تلألؤ بيولوجي التصوير لكشف العدوى المرحلة المتأخرة من داء المثقبيات الأفريقي

Summary

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Abstract

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.

Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.

Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

Introduction

Human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, is caused by the vector-borne protozoan parasites of the Trypanosoma brucei spp¹. Estimated numbers of current cases is fewer than 7 thousand every year with almost 70 million people exposed to the risk of the parasite infection within the African continent. The disease, which is most often lethal if left untreated, comprises an early hemolymphatic stage where parasites are present in the blood, progressing to the late stage when parasites invade the central nervous system (CNS) and are no longer susceptible to treatment by early stage trypanosomal drugs². The current drug therapies for late-stage HAT have both complex, prolonged, treatment regimens and severe adverse effects as well as reported resistance, therefore research into new drug therapies is imperative^3,4.

The study of late-stage human African trypanosomiasis (HAT) within traditional mouse models is lengthy and complex, with the removal of brain tissue being required to monitor parasitic burden⁵. The animal infective strain T. b. brucei is used as the study model of trypanosomiasis with the late stage appearing 21 days post infection (dpi). To monitor the wild type nonbioluminescent parasite infection in the mouse model, peripheral blood films or quantitative PCR are the only methods to determine parasite burden. For parasite burden in the brain, the mouse needs to be culled, brain excised and qPCR carried out on tissues, making it impossible to track parasites through multiple time points in the late stage infection. This results in the inability to follow real-time infections within the central nervous system (CNS).

In vivo bioluminescence imaging (BLI) can provide highly sensitive, non-invasive detection of parasite dissemination and disease progression in a mouse model that can be followed in a single animal for the entirety of the experiment⁶. BLI is based on the emission of light in the visible spectrum produced by a luciferase-catalyzed reaction. The emitted photons are then detected by a charge coupled device (CCD) camera⁷. For this purpose, the pathogen is genetically modified to express a luciferase protein and the substrate, luciferin, is introduced at time points of interest by injection. The main advantage of this method is the ability to carry out longitudinal studies, in which the same animal can be imaged several times with minimal adverse effects. The acquired bioluminescence signal can be quantified, thus indicating the pathogen burden.

The optimization and validation of a red-shifted bioluminescent T. b. brucei has enabled the investigation of the late stage infection through non-invasive procedures, detecting parasites earlier than blood film microscopy and greatly reducing the time, cost and numbers of animals needed to study CNS infection and drug screening in late-stage trypanosomiasis^8,9. In this protocol we demonstrate infection of mice with bioluminescent trypanosomes and how to then visualize the parasites in vivo for quantification of disease progression and CNS penetration.

Protocol

أخلاق
ونفذت كل عمل خارج بموجب موافقة من المملكة المتحدة وزارة الداخلية الحيوانات (الإجراءات العلمية) لسنة 1986 ومدرسة لندن للصحة والطب الاستوائي رعاية الحيوان ومجلس مراجعة الأخلاق. صلوا اليها التوجيهي المتبعة في هذا التقرير.

