Bioluminescenza Imaging per rilevare fase avanzata di infezione di africani Tripanosomiasi

Riepilogo

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Abstract

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.

Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.

Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

Introduzione

Human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, is caused by the vector-borne protozoan parasites of the Trypanosoma brucei spp¹. Estimated numbers of current cases is fewer than 7 thousand every year with almost 70 million people exposed to the risk of the parasite infection within the African continent. The disease, which is most often lethal if left untreated, comprises an early hemolymphatic stage where parasites are present in the blood, progressing to the late stage when parasites invade the central nervous system (CNS) and are no longer susceptible to treatment by early stage trypanosomal drugs². The current drug therapies for late-stage HAT have both complex, prolonged, treatment regimens and severe adverse effects as well as reported resistance, therefore research into new drug therapies is imperative^3,4.

The study of late-stage human African trypanosomiasis (HAT) within traditional mouse models is lengthy and complex, with the removal of brain tissue being required to monitor parasitic burden⁵. The animal infective strain T. b. brucei is used as the study model of trypanosomiasis with the late stage appearing 21 days post infection (dpi). To monitor the wild type nonbioluminescent parasite infection in the mouse model, peripheral blood films or quantitative PCR are the only methods to determine parasite burden. For parasite burden in the brain, the mouse needs to be culled, brain excised and qPCR carried out on tissues, making it impossible to track parasites through multiple time points in the late stage infection. This results in the inability to follow real-time infections within the central nervous system (CNS).

In vivo bioluminescence imaging (BLI) can provide highly sensitive, non-invasive detection of parasite dissemination and disease progression in a mouse model that can be followed in a single animal for the entirety of the experiment⁶. BLI is based on the emission of light in the visible spectrum produced by a luciferase-catalyzed reaction. The emitted photons are then detected by a charge coupled device (CCD) camera⁷. For this purpose, the pathogen is genetically modified to express a luciferase protein and the substrate, luciferin, is introduced at time points of interest by injection. The main advantage of this method is the ability to carry out longitudinal studies, in which the same animal can be imaged several times with minimal adverse effects. The acquired bioluminescence signal can be quantified, thus indicating the pathogen burden.

The optimization and validation of a red-shifted bioluminescent T. b. brucei has enabled the investigation of the late stage infection through non-invasive procedures, detecting parasites earlier than blood film microscopy and greatly reducing the time, cost and numbers of animals needed to study CNS infection and drug screening in late-stage trypanosomiasis^8,9. In this protocol we demonstrate infection of mice with bioluminescent trypanosomes and how to then visualize the parasites in vivo for quantification of disease progression and CNS penetration.

Protocollo

Etica
Tutto il lavoro è stato realizzato sotto l'approvazione del Regno Unito per la casa Ufficio Animali (procedure scientifiche) Act 1986 e la London School of Hygiene & Tropical Medicine Animal Welfare and Ethics Review Board. ARRIVARE linee guida sono seguite in questo rapporto.

