Multicolor détection Fluorescence pour Droplet microfluidique utilisant des fibres optiques

Résumé

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Résumé

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Introduction

Microfluidique Droplet fournissent une plate - forme pour une grande biologie de débit par compartimenter expériences dans un grand nombre de gouttelettes aqueuses en suspension dans une huile de support ^1. Les gouttelettes ont été utilisées pour des applications aussi variées que la simple analyse de cellules ^2, la réaction en chaîne par polymérase numérique (PCR) , ³ et ⁴ l' évolution enzymatique. dosages fluorescents sont le mode standard de détection pour la microfluidique de gouttelettes, comme leurs signaux lumineux et temps de réponse rapide sont compatibles avec la détection de volumes de gouttelettes sous-nanolitre à taux de kilohertz. De nombreuses applications nécessitent une détection par fluorescence d'au moins deux couleurs simultanément. Par exemple, notre laboratoire effectue couramment PCR-activé expériences de gouttelettes de tri qui utilisent un canal de détection pour le résultat d'un essai, et utilise un fond de colorant secondaire pour faire test négatif gouttelettes dénombrable ^5.

stations de détection typiques pour la microfluidique de gouttelettes sont based sur les microscopes à épifluorescence, et nécessitent des manipulations régimes de lumière compliqué à introduire de la lumière d'excitation des lasers d'espace libre dans un microscope à se concentrer sur l'échantillon. Après que la fluorescence est émise à partir d'une goutte, la lumière émise fluoresce est filtré de telle sorte que chaque canal de détection utilise un tube photomultiplicateur (PMT) centré sur une bande de longueur d'onde. systèmes de détection optique épifluorescence à base microscope fournissent une barrière à l'entrée en raison de leurs frais, la complexité et la nécessité d'entretien. Les fibres optiques fournissent les moyens pour construire un système de détection simplifiée et robuste, étant donné que les fibres peuvent être introduites manuellement dans des dispositifs microfluidiques, en supprimant la nécessité d'un routage de lumière intégrée au rétroviseur, et en permettant des chemins de lumière pour être interfacé avec des connecteurs à fibres optiques.

Dans cet article, nous décrivons l'assemblage et la validation d'un système compact et modulaire pour effectuer une détection de fluorescence multicolore en utilisant un réseau de fibres optiques d'unda photodétecteur unique ^6. Les fibres optiques sont couplées à des lasers individuels et sont insérés perpendiculairement à un canal d'écoulement en forme de L avec des décalages spatiaux réguliers. Une fibre de collecte de fluorescence est orienté parallèlement aux régions d'excitation et est reliée à une seule PMT. Parce qu'une goutte passe à travers les faisceaux laser à des moments différents, les données enregistrées par le PMT indique un décalage temporel qui permet à l'utilisateur de faire la distinction entre la fluorescence émise après la gouttelette est excitée par chaque faisceau laser distinct. Ce décalage temporel élimine la nécessité de séparer la lumière émise à PMT séparés en utilisant une série de miroirs dichroïques et filtres passe-bande. Pour valider l'efficacité du détecteur, on quantifier la fluorescence dans les populations de gouttelettes d'encapsulation des colorants de couleur différente et la concentration. La sensibilité du système est étudiée pour la détection de couleur unique à la fluorescéine, et montre la capacité de détecter des gouttelettes ayant des concentrations jusqu'à 0,1 nm, une sensibilité impr 200xOUVEMENT par rapport à des approches à base de fibres récentes rapportées dans la littérature ^7.

