroakiskan için tipik algılama istasyonları ba vardırEpifloresans mikroskoplar üzerinde sed ve numune odaklı olmak mikroskop içine boş alan lazerler uyarma ışık tanıtmak için ışık manipülasyonlar düzenleri karmaşık gerektirir. floresan bir damlacık yayılan sonra her algılama kanalı dalgaboyu bandında merkezli bir photomultiplier tüp (PMT) kullanır, böylece yayılan fluoresced ışık süzülür. Epifloresans mikroskop tabanlı optik algılama sistemleri nedeniyle gider, karmaşıklık girişine bir bariyer sağlar ve bakım gereklidir. Optik fiberler fiberler elle ayna tabanlı ışık yönlendirme ihtiyacını ortadan kaldırarak, ve ışık yolları fiber optik konnektörleri kullanarak arabirim sağlayan mikroakışkan cihazlar eklenebilir çünkü araçlar, basitleştirilmiş ve sağlam algılama düzeni inşa etmek sağlarlar.

Bu yazıda, optik fiberler An bir dizi kullanarak çok renkli floresan algılama gerçekleştirmek için kompakt ve modüler bir düzeni montaj ve doğrulama tarifda tek fotodetektör ^6. Optik fiberler bağımsız lazer bağlanır ve düzenli mekansal uzaklıklar bir L şeklinde bir akış kanalına dik yerleştirilir. Bir flüoresan toplama fiber uyarım bölgelerine paralel yönlendirilmiş olan ve tek bir PMT bağlanır. Bir damlacık farklı zamanlarda lazer ışınları geçer, çünkü PMT tarafından kaydedilen veriler zamansal kullanıcı damlacık her ayrı lazer ışını tarafından heyecan sonra yayılan floresan ayırt sağlar ofset gösterir. Bu zamansal kayma dikroik aynalar ve bant geçiren filtreler bir dizi kullanarak ayrı Proje Yönetim Ekipleri yayılan ışık ayırmak için gereksinimini ortadan kaldırır. Dedektörün etkinliğini doğrulamak için, biz farklı renk ve konsantrasyon boyalar encapsulating damlacık popülasyonlarında floresan ölçmek. sistemin duyarlılığı tek renkli floresan saptama için incelenmiş, ve 0.1 nM bir 200x hassasiyet göstr kadar konsantrasyonlarda damlacıklar tespit edilebildiğini gösterirLiteratürde ⁷ bildirilen son elyaf bazlı yaklaşımlar karşılaştırıldığında ovement.

Protokol

1. SU8 Ana Fabrikasyon

1. tasarım yazılımı kullanarak üç katmanlı imalat için mikroakışkan yapıları tasarlamak ve 10 mikron çözünürlükte devre kartı film üzerine bir satıcı tarafından basılan tasarımları var. Cihaz tasarımı detayları ekli referans ^6'da verilmiştir ve kanal geometrileri, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Katmanlar, her imalat tabaka ^8'den özellikleri yan yana koymak yardımcı hizalama işaretleri içermelidir.
2. spin kaplayıcı bir ön temizliği 3 inç çaplı silisyum gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. 80 um bir tabaka kalınlığına sağlayan 1,750 rpm'de daha sonra, 30 saniye, 500 rpm'de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde SU8-3050 1 ml uygulanır.
3. gofret çıkarın ve 30 dakika süre ile 135 ° C sıcak plaka üzerinde pişirilir. gofret sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
4. Bir paralel 190 m altında ^1. katman maskesine kaplı gofret Açığa3 dakika için LED mil W, 365. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 1 dakika boyunca oda sonra serin bir 135 ° C sıcak plaka üzerinde gofret yerleştirin.
5. Spin lak gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. 40 um'lik bir ek kalınlık sağlayan bir tabaka ile sonuçlanan, 5,000 rpm'de daha sonra, 30 saniye, 500 rpm'de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde SU8-3050 1 ml uygulanır.
6. Bir sonraki adıma geçmeden önce, 30 dakika boyunca 135 ° C sıcak plaka üzerinde oda sıcaklığına daha sonra soğuk gofret ve fırında çıkarın.
7. 1.3 desenli geometri üzerine ^2. katman maskesi hizalayın ve 3 dakika boyunca LED nm bir paralel 190 mW, 365 kaplanmış gofret maruz bırakmaktadır. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 4 dakika 30 saniye boyunca 135 ° C ocak üzerinde RT sonra serin yerleştirin.
8. Spin lak gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. daha sonra, 500 rpm'de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde 30 SU8-3050 1 ml uygulamasan 1000 rpm'de, 100 um bir ek kalınlık sağlayan bir tabaka elde edilir.
9. Bir sonraki adıma geçmeden önce, 30 dakika boyunca 135 ° C sıcak plaka üzerinde oda sıcaklığına daha sonra soğuk gofret ve fırında çıkarın.
10. 1.3 desenli geometri üzerine ^3. katman maskesi hizalayın ve 3 dakika boyunca LED nm bir paralel 190 mW, 365 kaplanmış gofret maruz bırakmaktadır. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 9 dakika süreyle 135 ° C ocak üzerinde RT sonra serin yerleştirin.
11. 30 dakika boyunca, propilen glikol monometil eter asetat içinde karıştırılan bir banyoda daldırarak maskeleri geliştirir. 1 dakika için 135 ° C bir sıcak plaka üzerindeki izopropanol ve fırında gofret yıkayın. polidimetilsiloksan (PDMS) kalıplama için 100 mm Petri kabındaki geliştirilen usta yerleştirin.