1. في فيفو مرور إضاءة الحيوية المثقبية البروسية البروسية

1. إزالة الأسهم cryopreserved (وهو ما يسمى stabilate) ت. ب. البروسية سلالة GVR35-VSL-2 (متوفر من البروفيسور جون كيلي في مدرسة لندن للصحة والطب الاستوائي من خلال MTA) ⁹ من النيتروجين السائل وتسمح للتوازن في درجة حرارة الغرفة. تمييع stabilate إلى 2 × 10 ⁴ المثقبيات / مل في العقيمة الفوسفات الجلوكوز المالحة (PBS-G) ودرجة الحموضة 8.0 (1 لتر برنامج تلفزيوني + 15 جرام جلوكوز) ^10.
   ملاحظة: T. ب. البروسية GVR35-VSL-2 هو غير معد للإنسان ويتطلب سابو المرخص التسهيلات لإجراء التجارب.
2. ينجإلخ 20-25 غ أنثى CD1 الفأر مع 0.2 مل مخففة المثقبيات عبر الطريق داخل الصفاق (IP) مع إبرة 25 G. هذا هو "الماوس المانحة". ضع الماوس المصاب الى المحددة الممرض الحرة (SPF) -cage والأعلاف الإرضاع بحسب الرغبة.
   ملاحظة: الفئران CD1 هي سلالة الأباعد وT. ب. تتميز جيدا العدوى البروسية GVR35 في هذه السلالة. ومع ذلك، فإن هذا البروتوكول ينطبق أيضا على السلالات الفطرية أو المعدلة وراثيا، ولكن من المهم أن نلاحظ أن لون الفراء قد تؤثر على حساسية التصوير ^6،9.
3. رصد الطفيل الطرفية عن طريق اخذ عينات الدم. ضع الماوس إلى رادع البلاستيك واتخاذ 5 ميكرولتر من الدم من الذيل بواسطة بزل الوريد مع 21 G إبرة أو فصد ومزيج 10/01 مع 0.85٪ كلوريد الأمونيوم العقيمة إلى ليز خلايا الدم الحمراء والسماح أسهل العد.
4. عد الدم المخفض في نويباور عدادة الكريات.
   1. تحميل الدم المخفف في كلا المجلسين. عدد غرام المركزي بأكملهمعرف غرفة واحدة لإعطاء المثقبيات ن. تركيز المثقبيات في الدم = ن × 10 ⁴ المثقبيات / مل، وضبط أي عامل التخفيف وحساب متوسط ​​الغرفتين.
      ملاحظة: بعد ما يقرب من 5-7 أيام بعد الإصابة، يجب أن ترتفع الطفيل الطرفية بما فيه الكفاية لإجراء العدوى بتركيز 2 × 10 ⁴ المثقبيات / مل.
5. عندما تكون مستويات المثقبيات مرتفعة بما فيه الكفاية لعدد من الفئران المطلوبة، والانتقال إلى الخطوة 1.6. مستوى الطفيل من 6 × 10 ⁴ المثقبيات / مل في الماوس مانح واحد يكفي لإصابة 10 الفئران.
   ملاحظة: للحصول على أحجام مجموعة ذات دلالة إحصائية، ن = 6 لكل مجموعة العلاج من الفئران هناك حاجة إلى ^8. لنماذج أخرى من العدوى، وسوف تحتاج ليتم تطبيقها لتحديد أحجام المجموعة المناسبة حسابات السلطة.
6. مكان الفئران في مربع الحرارة (في 28-30 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 5-10 دقيقة) للسماح للأوردة الذيل لتمدد.للحث على تخدير المحطة وإدارة 20 ملغ / كغ في الوريد بنتوباربيتال مع إبرة 25 G. هو تخدير تأكيد الماوس عن طريق بلطف الضغط على قطاع الطرق لضمان عدم وجود رد فعل الانسحاب.
7. يعالج بالهيبارين 21 G الإبرة aliquoting 5 مل الهيبارين في 5000 USP وحدة / مل في أنبوب بيجو وامتصاص مرتين في والخروج من إبرة تعلق على حقنة 1 مل.
8. خذ heparinized 21 G إبرة وحقنة 1 مل، وإجراء ثقب في القلب على الماوس مرور تخدير عن طريق إدخال إبرة مركزيا تحت القفص الصدري (سوف حبة من الدم يتجمع في قاعدة الإبرة) وسحب بلطف مرة أخرى على المكبس حتى لا تنهار الغرفة من القلب. جمع ما لا يقل عن 0.7 مل من الدم.
9. تمييع الدم الملوث لإنتاج اللقاح من 2 × 10 ⁴ المثقبيات / مل في برنامج تلفزيوني-G 8.0 درجة الحموضة كخطوة 1.1 أعلاه.
   ملاحظة: عند هذه النقطة، والدم المتبقية يمكن cryopreserved لإنتاج stabilate عن طريق خلط مع 8٪ الجلسرين، و 20٪ الحرارة المعطل كاليفورنيا الجنينمصل LF (مرحبا FCS) و 72٪ دم المصاب. تجميد ببطء في -80 درجة مئوية باستخدام بطء تجميد تجميد حاوية لتحقيق معدل تبريد -1 ° C / دقيقة، قبل ان ينتقل الى النيتروجين السائل.