Protocole

1. SU8 Fabrication Master

1. Concevoir les structures microfluidiques pour trois couches de fabrication à l'aide de logiciels de conception et ont les dessins imprimés par un fournisseur sur le film de carte de circuit avec 10 um résolution. Les détails de la conception de l' appareil sont données dans une référence attachée ⁶ et les géométries de canaux sont présentés dans la figure 1. Les couches doivent inclure des repères d'alignement pour aider colocaliser caractéristiques de chaque couche de fabrication ^8.
2. Placez une tranche de diamètre de silicium de 3 pouces préalablement nettoyé sur une tournette et allumez le vide pour l'apposer sur le mandrin. Appliquer 1 ml de SU8-3050 dans le centre de la plaquette et de spin pendant 20 secondes à 500 rpm, puis 30 secondes à 1750 tours par minute, offrant une épaisseur de couche de 80 um.
3. Retirer la plaque et cuire au four sur une plaque de cuisson C à 135 ° pendant 30 min. Permettre à la plaquette de se refroidir à la température ambiante avant de passer à l'étape suivante.
4. Exposer la tranche revêtue au 1 ^er masque de calque sous un collimaté 190 mW, 365 nm LED pendant 3 min. Après l'exposition, placer la plaquette sur une C plaque 135 ° C pendant 1 min, puis refroidir à la température ambiante avant de passer à l'étape suivante.
5. Placez la plaquette sur la tournette et tourner sur le vide pour l'apposer sur le mandrin. Appliquer 1 ml de SU8-3050 dans le centre de la plaquette et de spin pendant 20 secondes à 500 rpm, puis 30 secondes à 5000 tours par minute, ce qui entraîne une couche qui fournit une épaisseur supplémentaire de 40 um.
6. Retirer la plaque et cuire au four sur une plaque de cuisson C à 135 ° pendant 30 minutes, puis laisser refroidir à température ambiante avant de passer à l'étape suivante.
7. Alignez le masque de calque 2 ^e sur la géométrie à motifs en 1.3 et exposer la plaquette revêtu à une collimaté 190 mW, 365 nm LED pendant 3 min. Après l'exposition, placer sur une plaque de cuisson C 135 ° C pendant 4 min 30 sec, puis laisser refroidir à température ambiante avant de passer à l'étape suivante.
8. Placez la plaquette sur la tournette et tourner sur le vide pour l'apposer sur le mandrin. Appliquer 1 ml de SU8-3050 dans le centre de la plaquette et de spin pendant 20 secondes à 500 rpm, puis 30s à 1000 tours par minute, ce qui entraîne une couche qui fournit une surépaisseur de 100 um.
9. Retirer la plaque et cuire au four sur une plaque de cuisson C à 135 ° pendant 30 minutes, puis laisser refroidir à température ambiante avant de passer à l'étape suivante.
10. Alignez le masque de calque 3 ^ème sur la géométrie à motifs en 1.3 et exposer la plaquette revêtu à une collimaté 190 mW, 365 nm LED pendant 3 min. Après l'exposition, placer sur une plaque de cuisson C 135 ° C pendant 9 min, puis refroidir à la température ambiante avant de passer à l'étape suivante.
11. Développer les masques par immersion dans un bain agité de propylèneglycol acétate de monométhyléther pendant 30 min. Laver la plaque dans de l'isopropanol et cuire au four sur une plaque chauffante à 135 ° C pendant 1 min. Placez le maître développé dans un plat de 100 mm de Pétri pour polydiméthylsiloxane (PDMS) moulage.

2. PDMS de fabrication de l'appareil

1. Préparer 10: 1 PDMS en combinant 50 g de base de silicone avec 5 g d'agent de durcissement dans une coupelle en plastique. Mélanger le contenu avec un outil rotatif équipé d'un bâtonnet. Degle mélange dans un dessicateur pendant 30 minutes ou jusqu'à ce que toutes les bulles d'air sont éliminées.
2. Verser le PDMS pour donner une épaisseur de 3 mm au-dessus du maître et de placer de nouveau dans le dessiccateur pour plus de dégazage. Une fois que toutes les bulles sont enlevées, cuire le dispositif à 80 ° C pendant 80 min.
3. Couper l'appareil du moule à l'aide d'un scalpel et le placer sur une surface propre avec le côté à motifs et perforer les entrées et sorties fluidiques avec une biopsie poinçon de 0,75 mm. Le dispositif doit être coupé de façon à ce que les 120 um et 220 um hautes géométries sont accessibles depuis le côté de l'appareil.
4. Traiter Plasma le dispositif, avec le côté fonctionnalité jusqu'à, avec un pré-nettoyés 2 pouces par 3 pouces lame de verre à 1 mbar plasma O ₂ pendant 20 secondes dans un nettoyeur à plasma de 300 W. Coller le dispositif de PDMS en plaçant la face à motifs du dispositif PDMS sur le côté traité au plasma de la lame de verre. Placez l'appareil dans un four à 80 ° et cuire le dispositif assemblé pendant 40 min.
5. Rendre les canauxhydrophobe en utilisant une seringue pour rincer le dispositif avec un fluide de traitement de surface fluoré. cuire immédiatement le dispositif à 80 ° C pendant 10 min pour évaporer le solvant.

