생물 발광 영상은 아프리카 트리파노소마 증의 늦은 단계의 감염을 감지하는

요약

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

초록

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.

Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.

Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

서문

Human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, is caused by the vector-borne protozoan parasites of the Trypanosoma brucei spp¹. Estimated numbers of current cases is fewer than 7 thousand every year with almost 70 million people exposed to the risk of the parasite infection within the African continent. The disease, which is most often lethal if left untreated, comprises an early hemolymphatic stage where parasites are present in the blood, progressing to the late stage when parasites invade the central nervous system (CNS) and are no longer susceptible to treatment by early stage trypanosomal drugs². The current drug therapies for late-stage HAT have both complex, prolonged, treatment regimens and severe adverse effects as well as reported resistance, therefore research into new drug therapies is imperative^3,4.

The study of late-stage human African trypanosomiasis (HAT) within traditional mouse models is lengthy and complex, with the removal of brain tissue being required to monitor parasitic burden⁵. The animal infective strain T. b. brucei is used as the study model of trypanosomiasis with the late stage appearing 21 days post infection (dpi). To monitor the wild type nonbioluminescent parasite infection in the mouse model, peripheral blood films or quantitative PCR are the only methods to determine parasite burden. For parasite burden in the brain, the mouse needs to be culled, brain excised and qPCR carried out on tissues, making it impossible to track parasites through multiple time points in the late stage infection. This results in the inability to follow real-time infections within the central nervous system (CNS).

In vivo bioluminescence imaging (BLI) can provide highly sensitive, non-invasive detection of parasite dissemination and disease progression in a mouse model that can be followed in a single animal for the entirety of the experiment⁶. BLI is based on the emission of light in the visible spectrum produced by a luciferase-catalyzed reaction. The emitted photons are then detected by a charge coupled device (CCD) camera⁷. For this purpose, the pathogen is genetically modified to express a luciferase protein and the substrate, luciferin, is introduced at time points of interest by injection. The main advantage of this method is the ability to carry out longitudinal studies, in which the same animal can be imaged several times with minimal adverse effects. The acquired bioluminescence signal can be quantified, thus indicating the pathogen burden.

The optimization and validation of a red-shifted bioluminescent T. b. brucei has enabled the investigation of the late stage infection through non-invasive procedures, detecting parasites earlier than blood film microscopy and greatly reducing the time, cost and numbers of animals needed to study CNS infection and drug screening in late-stage trypanosomiasis^8,9. In this protocol we demonstrate infection of mice with bioluminescent trypanosomes and how to then visualize the parasites in vivo for quantification of disease progression and CNS penetration.

프로토콜

윤리학
모든 작업은 영국 홈 오피스 동물의 승인 (과학적인 절차) 법 1986 위생 및 열대 의학 동물 복지와 윤리 심의위원회의 런던 학교에서 실시 하였다. 가이드 라인에 도착하는이 보고서에 따른다.

발광 생물 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei brucei의 생체 항로 1.