1. In Vivo Passaggio di Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei

1. Rimuovere uno stock crioconservati (stabilate definito) di T. b. brucei ceppo GVR35-VSL-2 (disponibile dal professor John Kelly presso la London School of Hygiene & Tropical Medicine attraverso MTA) ⁹ da azoto liquido e permettono di equilibrare a temperatura ambiente. Diluire stabilate a 2 x 10 ⁴ trypanosomes / ml in sterile tampone fosfato glucosio (PBS-G) pH 8,0 (1 L PBS + 15 g di glucosio) ^10.
   Nota: T. b. brucei GVR35-VSL-2 non è contagioso per gli esseri umani e richiede SAPO licenza strutture per effettuare esperimenti.
2. inject 20-25 g femminile del mouse CD1 con 0,2 ml trypanosomes diluiti per via intraperitoneale (ip) con un ago da 25 G. Questo è il "mouse donatore". Posizionare il mouse infetto in uno specifico patogeno libero (SPF) -cage e mangimi ad libitum.
   Nota: i topi CD1 sono un ceppo outbred e T. b. infezioni brucei GVR35 sono ben caratterizzati in questo ceppo. Tuttavia, questo protocollo è applicabile anche a ceppi inbred o geneticamente modificati, ma è importante notare che il colore della pelliccia possono influire sulla sensibilità dell'imaging ^6,9.
3. Monitorare parassitemia periferica dal prelievo di sangue. Posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione di plastica e prendere 5 ml di sangue dalla coda per via venosa con 21 G ago o venesection e mescolare 1/10 con cloruro di ammonio sterile 0,85% per la lisi dei globuli rossi e consentire una più facile conteggio.
4. Contare il sangue diluito in un Neubauer emocitometro.
   1. Caricare il sangue diluito in entrambe le camere. Conta l'intero gr centraleid di una camera per dare n trypanosomes. Concentrazione di trypanosomes nel sangue = n x 10 ⁴ trypanosomes / ml, regolare per qualsiasi fattore di diluizione e calcolare la media delle due camere.
      Nota: Dopo circa 5-7 giorni dopo l'infezione, parassitemia periferica dovrebbe aumentare in misura sufficiente a svolgere una infezione ad una concentrazione di 2 x 10 ⁴ tripanosomi / ml.
5. Quando i livelli di trypanosome sono sufficienti per il numero di topi richiesti alta, passare al punto 1.6. Un livello parassitemia di 6 x 10 ⁴ trypanosomes / ml in un topo donatore è sufficiente per infezione di 10 topi.
   Nota: Per le dimensioni statisticamente significative del gruppo, n = 6 per ogni gruppo di trattamento di topi sono necessari ^8. Per gli altri modelli di infezione, calcoli di potenza dovrebbero essere applicati per determinare le dimensioni dei gruppi appropriati.
6. Topi posto in una scatola di calore (a 28-30 ° C per circa 5-10 minuti) per consentire le vene coda di dilatarsi.Per indurre anestesia terminale, somministrare 20 mg / kg ev pentobarbital con un ago 25 G. Conferma del mouse è anestetizzato premendo delicatamente i cuscinetti plantari per garantire che non vi è alcun riflesso di ritiro.
7. Eparinizzare un ago G 21 aliquotandolo 5 ml eparina a 5.000 USP unità / ml in un tubo Bijou e succhiare due volte dentro e fuori l'ago di una siringa da 1 ml.
8. Prendere la eparinizzato 21 G ago e siringa da 1 ml, ed eseguire puntura cardiaca sul mouse passaggio anestetizzato inserendo l'ago centralmente sotto la gabbia toracica (una goccia di sangue piscina nella base dell'ago) e tirare delicatamente lo stantuffo in modo da non comprimere la camera del cuore. Raccogliere un minimo di 0,7 ml di sangue.
9. Diluire sangue infetto per produrre un inoculo di 2 x 10 ⁴ trypanosomes / ml in PBS-G pH 8,0 come al punto 1.1.
   Nota: A questo punto, il sangue rimanente può essere crioconservati per produrre stabilate miscelando con 8% glicerolo, 20% inattivato al calore ca fetalesiero lf (hi-FCS) e il 72% di sangue infetto. Lentamente congelare a -80 ° C usando un lento congelamento contenitore congelamento per ottenere una velocità di raffreddamento di -1 ° C / min, prima del trasferimento a azoto liquido.

2. L'infezione di topi sperimentale

1. Posizionare CD1 topi di sesso femminile (~ 21-25 g) in una scatola di riscaldamento a delicatamente calda per dilatare le vene. Posizionare i topi riscaldati in un sistema di ritenuta di plastica e iniettare 0,2 ml inoculo diluito per via endovenosa con un ago G 25 nella vena della coda, pari a 4.000 trypanosomes per topo. Mettere pressione al sito di iniezione in seguito per fermare l'emorragia.
   Nota: infezione intraperitoneale è un percorso valida di infezione ed è stato utilizzato in studi precedenti ^10, ma abbiamo trovato questo meno riproducibile rispetto alla via endovenosa.
2. Randomize topi infetti e la gabbia in gruppi di 3 in gabbie SPF-ventilati. Come controllo, iniettare CD1 topi femmina con wild type parassita non bioluminescente, T. b. brucei GVR35 (n =3).
3. Monitorare l'infezione attraverso il sangue Film Microscopia
   1. Spot 5 ml di sangue da prelievo venoso o salasso su un vetrino ed eseguire uno striscio di sangue (utilizzando un secondo vetrino spingere delicatamente la goccia di sangue in tutto il vetrino per produrre un film sottile). Lasciare le diapositive asciugare all'aria.
   2. Fissare lo striscio di sangue con il 100% di metanolo e macchia con Giemsa per 10 minuti prima di risciacquare con dH ₂ O e lasciare asciugare all'aria. Sotto obiettivo 100X contare il numero di tripanosomi in 10 campi di vista (FOV).
      Nota: le riprese sangue viene eseguita insieme a tutto l'animale di imaging non invasivo più presto dopo l'infezione di un giorno. Durante l'elaborazione di un numero di animali, questo metodo di quantificazione tripanosoma è preferito rispetto conteggio emocitometro come i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente e successivamente contati.