2. إصابة فئران التجارب

1. وضع CD1 الفئران الإناث (~ 21-25 ز) في مربع التدفئة إلى الحارة بلطف لتمدد الأوردة. وضع الفئران تحسنت الى ضبط النفس البلاستيك وحقن 0.2 مل اللقاح المخفف عن طريق الوريد مع إبرة G 25 إلى الوريد الذيل، أي ما يعادل 4000 المثقبيات في الماوس. وضع الضغط في موقع الحقن بعد ذلك لوقف النزيف.
   ملاحظة: العدوى داخل الصفاق هو طريق صحيح للعدوى، واستخدمت في الدراسات السابقة ^10، ولكن وجدنا هذا أقل استنساخه من طريق الوريد.
2. بطريقة عشوائية الفئران المصابة وقفص في مجموعات من 3 في أقفاص تنفيس SPF. كعنصر تحكم، وضخ CD1 إناث الفئران مع نوع البرية الطفيلي غير إضاءة الحيوية، T. ب. البروسية GVR35 (ن =3).
3. مراقبة العدوى عن طريق الدم السينمائي المجهر
   1. بقعة 5 الدم ميكرولتر من بزل الوريد أو فصد على شريحة زجاجية وإجراء المسحة الدم (باستخدام شريحة زجاجية الثانية دفع بلطف قطرة من الدم عبر الشريحة لإنتاج طبقة رقيقة). تسمح الشرائح للهواء الجاف.
   2. إصلاح مسحة الدم مع الميثانول بنسبة 100٪ وصمة عار مع بالغيمزا لمدة 10 دقيقة قبل الشطف مع DH ₂ O والسماح للهواء الجاف. تحت الهدف 100X حساب عدد من المثقبيات في 10 مجالات (فوف) الرأي.
      ملاحظة: يتم تصوير الدم خارج جنبا إلى جنب مع كل الحيوانات التصوير موسع في وقت مبكر من يوم واحد بعد الإصابة. عند معالجة عدد من الحيوانات، ويفضل هذا الأسلوب من الكميات المثقبيات على العد عدادة الكريات كما يمكن تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة، وعدها في وقت لاحق.

3. ضوء بارد التصوير لتتبع العدوى

ملاحظة: لمراقبة العدوى، أنيم كلهآل التصوير غير الغازية يمكن استخدامها.