1. T.의 냉동 보관 재고 (라고 stabilate)를 제거 비. brucei 변형 액체 질소에서 ⁹ (MTA를 통해 위생 및 열대 의학의 런던 학교 교수 존 켈리에서 구입 가능) GVR35-VSL-2 및 실온에 평형 수 있습니다. 멸균 인산 완충 포도당 식염수 (PBS-G)의 pH 8.0 (1 L PBS + 15g 포도당) ^(10)에 2 × 10 ⁴ 트리 파노 솜 / ㎖로 stabilate을 희석.
   참고 : T.를 비. brucei GVR35-VSL-2는 인간에게 비 감염성이며 SAPO 실험을 수행 할 시설 허가가 필요합니다.
2. INJ요법 25 G 바늘로 복강 내 경로 (IP)를 통해 trypanosomes에 희석 0.2 ml의와 20-25g 여성 CD1 마우스입니다. 이것은 "기증자 마우스"입니다. 특정 병원체 무료 (SPF) -cage 및 사료 광고 임의로에 감염된 마우스를 놓습니다.
   참고 : CD1 마우스는 이계 변형 및 T. 있습니다 비. brucei GVR35 감염이 변형에 잘 특징이다. 그러나이 프로토콜은 근친 또는 유전자 변형 계통에 적용 가능하지만, 촬상 ^-6,9-의 민감도에 영향을 미칠 수 털 색깔 중요하다.
3. 혈액 샘플링에 의해 주변 기생충을 모니터링합니다. 플라스틱 제한 수단에 마우스를 놓고 21 G 바늘이나 사혈와 venepuncture에 의해 꼬리에서 혈액의 5 μl를 타고 붉은 혈액 세포를 용균 쉽게 계산 할 수 있도록 0.85 % 멸균 염화 암모늄 1/10 섞는다.
4. 노이 바 우어 혈구에서 희석 된 혈액을 계산합니다.
   1. 두 챔버로 희석 된 혈액을로드합니다. 전체 중앙 GR 카운트하나의 챔버의 ID는 n 개의 트리 파노 솜을 얻었다. 혈액 = N × ¹⁰⁴ 트리 파노 솜 / ㎖에서 트리 파노 솜의 농도는 모든 희석 계수를 조정하고 두 챔버들의 평균을 계산한다.
      주 : 후 약 5~7일 후 감염, 기생충 주연 2 × ¹⁰⁴ 트리 파노 솜 / ml의 농도로 감염을 수행하기에 충분히 상승한다.
5. 트리파노소마 수준은 1.6 단계로 이동 필요한 생쥐의 수만큼 높은 경우. 하나의 공여 마우스 6 × ¹⁰⁴ 트리파노소마 / ml의 기생충 레벨 10 마우스 악성 충분하다.
   참고 : 통계적으로 유의 한 그룹 크기를 들어, N = 6 마우스의 각 치료 그룹 ⁸ 필요하다. 감염의 다른 모델의 경우, 파워 계산은 해당 그룹의 크기를 결정하기 위해인가 될 필요가있을 것이다.
6. (약 5 ~ 10 분 동안 28 ~ 30 ℃에서) 열 상자에 장소 마우스는 꼬리 정맥이 팽창 할 수 있도록합니다.터미널 마취 유도 20 밀리그램 / 25 G 바늘 kg 펜토 바르 비탈 정맥을 관리합니다. 확인 마우스 부드럽게 움츠림 반사가 없는지 확인하는 발바닥을 눌러 마취.
7. 비쥬 튜브에 5000 USP 단위 / ㎖의 헤파린을 5 ㎖ 분취하고 및 1 mL의 주사기에 부착 된 바늘로부터 회 흡인하여 21 G 바늘을 Heparinize.
8. 헤파린 21 G 바늘과 1 ML의 주사기를 가지고 가고, 흉곽 아래 중앙에 바늘을 삽입하여 마취 통로 마우스의 심장 천자를 수행 (혈액의 비드 바늘의베이스에 풀 것) 부드럽게 플런저를 철수 그래서 같은 마음의 실을 축소 할 수 없습니다. 혈액의 0.7 ML의 최소를 수집합니다.
9. 위의 단계 1.1로 PBS-G의 pH 8.0에서 2 × 10 ⁴ 트리 파노 솜 / ㎖의 접종을 생성하기 위해 감염된 혈액을 희석.
   주 :이 시점에서 남아있는 혈액을 8 % 글리세롤, 20 % 열 - 불 활성화 된 태아 (CA)와 혼합하여 stabilate 생산​​ 동결 보존 할 수있다LF 혈청 (하이 - FCS)와 72 % 감염된 혈액. 천천히 액체 질소로 전송하기 전에, C / 분 ° -1 냉각 속도를 달성하기 위해 컨테이너를 동결 느린 동결을 사용하여 -80 ℃에서 동결.

