Биолюминесценции визуализации для обнаружения поздней стадии инфекции африканского трипаносомоза

Резюме

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Аннотация

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.

Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.

Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

Введение

Human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, is caused by the vector-borne protozoan parasites of the Trypanosoma brucei spp¹. Estimated numbers of current cases is fewer than 7 thousand every year with almost 70 million people exposed to the risk of the parasite infection within the African continent. The disease, which is most often lethal if left untreated, comprises an early hemolymphatic stage where parasites are present in the blood, progressing to the late stage when parasites invade the central nervous system (CNS) and are no longer susceptible to treatment by early stage trypanosomal drugs². The current drug therapies for late-stage HAT have both complex, prolonged, treatment regimens and severe adverse effects as well as reported resistance, therefore research into new drug therapies is imperative^3,4.

The study of late-stage human African trypanosomiasis (HAT) within traditional mouse models is lengthy and complex, with the removal of brain tissue being required to monitor parasitic burden⁵. The animal infective strain T. b. brucei is used as the study model of trypanosomiasis with the late stage appearing 21 days post infection (dpi). To monitor the wild type nonbioluminescent parasite infection in the mouse model, peripheral blood films or quantitative PCR are the only methods to determine parasite burden. For parasite burden in the brain, the mouse needs to be culled, brain excised and qPCR carried out on tissues, making it impossible to track parasites through multiple time points in the late stage infection. This results in the inability to follow real-time infections within the central nervous system (CNS).

In vivo bioluminescence imaging (BLI) can provide highly sensitive, non-invasive detection of parasite dissemination and disease progression in a mouse model that can be followed in a single animal for the entirety of the experiment⁶. BLI is based on the emission of light in the visible spectrum produced by a luciferase-catalyzed reaction. The emitted photons are then detected by a charge coupled device (CCD) camera⁷. For this purpose, the pathogen is genetically modified to express a luciferase protein and the substrate, luciferin, is introduced at time points of interest by injection. The main advantage of this method is the ability to carry out longitudinal studies, in which the same animal can be imaged several times with minimal adverse effects. The acquired bioluminescence signal can be quantified, thus indicating the pathogen burden.

The optimization and validation of a red-shifted bioluminescent T. b. brucei has enabled the investigation of the late stage infection through non-invasive procedures, detecting parasites earlier than blood film microscopy and greatly reducing the time, cost and numbers of animals needed to study CNS infection and drug screening in late-stage trypanosomiasis^8,9. In this protocol we demonstrate infection of mice with bioluminescent trypanosomes and how to then visualize the parasites in vivo for quantification of disease progression and CNS penetration.

протокол

Этика
Вся работа проводилась в рамках утверждения внутренних дел Великобритании животных (научные процедуры) Закон 1986 года и Лондонской школы гигиены и тропической медицины защиты животных и Совета по рассмотрению этики. ARRIVE руководство следуют в настоящем докладе.