3. Préparation des composants optiques

1. Préparer la fibre d'excitation laser en enlevant l'isolation du 5 derniers millimètres de 105 um noyau 125 um gaine, NA = 0,22 fibre optique.
2. Préparer le laser couleur fibre d'excitation 2 ^e en répétant 3.1 pour une fibre identique 2 ^e.
3. Préparer la fibre pour collecter le signal de fluorescence en répétant 3,1 à 200 um noyau 225 um gaine, NA = 0,39 fibre optique.
4. Inspecter les conseils de toutes les fibres - si les conseils ne se terminent pas par une surface plane, re-cliver les extrémités avec une pointe en fibre.
5. Fixer un agent de couplage de la fibre laser à 50 mW, 405 nm laser et attacher une des 105 pm base de fibres au laser. Diriger l'extrémité dénudée au niveau du capteur de la puissance du laserm et utiliser les réglages fins du coupleur laser afin de maximiser la puissance du laser.
6. Répétez 3,5 pour un laser nm 50 mW, 473.
7. Monter un 446/510/581/703 nm filtres passe-bande quad sur le PMT en utilisant des tubes de lentilles pour bloquer la lumière laser et transmettre la fluorescence émise. Fixer coupleur de fibres de telle sorte que la lumière se déplace à travers les filtres avant de frapper le PMT.
8. Fixer la fibre de 3,3 à l'unité assemblée en 3.7.

4. Offline Mixed Generation Emulsion

1. Obtenir un dispositif microfluidique de dropmaker de mise au point d'écoulement avec un 60 um x 60 um orifice.
2. Remplir une seringue de 1 ml avec HFE 7500 huiles avec 2% fluoré ionique ^9.
3. Remplir une série de seringues de 1 ml avec les combinaisons suivantes de fluorescéine (FITC) et les colorants bleu dextran conjugué (CB) dans du PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nm CB, et 10 nM FITC / 100 nM CB.
4. Monter le dispositif de dropmaker sur la scène d'un micros inverséesfaire face et aqueuse et huileuse seringues sur les pompes à seringue. Couple les seringues aux appareils utilisant PE-2 tubes.
5. Exécution de pompes à seringue à 500 pl / h pour l'huile et 250 pi / h pour les solutions aqueuses, de créer un mélange de 80 um gouttelettes contenant les solutions de 4,3. Pour chaque type d'échantillon aqueux, utiliser un dispositif de dropmaker frais pour éliminer la contamination croisée. Recueillir ~ 200 pi d'émulsion de chaque combinaison de colorant dans une seringue vide.
6. Après les gouttelettes types 4 ont été rassemblées dans une seule seringue de collecte, mélanger l'émulsion en faisant tourner plusieurs fois sur la seringue.
7. Répéter les étapes 4.2 à 4.6 avec des solutions aqueuses contenant 0,1, 1, 10 et 100 nM FITC dans du PBS.

5. Fibre optique Insertion

1. Placez la puce microfluidique fabriqué à l'étape 2 sur la scène d'un microscope inversé couplé avec un appareil photo numérique capable de <100 microsecondes vitesses d'obturation.
2. Travailler soigneusement de côté, insert la fibre couplée au laser nm 473 dans le canal amont um 120 plus loin, en prenant soin de ne pas percer à travers le canal d'écoulement principal.
3. Insérez la fibre couplée au laser nm 405 dans le canal um côté haut le plus en aval 120, fournissant un espacement de fibre de 300 um.
4. Insérez la fibre PMT-couplée dans le grand canal normal aux deux fibres d'excitation laser de 220 nm.