실험 쥐의 2. 감염

1. 부드럽게 따뜻한 정맥을 팽창하기 위해 가열 상자에 CD1에게 여성 마우스 (~ 21-25g)을 놓습니다. 플라스틱 구속으로 가온 마우스를 넣고, 마우스 당 4,000 트리파노소마 동등한 꼬리 정맥 내로 25 G 바늘 정맥 0.2ml의 접종 물을 희석하여 주입. 출혈을 막기 위해 후 주사 부위에 압력을 넣습니다.
   복강 내 감염은 감염의 유효한 경로이며, 이전의 연구 ^(10)에 사용되어왔다, 그러나 우리는 정맥 경로보다이 덜 재현 발견 :합니다.
2. SPF-배출 케이지 3 그룹에 감염된 마우스와 케이지를 무작위로. 대조군으로서, 야생형 비 생물 발광 기생충, T.와 CD1 암컷 마우스를 주입 비. brucei GVR35 (N =삼).
3. 혈액 영화 현미경을 통해 감염을 모니터링
   1. 스팟 5 μL의 유리 슬라이드 상 venepuncture 또는 사혈에서 혈액 (부드럽게 박막을 생성하기 위해 상기 슬라이드를 통해 혈액의 방울을 밀어 제 유리 슬라이드를 이용) 혈액 도말 표본을 수행한다. 공기 건조에 슬라이드를 허용합니다.
   2. DH ₂ O로 세척하기 전에 10 분 동안 김사 100 % 메탄올 및 얼룩과 혈액 도말 표본을 수정하고 공기 건조를 할 수 있습니다. 100X 목적에서보기 (FOV)의 10 분야에서 트리 파노 솜의 수를 계산합니다.
      주 : 혈액 촬영이 일찍 일일 감염 후 같은 전체 동물의 비 침습적 영상과 함께 실시된다. 동물들을 처리 할 때 샘플을 실온에서 저장하고 나중에 계산 될 수 있으므로, 트리파노소마 정량이 방법은 혈구 계수보다 선호된다.

3. 생물 발광 이미징 감염을 추적하는

참고 : 감염을 모니터링하려면 전체 ANIM알 비파괴 이미징을 이용할 수있다.