1. В Vivo Прохождение Биолюминесцентный Trypanosoma brucei brucei

1. Удалить криоконсервированное запас (называемый stabilate) Т. б. brucei штамм GVR35-VSL-2 (можно получить у профессора Джона Келли на Лондонской школы гигиены и тропической медицины через MTA) ⁹ из жидкого азота и позволяют уравновешиваться до комнатной температуры. Развести stabilate до 2 х 10 ⁴ трипаносом / мл в стерильном фосфатно - солевого буферного раствора глюкозы (PBS-G) , рН 8,0 (1 л PBS + 15 г глюкозы) ^10.
   Примечание: T. б. brucei GVR35-VSL-2 не является заразным для человека и требует SAPO лицензированных объектов для проведения экспериментов.
2. InjЭСТ 20-25 г женская CD1 мышь с 0,2 мл разбавленных трипаносом через внутрибрюшинно (IP) с иглой 25 G. Это "донор мыши". Поместите зараженную мышь в специфических патогенов (SPF) -cage и корма вволю.
   Примечание: мышей CD1 являются беспородных штамм и T. б. brucei GVR35 инфекции хорошо характеризуются в этом штамме. Тем не менее, этот протокол также применим к инбредных или генетически модифицированных штаммов, но важно отметить , что цвет меха может оказать влияние на чувствительность визуализации ^6,9.
3. Монитор периферической паразитемии путем забора крови. Поместите мышь в пластиковый фиксатор и возьмите 5 мкл крови из хвоста путем венепункции с 21 G иглой или кровопускание и смешивают с 1/10 0,85% хлорида аммония стерильными лизировать эритроциты и позволяют легче считать.
4. Подсчитайте разведенной крови в Нойбауэра гемоцитометра.
   1. Загрузите разбавленную кровь в обеих палатах. Подсчитайте всю центральную гридентификатор одной камеры , чтобы дать п трипаносом. Концентрация трипаносом в крови = N × 10 ⁴ трипаносом / мл, отрегулировать для любого коэффициента разбавления и вычислить среднее из двух палат.
      Примечание: Примерно через 5-7 дней после заражения, периферическая паразитемия должна подниматься достаточно , чтобы осуществить инфекцию в концентрации 2 × 10 ⁴ трипаносом / мл.
5. Когда трипаносом уровни достаточно для количества мышей требуется высокая, переходите к шагу 1.6. Уровень паразитемия 6 × 10 ⁴ трипаносом / мл в одной мыши - донора достаточно для заражения 10 мышей.
   Примечание: Для получения статистически значимых размеров группы, п = 6 для каждой группы лечения мышей необходимы ^8. Для других моделей инфекции, расчеты мощности должны были бы быть применены для определения соответствующих размеров групп.
6. Место мышей в коробку тепла (при 28-30 ° С в течение примерно 5-10 мин), чтобы позволить хвостовые вены расширяются.Для индукции анестезии терминала, администрирование 20 мг / кг пентобарбитала внутривенно с иглой 25 G. Подтвердите мышь под наркозом, осторожно нажимая, чтобы обеспечить разбойников нет вывода рефлекс.
7. Heparinize 21-G иглу на аликвоты по 5 мл гепарин в количестве 5000 USP ед / мл в трубку Bijou и сосать два раза в и из иглы, прикрепленной к 1 мл шприца.
8. Возьмем гепаринизированной 21 G иглу и шприц емкостью 1 мл, и выполняют пункции сердца на анестезированных прохода мыши путем вставки иглы по центру под грудной клеткой (шарик крови скапливались в основании иглы) и осторожно потянуть назад на поршень чтобы не свернуть камеры сердца. Соберите как минимум 0,7 мл крови.
9. Развести инфицированной крови для получения инокулята 2 х 10 ⁴ трипаносом / мл в PBS-G рН 8,0 , как шаг 1.1 выше.
   Примечание: В этот момент, оставшаяся кровь может быть криосохранить производить stabilate путем смешивания с 8% глицерина, 20% инактивированной нагреванием фетальной чаЛФ в сыворотке крови (привет-FCS) и 72% инфицированной крови. Медленно замерзать при температуре -80 ° C с использованием медленного замораживание контейнера для достижения скорости охлаждения -1 ° С / мин, до передачи в жидкий азот.

2. Заражение подопытных мышей

1. Поместите CD1 самок мышей (~ 21-25 г) в коробку нагрева мягко теплой, чтобы расширить вены. Поместите прогреваемых мышей в пластиковую сдержанностью и вводят 0,2 мл разбавленного прививочный внутривенно с 25 G иглой в хвостовую вену, что эквивалентно 4000 трипаносом на мышь. Установите давление в месте инъекции после этого, чтобы остановить кровотечение.
   Примечание: Внутрибрюшинный инфекция является допустимым путем заражения и использовалась в предыдущих исследованиях ^10, но мы обнаружили , что это менее воспроизводимыми , чем при внутривенном введении.
2. Перемешайте зараженных мышей и клетки в группах по 3 в SPF-вентилируемых клетках. В качестве контроля, вводят CD1 самок мышей дикого типа не-биолюминесцентном паразита, T. б. brucei GVR35 (п =3).
3. Монитор инфекции через кровь Фильма микроскопией
   1. Пятно 5 мкл крови из венепункции или кровопускание на предметное стекло и выполнить мазок крови (с использованием второго предметного стекла осторожно толкать каплю крови через слайд, чтобы произвести тонкую пленку). Разрешить слайды высохнуть на воздухе.
   2. Закрепите мазок крови с 100% -ным метанолом и красителем Гимза в течение 10 мин перед полосканием с дН ₂ O и дайте высохнуть на воздухе. В соответствии с целью 100X подсчитать количество трипаносом в 10 полях зрения (FOV).
      Примечание: Кровь киносъемки осуществляется параллельно неинвазивной визуализации целого животного, как уже через день после заражения. При обработке ряда животных, этот метод трипаносом количественному предпочтительнее подсчета гемоцитометра, как образцы можно хранить при комнатной температуре, и подсчитывали позже.

