JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

摘要

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

引言

液滴的微流体通过在大量悬浮在载体油1水性液滴的compartmentalizing实验提供用于高通量生物学的平台。液滴已被用于应用程序作为不同的单细胞分析2中 ，数字聚合酶链反应（PCR）3，和酶进化4。荧光测定法检测的液滴的微流体的标准模式下，作为其亮信号和快速响应时间与在千赫速率检测子纳升液滴体积兼容。许多应用需要荧光检测用于同时至少两种颜色。例如，我们的实验室通常进行的PCR活化使用一个检测信道为一个化验结果液滴排序的实验中，并使用二次背景染料，使测定阴性液滴可数5。

液滴微流体典型检测站BAsed的上表面荧光显微镜，并需要复杂的光操作计划，以从自由空间激光引入激励光成显微镜被聚焦在样品上。荧光从液滴射出后，所发射的荧光的光进行滤波，使得每个检测信道利用中心波长频带设为一光电倍增管（PMT）。落射荧光显微镜基于光学检测系统，由于其费用，复杂性提供了一个进入门槛，并要求维修。光纤提供的装置构造的简化和健壮检测方案，由于纤维可以手动插入微流体装置，除去基于镜面光路由的需要，并且允许光路用光纤连接器相连接。

在本文中，我们描述了一个紧凑的模块化方案的组装和验证，利用光纤的阵列进行多色荧光检测DA单光电探测器6。光纤被耦合到单独的激光和被插入垂直于一个L形的流动通道以规则的空间偏移。的荧光收集纤维取向平行于激励区域，并连接到一个单独的PMT。因为液滴穿过在不同的时间的激光束，由光电倍增管记录的数据显示了一个时间偏移，允许用户向液滴由每个不同的激光束激发后发出的荧光区分。这个时间偏移消除了需要发射的光分离成使用一系列分色镜和带通滤波器的分离的光电倍增管。以验证检测器的效能，我们定量液滴种群包封不同颜色和浓度的染料的荧光。该系统的灵敏度进行了研究为单色荧光检测，并示出了以检测与浓度液滴向下至0.1nM，一个200×灵敏度曝光的能力ovement相比，在文献7日报道最近的基于光纤的方法为。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1. SU8主制造

  1. 设计使用设计软件三层制造微流体结构并通过在电路板胶片供应商与10微米的分辨率打印的设计。装置设计的细节都在所附的参考6给出的信道的几何形状在图1所示的层应包括对准标记，以帮助从每个制造层8并置的功能。
  2. 放置在旋涂机的预清洗3英寸直径的硅晶片，并开启真空将其固定到卡盘。申请1毫升SU8-3050在晶片和自旋的中心为20秒在500rpm，然后在30秒在1750转，提供80μm的层厚度。
  3. 取出晶片并在135℃加热板上烘烤30分钟。允许在移动到下一步骤之前，晶片冷却至室温。
  4. 暴露涂覆的晶片到1层面具下的准直190米W，365纳米LED 3分钟。曝光后，放置在一个135℃热板上的晶片1分钟，然后冷却至RT在进行下一步骤之前。
  5. 放置在旋涂机在晶片和打开真空将其固定到卡盘。申请1毫升SU8-3050在晶片和自旋的中心为20秒在500rpm，然后在30秒以5,000rpm，导致提供的40微米的附加厚度的层。
  6. 移动到下一步骤之前，取出晶片并烘烤上的135℃热板上进行30分钟，然后冷却至室温。
  7. 对准第二层掩模上在1.3图案化的几何形状和涂布的晶片暴露于准直的190毫瓦，365纳米LED 3分钟。曝光后，放置在135℃的热板4分30秒，然后冷却至RT在进行下一步骤之前。
  8. 放置在旋涂机在晶片和打开真空将其固定到卡盘。申请1毫升SU8-3050在晶片和自旋的中心为20秒在500rpm，然后在30秒，以1,000rpm，导致提供100μm的附加厚度的层。
  9. 移动到下一步骤之前，取出晶片并烘烤上的135℃热板上进行30分钟，然后冷却至室温。
  10. 对准第三层掩模上在1.3图案化的几何形状和涂布的晶片暴露于准直的190毫瓦，365纳米LED 3分钟。曝光后，放置在135℃的热板9分钟，然后冷却至RT在进行下一步骤之前。
  11. 通过在丙二醇单甲基醚乙酸酯的搅拌浴中浸渍30分钟，开发的掩模。洗在异丙醇和烘烤晶片上的135℃热板上进行1分钟。放置开发大师100毫米培养皿聚二甲基硅氧烷（PDMS）成型。