1. إعداد محلول المخزون من D-وسيفيرين، ووسيفيراز الركيزة يراعة، في Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) في 30 ملغ / مل. فلتر تعقيم وتجميد في aliquots في -20 درجة مئوية.
   ملاحظة: D-وسيفيرين غير الحساسة للضوء، وبالتالي حمايته من الضوء من خلال التفاف قسامات في احباط. لا تجميد ذوبان الجليد بشكل متكرر وسيفيرين لأنها يمكن أن تؤثر على النشاط ^11.
2. تدفئة قسامة من D-وسيفيرين إلى درجة حرارة الغرفة. إزالة كل فأر من القفص (بما في ذلك السيطرة على الفئران المصابة مع nonbioluminescent نوع السلالة البرية الطفيلي) وحقن 150 ملغ / كغ من حرارة D-وسيفيرين (المخفف في DPBS) البريتونى مع إبرة 25 G. وضع الفئران الى غرفة آيزوفلوران لحوالي 5 دقائق للحث على التخدير مع 2٪ آيزوفلوران / O مزيج ₂ في 2.5 لتر / دقيقة.
   ملاحظة: الفئران تصبح قادرة على الحركة عندما تكون تحت التخدير. لتصوير المستخدمة هنا، 3 الفئران يمكن معالجتها في وقت واحد. إذا الفئران هي anesthetأوتوماتيكية لمدة أطول من 30 دقيقة، ويمكن تطبيقها في طب العيون مرهم المسيل للدموع اصطناعية لمنع أعين الفئران من الجفاف.
3. لتصوير الموصوفة هنا، افتح البرنامج وتهيئة الجهاز باستخدام البرنامج حسب تعليمات الشركة الصانعة. الحصول على صور مرة واحدة الكاميرا ولوحة ساخنة وصلت درجة الحرارة.
   ملاحظة: هذا الصك لا تحول عادة خارج، مما يتيح للجهاز لأداء المعايرة الخلفية بين عشية وضحاها. في حال أنه يحتاج إلى إعادة تشغيل، فإنه يجب إجراء فحص معايرة لأول مرة.
4. وضع الفئران تخدير في تصوير (انظر 3.5). استخدام فواصل سوداء كبيرة بين الفئران لتقليل النزف من خلال من أي إشارة للإضاءة الحيوية مشرق. الفئران صورة باستخدام مجموعة من التعرض مرات. 1، 3، 10، 30، 60 و 180 ثانية، مع binning المتوسطة (1)، و / إيقاف وعامل تصفية مفتوحة، ومجال الرؤية E (12.5 X 12.5 سم ^2).
   ملاحظة: السيطرة على الفئران المصابة مع النوع البري طفيليات GVR35 nonbioluminescent توفر backgrالقيمة تلألؤ بيولوجي س اوند. من تجربة حركية وسيفيرين (الشكل 6) مع هذا النموذج، وجدنا أن القمم إشارة تلألؤ بيولوجي في 10 دقيقة بعد إدارة والتصوير يستغرق حوالي 5 دقائق لمدة 3 الفئران. خذ هذا الجدول الزمني في الاعتبار عند التخدير والتصوير الفئران.
5. لضمان تصوير دقيق للفئران، وتناوب على الحصول على بطني، ظهري وجهة النظر الجانبي. المحافظة على تناسق في ترتيب التوجه للتصوير بين الحيوانات متتابعة.
6. بعد التصوير، والسماح الفئران للتعافي من التخدير تحت المراقبة قبل ان يعود الى SPF-القفص.
7. مواصلة التصوير الفئران كل 7 أيام حتى يوم 21 بعد الإصابة. يجب أن تكون هناك زيادة مطردة في إشارة تلألؤ بيولوجي على الحيوانات بأكمله.
8. في D21، صورة وفيلم دم الفئران كما هو موضح أعلاه، وجرعة الفئران مع 40 ملغ / كغ diminazene aceturate البريتونى. وهذا الدواء مسح الطفيل الطرفية ولكن لن تعبر الدم المخن الحاجز، وبالتالي يمكن تصور أفضل للإصابة الجهاز العصبي المركزي.
   ملاحظة: Diminazene aceturate دواء راسخة يستخدم لعلاج المرحلة المبكرة من داء المثقبيات الحيوانية.
9. تواصل التصوير والمراقبة في D28 و D35.

4. تأكيد الجهاز العصبي المركزي العدوى

1. في D35، الفئران الصورة على النحو المفصل أعلاه (خطوات 3،1-3،4).
2. بعد التصوير، والسماح الفئران للتعافي من التخدير ويستنزف الفئران كما هو موضح في الخطوة 1،6-1،8، وجمع الدم لمزيد من التحليل.
3. بعد ثقب في القلب، يروي الفئران مع 20 مل PBS (اختياري: إضافة 3 ملغ / مل من وسيفيرين إلى حل التروية) عن طريق القلب لمسح الدم من الأجهزة ولإعادة تسمية وسيفيرين التي قد مسح من منطقة في الدماغ خلال فترة زمنية من الخطوة 4.1.
4. إزالة بلطف الدماغ، وذلك باستخدام مقص منحنية، وقطع من القاعدة حول محيط الجمجمة، ورفع قبالة الجزء العلوي من الجمجمة، للسماح للدماغمن المقرر أن يرفع برفق مع ملقط المنحنية.
5. وضع الدماغ رفعه على جزء من البلاستيك الأسود وماصة 50 ميكرولتر من 15 ملغ / مل وسيفيرين على الجهاز قبل التصوير، لضمان تمت إضافة وسيفيرين كافية إلى الدماغ رفعه. الصورة باستخدام الإعدادات على النحو الوارد أعلاه. هذا وسوف تظهر توطين العدوى إلى نصفي الدماغ.
   ملاحظة: الكمي المصب من الطفيل على الدماغ رفعه يمكن أن تقوم بها QPCR كما هو موضح سابقا ^8. ويمكن أن تشمل التطبيقات المصب بديلة أخرى الأنسجة أو المناعية للتعرف على الطفيليات في أنسجة المخ بعد التثبيت.