1. 30 ㎎ / ㎖에서 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS)에서 D-루시페린, 반딧불 루시 페라 기판의 재고 솔루션을 준비합니다. 필터 소독 및 -20 ° C에서 분량 씩 냉동.
   참고 : D-루시페린 민감한 빛 때문에 호일에 분량 씩 포장하여 빛으로부터 보호. 이 활동 ^{11에 영향을} 미칠 수있는 반복 루시페린 - 해동 냉동하지 마십시오.
2. 실온 D-루시페린의 나누어지는을 따뜻하게. (nonbioluminescent 야생 형 기생충 균주에 감염 제어 마우스 포함) 케이지에서 각 마우스를 제거하고 복강 25 G 바늘과 150 밀리그램 / (DPBS에 희석) 가온 D-루시페린의 kg을 주입. / 분 2.5 L에서 2 % 이소 플루오 란 / O ₂ 믹스 마취를 유도하기 위해 약 5 분 동안 이소 플루오 란 챔버에 마우스를 놓습니다.
   참고 : 그들이 마취 할 때 마우스가 움직이지된다. 여기에 사용되는, 이미 저를 들어, 마우스 3 번에 처리 될 수있다. 마우스는 anesthet 경우이상 30 분 동안화된 안과 인공 눈물 연고 마르지 마우스의 눈을 방지하기 위해 적용될 수있다.
3. 여기에 설명 된 이미 저를 들어, 소프트웨어를 열고 제조업체의 지침에 따라 소프트웨어를 사용하여 시스템을 초기화합니다. 카메라 가열 플레이트가 온도에 도달 한 후에는 이미지를 획득.
   참고 :이 장비는 보통 하룻밤 배경 교정을 수행하는 시스템을 가능하게 꺼져되지 않습니다. 그것은 다시 시작해야하는 경우, 먼저 교정 검사를 실행해야합니다.
4. (3.5 참조) 이미 저에 마취 마우스를 놓습니다. 어떤 밝은 생물 발광 신호를 통해 출혈을 최소화하기 위해 마우스 사이에 큰 검은 분리기를 사용합니다. 노출 시간의 세트를 이용하여, 화상을 마우스; 뷰 E 매체 비닝 1 F / 정지 개방 필터 및 필드 1, 3, 10, 30, 60 및 180 초 (12.5 X 12.5 cm ^2).
   참고 : 야생형 nonbioluminescent GVR35 기생충에 감염 제어 마우스가, 배경을 제공운드, 생물 발광 값입니다. 이 모델과 함께 루시페린의 반응 속도 실험 (그림 6)에서, 우리는 10 분에서 생물 발광 신호 피크 관리를 게시하고 영상은 약 3 마우스 5 분 걸리는 것으로 나타났습니다. 마취와 쥐를 이미징 할 때 고려 사항으로이 척도를 가져 가라.
5. 쥐의 철저한 영상을 보장하기 위해, 복부, 지느러미와 측면보기를 얻기 위해 회전합니다. 순차적 동물 사이의 이미징을위한 방향의 순서로 일관성을 유지한다.
6. 촬영 후, 마우스는 SPF-케이지에 반환하기 전에 관찰하에 마취에서 회복 할 수 있습니다.
7. 21 일 후 감염 될 때까지 매 7 일마다 마우스 이미징 계속합니다. 전체 동물을 통해 생물 발광 신호의 꾸준한 증가가 있어야합니다.
8. D21, 이미지와 혈액 필름 / kg diminazene aceturate 복강 40 mg을 가진 쥐를 상기하고, 선량으로 쥐에서. 이 약은 주변 기생충을 취소되지만 혈액 꼰 로프 코를 교차하지 않습니다N 장벽, 따라서 CNS 감염 나은 시각화를 가능하게한다.
   참고 Diminazene aceturate의 초기 단계 동물 트리파노소마 증을 치료하기 위해 사용하는 잘 확립 된 약물이다.
9. D28과 D35에서 이미징 및 모니터링을 계속합니다.

4. CNS 감염을 확인

1. D35에서, 위에서 설명한 바와 같이 이미지 마우스 (3.1-3.4 단계).
2. 촬영 후, 추가 분석을 위해 혈액을 수집, 단계 1.6-1.8에 설명 된대로 마우스는 마취에게서 피를 뽑다 마우스를 복구 할 수 있습니다.
3. 심장 천자 후, 20 ml의 PBS와 마우스를 관류 (옵션 : 3 밀리그램 / 관류 액에 루시페린 ml의 추가) 기관에서 혈액을 취소하고 시간 간격 뇌 영역에서 삭제했을 수 있습니다 루시페​​린 레이블을 재 도입하는 마음을 통해 단계 4.1.
4. 부드럽게 뇌 있도록, 만곡 가위를 이용하여 두개골의 원주 둘레베이스로부터 절단하고, 두개골 상부를 올려 뇌를 제거부드럽게 곡선 집게 함께 해제된다.
5. 적절한 루시페린이 절제 뇌에 추가 된 보장하기 위해, 검은 색 플라스틱 피펫 이전 이미지로 기관을 통해 15 ㎎ / ㎖ 루시페린의 50 μL의 한 부분에 절제된 뇌를 놓습니다. 위와 같이 설정을 사용하여 이미지. 이것은 뇌 반구에 감염의 지역화를 시연 할 예정이다.
   주 : 앞서 ⁸ 바와 같이 절제 뇌 기생충의 하류 정량화 qPCR에 의해 수행 될 수있다. 다른 대안 다운 스트림 응용 프로그램은 고정 다음 뇌 조직에 기생충을 식별하기 위해 조직 학적 또는 면역 조직 화학을 포함 할 수 있습니다.