2. PDMS器件制造

  1. 加入50克聚硅氧烷基的与5g在塑料杯中的固化剂的组合1的PDMS:准备10。用安装有搅拌棒旋转工具混合内容物。度如30分钟干燥器内的混合物，或直到所有的气泡都被删除。
  2. 倒入PDMS，得到厚度3mm以上的主站和放回干燥器进一步脱气。一旦所有的气泡除去，烘烤设备在80℃80分钟。
  3. 削减清洁表面与图案化侧使用解剖刀和地点从模具装置上，并与一个0.75毫米活检穿孔冲流体的入口和出口。该设备必须被切割，以使120微米和220微米高的几何形状是从该装置的一侧触及。
  4. 等离子体处理装置，具有特征面朝上，一个预净化2英寸3英寸载玻片沿着在1毫巴的 O 2等离子体在一个300瓦的等离子体清洁器20秒。通过将PDMS设备的图案化侧到玻璃载片的等离子体处理面上粘合PDMS设备。请将设备在80℃的烤箱烤组装设备40分钟。
  5. 渲染通道通过使用注射器冲洗用氟化表面处理流体的装置疏水性的。在80℃立即烘烤设备10分钟以蒸发溶剂。

3.光学元件的制备

  1. 通过从最后5mm的105微米芯，125微米包层的去除绝缘制备激光激发纤维，NA = 0.22的光纤。
  2. 通过重复3.1的第二相同纤维准备第二彩色激光激发光纤。
  3. 制备纤维为通过重复3.1 200微米芯，225微米包层收集荧光信号，NA = 0.39的光纤。
  4. 检查所有的光纤的尖端 - 如果提示不平坦的表面端，再切割用纤维划线的两端。
  5. 附加一个激光光纤耦合到一个50毫瓦，405 nm激光和附加105微米芯纤维在激光中的一个。直接剥离端处激光功率的传感器计，并使用激光耦合器的微调最大化激光功率。
  6. 重复3.5为50毫瓦，473纳米的激光。
  7. 安装在使用透镜套管挡住激光并传输发射的荧光的PMT一个446/510/581/703纳米四带通滤波器。安装光纤耦合器，使光通过过滤器击中PMT前移动。
  8. 从3.3光纤连接到3.7组装单元。

4.离线混合乳化代

  1. 获得具有60微米×60微米孔的流动聚焦微流体dropmaker设备。
  2. 填充1ml注射器与HFE 7500油，用2％的离子氟表面活性剂9。
  3. 填一系列1毫升注射器与（FITC）荧光素的以下组合和葡聚糖 - 缀合的蓝色染料（CB）的PBS:1nM的FITC / 10nM的CB，为10nM FITC / 10nM的CB，1nM的FITC / 100nM的CB，和10nM FITC / 100nM的CB。
  4. 安装dropmaker设备上倒百万分之一的阶段应付和注射泵将水和油的注射器。夫妇注射器使用PE-2管道设备。
  5. 在500微升/小时的油和250微升/小时的水溶液运行注射器泵，创建的从4.3含有溶液80μm的液滴的混合物。对于每种类型的水样中，使用新鲜的dropmaker装置，以消除交叉污染。收集约200微升每个染料组合乳液到一个空的注射器。
  6. 4液滴类型已经在单个收集注射器收集后，通过反复转动注射器混合该乳液。
  7. 用含有0.1，1,10和100nM FITC标记的PBS水溶液重复步骤4.2-4.6。