3. биолюминесценции визуализации для отслеживания инфекции

Примечание: Для того, чтобы контролировать инфекцию, весь АнимAl неинвазивной визуализации могут быть использованы.

1. Готовят раствор D-люциферин, светлячка субстрата люциферазы, в Дульбекко фосфатно-солевом буферном (DPBS) в дозе 30 мг / мл. Фильтр стерилизовать и заморозить в аликвотах при -20 ° C.
   Примечание: D-Люциферин чувствителен к свету, поэтому защитить его от света, обернув аликвот в фольгу. Не раз при замораживании-оттаивании люциферин , как это может повлиять на активность ^11.
2. Подогреть аликвоты D-люциферин до комнатной температуры. Удалите каждую мышь из клетки (в том числе и у контрольных мышей, инфицированных штаммом nonbioluminescent паразита дикого типа) и вводят 150 мг / кг разогретой D-люциферин (разведенного в ДЗФР) внутрибрюшинно с иглой 25 G. Поместите мышей в изофлуораном камере в течение примерно 5 минут , чтобы вызвать анестезию 2% изофлуораном / O ₂ смеси на уровне 2,5 л / мин.
   Примечание: Мыши становятся неподвижными, когда они находятся под анестезией. Для формирования изображений, используемых здесь, 3 мыши могут быть обработаны одновременно. Если мыши anesthetдартизованных в течение более 30 мин, глазная мазь искусственная слеза может быть применен, чтобы предотвратить глаза мышей от высыхания.
3. Для формирования изображения, описанного здесь, откройте программное обеспечение и инициализировать машину с помощью программного обеспечения в соответствии с инструкциями изготовителя. Получение изображений один раз камера и нагревают пластины достигли температуры.
   Примечание: Этот прибор обычно не выключается, что позволяет машине выполнять фоновые калибровки в течение ночи. В том случае, если ему необходимо перезапустить, он должен выполнить проверку калибровки в первую очередь.
4. Поместите наркозом мышей в томографа (см 3.5). Используйте большие черные разделители между мышами, чтобы свести к минимуму протечки любого яркого биолюминесцентного сигнала. Мыши изображений с помощью набора времени воздействия; 1, 3, 10, 30, 60 и 180 секунд со средней степенью биннинга, 1 F / остановки и открытого фильтра, и поле зрения Е (12,5 х 12,5 см ^2).
   Примечание: Контрольные мыши, инфицированные диким типом nonbioluminescent GVR35 паразитов обеспечивают backgrЗначение биолюминесценции круглый вырез. Из эксперимента кинетики люциферин (рис 6) с этой моделью, мы обнаружили , что пики биолюминесценции сигнала на 10 минут после введения и обработки изображений занимает около 5 мин для 3 мышей. Возьмите эту временную шкалу во внимание при обезболивающее и визуализации мышей.
5. Для того, чтобы обеспечить тщательное съемку мышей, вращать, чтобы получить вентральной, спинной и боковой вид. Поддержание последовательности в порядке ориентации для визуализации между последовательными животных.
6. После обработки изображений, позволяют мышей восстановиться после анестезии под наблюдением перед возвращением в SPF-клетки.
7. Продолжайте визуализации мышей через каждые 7 дней до 21-й день после заражения. Там должно быть постоянное увеличение сигнала биолюминесценции в течение всего животного.
8. На D21, изображение и мазке крови у мышей, как описано выше, и дозы мышей с 40 мг / кг Диминазина aceturate внутрибрюшинно. Этот препарат очистит периферической паразитемии, но не будет пересекать крови-BRAIп барьера, и, следовательно, обеспечивает лучшую визуализацию инфекции ЦНС.
   Примечание: Диминазина aceturate является устоявшейся препарат, используемый для лечения на ранней стадии трипаносомоз животных.
9. Продолжить визуализации и мониторинга на D28 и D35.