6. Fluorescence Détection de Emulsions mixtes

1. Monter une seringue de 5 ml remplie de HFE 7500 avec 2% de tensioactif fluoré ionique à l'entrée d'huile d'écartement du dispositif de détection avec un tube PE-2.
2. Monter la seringue contenant le FITC / CB émulsion mixte sur une pompe à seringue orienté verticalement et deux à l'entrée de gouttelettes de réinjection de l'appareil en utilisant PE-2 tubes. Connecter une longueur de tube PE-2 de la sortie de l'appareil à un conteneur de déchets.
3. Premier dispositif en exécutant chacune des pompes à 1000 pi / h jusqu'à ce que lesl'huile et les gouttelettes sont visibles à combiner régulièrement dans le dispositif et qui coule en aval.
4. Ajuster les débits d'écoulement tels que l'huile d'espacement exécute à 6000 ul / h et les gouttelettes à 100 ul / h, en fournissant un espacement important entre les gouttelettes qui traversent la zone de détection.
5. Allumez les lasers, démarrez le programme d'acquisition de données, et d'ajuster le gain du PMT pour fournir des signaux qui sont plus que 100x le plancher de bruit de fond. Régler la puissance du laser de telle sorte que tous les pics du doublet sont clairement visibles sur une seule timetrace linéairement à l'échelle.
6. Acquérir 60 sec de l'timetrace de tension de PMT à au moins 20 kHz. Importez les données dans le programme informatique tels que Matlab et mesurer les hauteurs des pics des doublets enregistrées en utilisant le script de programme informatique personnalisé.
   NOTE: Ceci est fourni à titre d'information complémentaire.
7. Répétez les étapes 06.02 à 06.07 en utilisant le FITC seule émulsion mixte créée en 4.7, avec le laser nm 405 éteint.

Résultats

Fabrication d'un dispositif PDMS qui permet l'insertion de fibres optiques nécessite une procédure en plusieurs étapes de photolithographie pour créer des canaux de hauteur variable (figure 1). Tout d'abord, une couche 80 um de hauteur de SU-8 est mis en rotation sur une tranche de silicium et modelée en utilisant un masque pour créer la géométrie de manipulation de fluide. Ensuite, un 40 um couche supplémentaire de SU-8 est filée sur la plaquette, ...

Discussion

détection de fibre optique nécessite l'alignement des fibres optiques par rapport aux canaux de fluide. Parce que notre dispositif utilise des canaux de guidage fabriqués avec photolithographie multicouche, le placement des masques par rapport à l'autre est d'une grande importance. Si les canaux de guidage des fibres sont trop proches du canal de fluide, il existe un risque de fuite de fluide; si les canaux de guidage sont situés trop loin ou mal alignée, le signal de fluorescence recueillie par la fib...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Photomasks	CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade	University Wafers	447
SU-8 3035	Microchem	Y311074
SU-8 2050	Microchem	Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Krayden	4019862
1 ml syringes	BD	309628
10 ml syringes	BD	309604
27 gaugue needles	BD	305109
PE 2 polyethylene tubing	Scientific Commodities, Inc.	B31695-PE/2
Novec 7500	Fisher Scientific	98-0212-2928-5	Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant			Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye	Life Technologies	D-1976
Fluorescein sodium salt	Sigma	28803
Quad bandpass filter	Semrock	FF01-446/510/581/703-25
PMT	Thorlabs	PMM02
Fiber port	Thorlabs	PAFA-X-4-A
lens tube	Thorlabs	SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector	Thorlabs	Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector	Thorlabs	Custom
125 μm fiber stripping tool	Thorlabs	T08S13
225 μm fiber stripping tool	Thorlabs	T10S13
laser fiber adapter	OptoEngine	FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW	OptoEngine	MDL-III-405	Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW	OptoEngine	MLL-FN-473-50