5.光纤插入

  1. 放置在步骤2上加上能<100微秒的快门速度的数字相机的倒置显微镜的阶段制造的微流体芯片。
  2. 从侧面看，樱雪请小心操作室温联接到473纳米的激光光纤进入的最远上游120微米通道，小心不要通过穿刺到主流动通道。
  3. 将连接到405 nm激光光纤到最下游120微米高端通道，提供300微米的纤维间隔。
  4. 插入光电倍增管偶联纤维进入垂直于两个激光激发光纤220微米高的信道。

6.混合乳液的荧光检测

  1. 装入5毫升注射器填充有HFE 7500，用2％的离子氟表面活性剂的检测装置的隔离物进油口，用PE-2管。
  2. 装入含有关于使用PE-2管垂直取向的注射器泵和联接到该设备的液滴回注入口混合的FITC / CB乳剂注射器。从装置出口到废物容器连接的PE-2管道的长度。
  3. 灌注设备由1000微升/小时运行的每个泵，直至两根油和液滴看到在装置定期组合和下游流动。
  4. 调节流速，使得所述间隔物油运行在6000微升/小时，并在100微升/小时的液滴，提供液滴通过检测区行进之间显著间距。
  5. 开启激光器，启动数据采集程序，并调整PMT增益提供了比100倍基线噪声基底多个信号。调整激光功率以使所有双峰峰是清晰可见的单一，线性缩放timetrace。
  6. 获取的PMT电压timetrace 60秒以至少20千赫​​。将数据导入计算机程序如Matlab和衡量使用自定义计算程序脚本记录的双峰峰的高度。
    注意:这是作为补充信息。
  7. 使用4.7创建的FITC只混合乳化，用405 nm激光关闭，重复步骤6.2-6.7。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

一个PDMS设备，其允许光纤的插入的制造需要多步光刻过程，以创建不同的高度（ 图1）的信道。首先，SU-8的80微米高的层被旋涂到硅晶片并使用掩模来创建流体处理几何图案。接着，附加40微米层的SU-8的旋涂在晶片上，并使用第二掩模来创建功能，将形成120微米高的激光光纤插入通道图案化。最后，100微米以上的SU-8旋涂在晶片上，并形成图案，得到220微米高?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

光纤检测需要的光纤相对于流体通道的取向。因为我们的器件利用具有多层光刻制造导槽，以相对于彼此的掩模放置是非常重要的。如果光纤导槽太靠近流体通道，对于流体泄漏的可能性;如果导向通道位于太远或错位，由检测纤维收集的荧光信号可以显著减少。适当的对准可以通过设计对准标记，例如同心圆入口罩相片图案形成过程中共同定位来辅助。此外，光纤的手动插入装置是具有打破装置...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

The authors have nothing to disclose.

致谢

This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
PhotomasksCadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test gradeUniversity Wafers447
SU-8 3035MicrochemY311074
SU-8 2050MicrochemY111072
Sylgard 184 silicone elastomer kitKrayden4019862
1 ml syringesBD309628
10 ml syringesBD309604
27 gaugue needlesBD305109
PE 2 polyethylene tubingScientific Commodities, Inc.B31695-PE/2
Novec 7500Fisher Scientific98-0212-2928-5Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox SurfactantSynthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dyeLife TechnologiesD-1976
Fluorescein sodium saltSigma28803
Quad bandpass filterSemrockFF01-446/510/581/703-25
PMTThorlabsPMM02
Fiber portThorlabsPAFA-X-4-A
lens tubeThorlabsSM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connectorThorlabsCustom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connectorThorlabsCustom
125 μm fiber stripping toolThorlabsT08S13
225 μm fiber stripping toolThorlabsT10S13
laser fiber adapterOptoEngineFC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mWOptoEngineMDL-III-405Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mWOptoEngineMLL-FN-473-50

参考文献

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
  3. Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
  4. Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004(2010).
  5. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
  6. Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
  7. Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
  8. Lithography. , Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
  9. DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
  10. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882(2012).
  11. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
  12. Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
  13. Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
  14. Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
  15. Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

111

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。