2. PDMS Cihaz İmalatı

1. plastik bir kap içinde sertleştirici 5 g silikon taban 50 g birleştirerek 1 PDMS: 10 hazırlayın. Bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir döner aracı ile içeriğini karıştırın. deg30 dakika boyunca bir desikatör içinde karışım olarak veya tüm hava kabarcıkları bertaraf kadar devam eder.
2. Master üzerinde 3 mm kalınlığında vermek ve daha fazla gaz alma için desikatörde geri yerleştirmek için PDMS dökün. Bir kez tüm kabarcıklar kaldırılır, 80 dakika boyunca 80 ° C 'de cihaz fırında.
3. desenli tarafı ile temiz bir yüzey üzerinde bir neşter ve yer kullanarak kalıp cihazı kesin ve 0.75 mm'lik biyopsi yumruk ile akışkan giriş ve çıkış yumruk. 120 mikron ve 220 mikron boyunda geometrileri cihazın yan erişilebilir, böylece cihaz kesmek gerekir.
4. Plazma 300 W plazma temizleyici 20 saniye boyunca 1 mbar O ₂ plazmada 3 inç cam slayt tarafından önceden temizlenmiş 2 inç ile birlikte yukarı özelliği tarafı, cihazı davranın. cam slayt plazma ile işlenmiş yüzüne PDMS cihazın desenli tarafını yerleştirerek PDMS cihaz Bond. 80 ° C sıcaklıkta fırında Cihazı ve 40 dakika boyunca monte edilmiş cihazın fırında.
5. kanal Renderflorlanmış bir yüzey işleme sıvısı ile cihaz temizlemek için bir şırınga kullanılarak hidrofobik. 10 dakika çözücünün buharlaşması için hemen 80 ° C'de cihazı fırında.

Optik Bileşenleri 3. hazırlanması

1. 105 mikron çekirdek, 125 mikron kaplama son 5 mm yalıtımı kaldırarak lazer uyarma lif hazırlayın, NA 0.22 fiber optik =.
2. Bir ^2. özdeş elyaf için 3.1 tekrarlayarak ^2. renkli lazer uyarma fiber hazırlayın.
3. 200 mikron çekirdek, 225 mikron kaplama için 3.1 yineleyerek floresan sinyalini toplamak için fiber hazırlayın, NA 0.39 fiber optik =.
4. ipuçları düz bir yüzeye sona yoksa, bir lif çubukla uçları yeniden tutunmaya - tüm liflerin ipuçlarını inceleyin.
5. 50 mW, 405 nm lazer lazer fiber bağlayıcı takın ve lazer 105 mikron çekirdek liflerinin birini ekleyin. Lazer gücünün sensörüne elimden ucunu yönlendirinmetre ve lazer gücünü maksimize etmek lazer coupler ince ayar kullanın.
6. 50 mW, 473 nm lazer için 3.5 tekrarlayın.
7. Lazer ışığı bloke ve yayılan floresan iletmek için objektif tüpleri kullanarak PMT bir 446/510/581/703 nm dört band geçiren filtreler monte edin. o ışık PMT isabet önce filtreler üzerinden geçecek, böylece fiber kuplörünü takın.
8. 3.7 toplandı birimine 3.3 ile fiber takın.

4. Çevrim karıştırılmış bir emülsiyon Üretim

1. 60 mm x 60 mm delik bir akış odak Mikroakiskan dropmaker cihazı edinin.
2. % 2 iyonik fluorosurfactant ⁹ HFE 7500 yağlar ile 1 ml şırınga doldurun.
3. 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM: floresein aşağıdaki birleşimleri (FITC) ve dekstran-konjuge mavi boyalar PBS (CB) 1 ml şırınga bir dizi doldurun CB, ve 10 nM FITC / 100 nM CB.
4. ters MICROS sahnede dropmaker cihaz montebaş ve şırınga pompalarında sulu ve yağlı şırınga. Çift PE-2 boru kullanan cihazlar için şırınga.
5. 500 ul / sulu çözeltiler için bir yağ, 250 ul / saat saat sonra şırınga pompaları çalıştıran, 4.3 çözümler içeren 80 um damlacıkların bir karışım oluşturmak. Sulu örneğin her türü için, çapraz bulaşmayı önlemek için yeni bir dropmaker cihazı kullanın. Boş şırıngaya Her bir boya kombinasyonu emülsiyon ~ 200 ul toplayın.
6. 4 damlacıklar türleri tek bir koleksiyon şırınga içinde toplanmıştır sonra, defalarca şırınga çevirerek emülsiyonu karıştırın.
7. Tekrar sulu çözeltiler, PBS içinde 0.1, 1, 10 ve 100 nM FITC içeren 4.2-4.6 adımları tekrarlayın.