생물 발광 이미징 5. 정량

주 : 생물 발광 이미징 소프트웨어이자 (ROI)의 영역을 사용하여 정량화 배경 생물 발광 대해 보정 될 수있다.

1. 투자 수익 (ROI) 도구를 사용하면, 전체 동물의 정량 A의 직사각형 ROI를 생성차 마우스의 꼬리의베이스에 코 끝을 충당하기 위해 마우스를 이미지 위에 올려 놓으. 각 동물마다 포인트에 동일한 크기의 창을 사용. 뇌에 대한 ROI를 볼 때, 이미지에 마우스 두부를 위에 위치시키는, 동일한 방법으로 원형 ROI를 사용한다.
2. 원하는 경우, 감염의 시각적 표현에 대해 동일한 스펙트럼에 나타나는 이미지를 조정합니다.
   참고 : 여기에 사용되는 소프트웨어가 자동으로 최소 및 최대 광자 계수 조정 각 이미지의 색상 맵을 생성한다. 일련의 이미지 사이의 시각적 비교를 사용하려면, 컬러 스케일은 모든 이미지에 대해 동일한 값으로 설정해야합니다.
   1. 가장 높은 생물 발광 및 도구 팔레트에서 '이미지 조정'탭을 갖는 이미지를 사용하여, 로그 스케일과 적절한 컬러 규모의 최소 및 최대 (경험적으로 결정되는)을 선택합니다. 실험을 통해 모든 이미지에이 비율을 적용합니다.

결과

이 프로토콜은 T.와 마우스의 감염 다음 질병의 진행을 수행하는 방법을 보여줍니다 비. brucei는 인간의 아프리카 트리파노소마 증의 모델이. 그림 1 치료 및 이미징 단계의 시간표를 보여주는 실험 프로토콜의 타임 라인을 보여줍니다.이 주변 기생충을 정량하는 데 사용되는 고정 김사 묻은 혈액 도말 검사에서보기의 전형적인 필드?...

토론

생물 발광의 T. 개발 비. brucei GVR35 변형 후반 단계에 이른에서 트리파노소마 감염의 시각화 할 수 있습니다. 이전 감염 모델 기생충은 뇌에있는 경우 혈액 막 현미경에서 실시간으로, 말기를 검출 할 수 없었다 및 기생 부하 ^(12)를 결정하기 위해 감염된 마우스에서 뇌의 컬링 및 제거가 필요했다. 하나의 마우스 감염의 전체 및 모든 단계에서 관찰 할 수 감염의 빠른 질적 평가...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Sigma, UK	P4417	tablets pH 7.4
Glucose	Sigma, UK	G8270	99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride	Sigma, UK	A9434	99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt)	Sigma, UK	H0878
Hi-FCS	Gibco, Life Technologies, UK	10500-064	500 ml
DPBS	Sigma, UK	D4031	Sterile filtered
Mr. Frosty	Nalgene, UK
Giemsa	Sigma, UK	G5637
D-Luciferin	Perkin Elmer, UK
	Sigma, UK	115144-35-9
Diminazene aceturate	Sigma, UK	D7770	Analytical grade
IVIS Lumina II	Perkin Elmer, UK		other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2	Perkin Elmer, UK		proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10142104
20 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10743785
25G Needles	Greiner Bio-one	N2516
21G Needles	Greiner Bio-one	N2138
Twin-frosted microscope slide	VWR, UK	631-0117
1.5 ml microcentrifuge tube	StarLab, UK	I1415-1000
7 ml Bijou tube	StarLab, UK	E1412-0710
Mouse restrainer	Sigma, UK	Z756903	our restrainer was made in-house, this is a similar model