4. Подтверждая ЦНС инфекции

1. На D35, изображения мышей, как описано выше (шаги 3.1-3.4).
2. После обработки изображений, позволяют мышам, чтобы оправиться от анестезии и обескровить мышей, как описано в стадии 1,6-1,8, сбора крови для дальнейшего анализа.
3. После пункции сердца, обрызгивать мышей с помощью 20 мл PBS (дополнительно: добавляют 3 мг / мл люциферин к перфузионной раствора) через сердце, чтобы очистить кровь от органов и вновь ввести люциферин метки, которые, возможно, удалены из области мозга, в течение интервала времени начиная с шага 4.1.
4. Аккуратно удалите мозг, используя изогнутые ножницы, резки от основания по окружности черепа и отрывая верхнюю часть черепа, чтобы мозгчтобы быть аккуратно сняты с изогнутыми щипцами.
5. Поместите вырезанную мозг на участке из черного пластика и пипеткой 50 мкл 15 мг / мл люциферин через орган до визуализации, чтобы обеспечить адекватное люциферин был добавлен к вырезанной мозга. Изображение с использованием параметров, как описано выше. Это продемонстрирует локализацию инфекции полушарий головного мозга.
   Примечание: Вниз по течению Количественное паразитемии на вырезанной головного мозга может быть осуществлено с помощью кПЦР , как описано ранее ^8. Другие приложения альтернативные вниз по течению могут включать в себя гистологию или иммуногистохимии для выявления паразитов в ткани головного мозга после записи.

5. Количественный биолюминесценции изображений

Примечание: биолюминесценции может быть определена количественно с использованием области интереса (ROI) с программным обеспечением обработки изображений и корректируются на фоне биолюминесценции.

1. С помощью инструмента ROI, создать прямоугольную ROI для целого животного а количественногой позиционировать курсор на изображение мыши, чтобы покрыть кончик носа до основания хвоста мыши. Используйте ту же коробку размера для каждого животного и каждый момент времени. При взгляде на ROI для головного мозга, используют круговую ROI таким же образом, позиционирование ее на области головы мыши на изображении.
2. При желании можно настроить изображение, чтобы появиться на том же спектре для визуального представления инфекции.
   Примечание: Программное обеспечение, используемое здесь создает цветовую карту для каждого изображения автоматически настраивается для минимального и максимального фотоотсчетов. Чтобы включить визуальное сравнение между серией изображений, цветовая гамма должна быть установлена ​​в одних и тех же значений для всех изображений.
   1. Используя изображение с наивысшим биолюминесценции и на вкладке "Регулировка изображения" на палитре инструментов, выберите логарифмическую шкалу и соответствующую цветовую шкалу минимального и максимального значений (определяется эмпирически). Применить эту шкалу для всех изображений на протяжении всего эксперимента.

Результаты

Этот протокол показывает , как следовать за прогрессирования заболевания после заражения мышей с T. б. brucei, модель для африканского трипаносомоза человека. На рисунке 1 показана временная шкала экспериментального протокола, демонстрируя график обработк?...

Обсуждение

Развитие биолюминесцентного Т. б. brucei GVR35 штамм позволяет визуализацию трипаносом инфекции от начала до поздней стадии. Предыдущие модели инфекции не удалось обнаружить поздней стадии, когда паразиты находятся в головном мозге, в режиме реального времени из пленочной крови микро?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Sigma, UK	P4417	tablets pH 7.4
Glucose	Sigma, UK	G8270	99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride	Sigma, UK	A9434	99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt)	Sigma, UK	H0878
Hi-FCS	Gibco, Life Technologies, UK	10500-064	500 ml
DPBS	Sigma, UK	D4031	Sterile filtered
Mr. Frosty	Nalgene, UK
Giemsa	Sigma, UK	G5637
D-Luciferin	Perkin Elmer, UK
	Sigma, UK	115144-35-9
Diminazene aceturate	Sigma, UK	D7770	Analytical grade
IVIS Lumina II	Perkin Elmer, UK		other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2	Perkin Elmer, UK		proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10142104
20 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10743785
25G Needles	Greiner Bio-one	N2516
21G Needles	Greiner Bio-one	N2138
Twin-frosted microscope slide	VWR, UK	631-0117
1.5 ml microcentrifuge tube	StarLab, UK	I1415-1000
7 ml Bijou tube	StarLab, UK	E1412-0710
Mouse restrainer	Sigma, UK	Z756903	our restrainer was made in-house, this is a similar model