5. الكميات من تلألؤ بيولوجي التصوير

ملاحظة: تلألؤ بيولوجي يمكن قياسها كميا باستخدام المنطقة ذات الاهتمام (ROI) مع برنامج التصوير وتصحيح للتلألؤ بيولوجي الخلفية.

1. باستخدام أداة العائد على الاستثمار، وخلق العائد على الاستثمار مستطيلة للحيوان كامل الكميات لالثانية وضعه فوق الصورة الماوس لتغطية طرف الأنف إلى قاعدة الذيل من الفأرة. استخدام نفس مربع حجم كل حيوان وكل نقطة زمنية. عند النظر إلى العائد على الاستثمار للدماغ، واستخدام العائد على الاستثمار دائرية في نفس الطريق، وذلك لتحديد المواقع على الماوس منطقة الرأس في الصورة.
2. إذا رغبت في ذلك، وضبط الصور لتظهر على نفس الطيف لتمثيل مرئي للعدوى.
   ملاحظة: البرامج المستخدمة هنا يولد خريطة ملونة لكل صورة تعديله تلقائيا عن التهم الحد الأدنى والحد الأقصى الفوتون. لتمكين المقارنة البصرية بين سلسلة من الصور، لا بد من وضع جدول اللون لنفس القيم لجميع الصور.
   1. باستخدام صورة مع أعلى تلألؤ بيولوجي وعلامة التبويب "صورة ضبط" على لوحة الأداة، حدد مقياس لوغاريتمي والحد الأدنى مقياس اللون المناسب والحد الأقصى (يتم تحديدها تجريبيا). تطبيق هذا المقياس على جميع الصور في كافة مراحل التجربة.

النتائج

يوضح هذا البروتوكول كيفية متابعة تطور المرض بعد الإصابة من الفئران مع T. ب. البروسية، نموذجا لداء المثقبيات الأفريقي البشري. ويبين الشكل (1) والجدول الزمني للبروتوكول تجريبي، مما يدل على جدول زمني للعلاج والتصوير الخطوات الشكل 2

Discussion

تطوير T. إضاءة الحيوية ب. البروسية GVR35 سلالة يسمح التصور من عدوى المثقبيات من أوائل وأواخر المرحلة. وكانت النماذج عدوى سابقة لم تكتشف مرحلة متأخرة، عندما الطفيليات في الدماغ، في الوقت الحقيقي من المجهري فيلم الدم، وتتطلب عملية الاعدام وإزالة العقول من الفئر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Sigma, UK	P4417	tablets pH 7.4
Glucose	Sigma, UK	G8270	99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride	Sigma, UK	A9434	99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt)	Sigma, UK	H0878
Hi-FCS	Gibco, Life Technologies, UK	10500-064	500 ml
DPBS	Sigma, UK	D4031	Sterile filtered
Mr. Frosty	Nalgene, UK
Giemsa	Sigma, UK	G5637
D-Luciferin	Perkin Elmer, UK
	Sigma, UK	115144-35-9
Diminazene aceturate	Sigma, UK	D7770	Analytical grade
IVIS Lumina II	Perkin Elmer, UK		other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2	Perkin Elmer, UK		proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10142104
20 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10743785
25G Needles	Greiner Bio-one	N2516
21G Needles	Greiner Bio-one	N2138
Twin-frosted microscope slide	VWR, UK	631-0117
1.5 ml microcentrifuge tube	StarLab, UK	I1415-1000
7 ml Bijou tube	StarLab, UK	E1412-0710
Mouse restrainer	Sigma, UK	Z756903	our restrainer was made in-house, this is a similar model