5. Fiber Optik Ekleme

1. <100 mikro-saniye deklanşör hızları yeteneğine sahip dijital kamera ile birleştiğinde ters bir mikroskop sahnede 2. adımda imal mikroakışkan çip yerleştirin.
2. yan, INSE dikkatle ÇalışmaAna akış kanalı aracılığıyla ponksiyon özen uzak yukarı 120 mikron kanalı içine 473 nm lazer bağlanmış lif rt.
3. , Uzak aşağı 120 mikron yüksek yan kanalı içine 405 nm lazer bağlanmış lif eklemek 300 mikron fiber boşluk sağlar.
4. iki lazer uyarım lifleri normal 220 mikron boyunda kanala PMT-birleştiğinde lif yerleştirin.

Karışık Emülsiyonlar 6. Floresan Algılama

1. PE-2 boru ile bir algılama cihazı aralayıcı yağı girişine% 2 iyonik fluorosurfactant HFE 7500 dolu bir 5 ml şırıngaya monte edin.
2. PE-2 boru kullanılarak cihazın damlacık reenjeksiyon girişine bir dikey olarak yönlendirilmiş şırınga pompa ve çift karışık FITC / CB emülsiyonu içeren şırınga monte edin. atık konteynerine cihaz çıkışından PE-2 boru uzunluğu bağlayın.
3. Her iki kadar 1.000 ul / saatte pompaların her çalıştırarak Başbakan cihazYağ ve damlacıkları düzenli cihazda birleştiren ve aşağı akan görülmektedir.
4. algılama bölgeye seyahat damlacıklar arasında önemli bir boşluk sağlar boşluk yağı 6.000 ul / saat hızında çalışır şekilde debileri ve 100 ul / saatte damlacıklarını ayarlayın.
5. , Lazerler açmak veri toplama programını başlatın ve bazal gürültü zemin 100x daha vardır sinyalleri sağlamak için PMT kazancı ayarlayın. duble zirveleri tek bir doğrusal ölçekli timetrace üzerinde açıkça görülebilir şekilde lazer gücünü ayarlayın.
6. en az 20 kHz PMT gerilim timetrace 60 saniye kazanır. Böyle Matlab olarak bilgisayar programına veri almak ve özel bilgisayar programı komut kullanılarak kaydedilen çifti zirvelerinden yükseklikleri ölçülür.
   Not: Bu ilave bilgi olarak verilmektedir.
7. Tekrarlayın 405 nm lazer kapalı olan, 4,7 oluşturulan FITC sadece karışık emülsiyon kullanılarak 6.2-6.7 adımları.

Sonuçlar

Optik fiberlerin yerleştirilmesi için izin veren bir PDMS cihazın imalatı değişen yükseklik (Şekil 1) kanalları oluşturmak için çok adımlı bir fotolitografi prosedürü gerektirir. İlk olarak, SU-8 80 um boyunda tabaka silikon yonga üzerine bükülmüş ve akışkan geometrisini oluşturmak için bir maske kullanılarak şekillendirilmiştir. Sonraki, SU-8 ek 40 mikron katman gofret üzerine bükülmüş ve 120 mikron boyunda lazer fiber ekleme kanalları...

Tartışmalar

Fiber optik algılama akışkan kanal ile ilgili olarak, optik fiberlerin hizalanmasını gerektirir. Bizim cihaz çok tabakalı fotolitografiyle imal kılavuz kanalları kullandığından, birbirlerine göre olan maske yerleştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Fiber kılavuz kanallar sıvı kanala çok yakın ise, sıvı sızması için bir potansiyel var; kılavuz kanallar çok uzakta bulunan ya da hizadan ise, algılama fiber tarafından toplanan floresan sinyali önemli ölçüde azalabilir. Tam hizalama foto?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Photomasks	CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade	University Wafers	447
SU-8 3035	Microchem	Y311074
SU-8 2050	Microchem	Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Krayden	4019862
1 ml syringes	BD	309628
10 ml syringes	BD	309604
27 gaugue needles	BD	305109
PE 2 polyethylene tubing	Scientific Commodities, Inc.	B31695-PE/2
Novec 7500	Fisher Scientific	98-0212-2928-5	Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant			Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye	Life Technologies	D-1976
Fluorescein sodium salt	Sigma	28803
Quad bandpass filter	Semrock	FF01-446/510/581/703-25
PMT	Thorlabs	PMM02
Fiber port	Thorlabs	PAFA-X-4-A
lens tube	Thorlabs	SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector	Thorlabs	Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector	Thorlabs	Custom
125 μm fiber stripping tool	Thorlabs	T08S13
225 μm fiber stripping tool	Thorlabs	T10S13
laser fiber adapter	OptoEngine	FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW	OptoEngine	MDL-III-405	Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW	OptoEngine	MLL-FN-473-50