3. bioluminescenza Imaging per tenere traccia delle infezioni

Nota: Per monitorare l'infezione, tutto animAl imaging non invasivo può essere utilizzato.

1. Preparare una soluzione stock di D-luciferina, il substrato luciferasi di lucciola, in Dulbecco tampone fosfato (DPBS) a 30 mg / ml. Filtro sterilizzare e congelare in aliquote a -20 ° C.
   Nota: D-Luciferin è sensibile alla luce, quindi proteggerlo dalla luce avvolgendo aliquote in un foglio. Non più volte di gelo-disgelo luciferina in quanto può influenzare l'attività ^11.
2. Scaldare una aliquota di D-luciferina a temperatura ambiente. Rimuovere ogni mouse dalla gabbia (compresi topi di controllo infettate con nonbioluminescent ceppo wild type parassita) e iniettare 150 mg / kg di D-luciferina riscaldato (diluito in DPBS) per via intraperitoneale con un ago 25 G. Posizionare il mouse in una camera isofluorane per circa 5 minuti per indurre l'anestesia con il 2% isofluorane / O ₂ miscela a 2,5 L / min.
   Nota: I topi diventano immobile quando sono sotto anestesia. Per l'imager qui utilizzato, 3 topi possono essere elaborati in un momento. Se i topi sono anesthetzato per più di 30 minuti, unguento oftalmico lacrima artificiale può essere applicato per prevenire gli occhi dei topi si secchi.
3. Per l'imager qui descritto, aprire il software e inizializzare la macchina utilizzando il software secondo le istruzioni del produttore. Acquisire le immagini una volta fotocamera e la piastra riscaldata hanno raggiunto la temperatura.
   Nota: questo strumento non è di solito spento, consentendo alla macchina di eseguire calibrazioni di fondo durante la notte. Nel caso in cui deve essere riavviata o deve eseguire un controllo di calibrazione prima.
4. Mettere i topi anestetizzati nella termocamera (cfr 3,5). Utilizzare grandi separatori neri tra i topi per ridurre al minimo sanguinare attraverso di qualsiasi segnale bioluminescente luminoso. topi immagine utilizzando una serie di tempi di esposizione; 1, 3, 10, 30, 60 e 180 secondi, con medie discretizzazione, 1 f / stop e un filtro aperto, e il campo visivo E (12.5 x 12.5 cm ^2).
   Nota: I topi di controllo infettati con il tipo selvatico parassiti GVR35 nonbioluminescent forniscono un backgrvalore di bioluminescenza ound. Da un esperimento di cinetica di luciferina (Figura 6), con questo modello, abbiamo trovato che i picchi di segnale bioluminescenza a 10 minuti dopo la somministrazione e l'imaging dura circa 5 minuti per 3 topi. Prendete questo lasso di tempo in considerazione quando anestetizzare e di imaging i topi.
5. Per garantire l'imaging approfondito dei topi, ruotare per ottenere una ventrale, dorsale e vista laterale. Mantenere la coerenza dell'ordine di orientamento per l'imaging tra animali sequenziali.
6. Dopo l'imaging, permettono topi per recuperare da anestesia sotto osservazione prima di tornare a SPF-gabbia.
7. Continuare l'imaging topi ogni 7 giorni fino al giorno 21 dopo l'infezione. Ci dovrebbe essere un costante aumento del segnale bioluminescenza sull'intera animale.
8. Al D21, immagini e striscio di sangue dei topi come descritto in precedenza, e la dose topi con 40 mg / kg per via intraperitoneale Diminazene aceturato. Questo farmaco cancellerà il parasitemia periferico, ma non attraverserà la barriera emato-Brain barriera, e permette quindi una migliore visualizzazione dell'infezione CNS.
   Nota: Diminazene aceturato è un farmaco comunemente utilizzate per il trattamento di tripanosomiasi animale fase iniziale.
9. Continuare l'imaging e il monitoraggio a D28 e D35.

4. Conferma CNS infezione

1. Al D35, topi immagine sopra descritto (passi 3,1-3,4).
2. Dopo l'imaging, permettono di recuperare i topi da topi anestesia e Exsanguinate come dettagliato nella fase 1,6-1,8, raccolta di sangue per ulteriori analisi.
3. Dopo puntura cardiaca, perfusione topi con 20 ml di PBS (opzionale: aggiungere 3 mg / ml di luciferina alla soluzione di perfusione) attraverso il cuore per cancellare il sangue dagli organi e di reintrodurre etichetta luciferina che potrebbero aver eliminato dalla regione del cervello durante l'intervallo di tempo dal punto 4.1.
4. Rimuovere delicatamente il cervello, utilizzando forbici curve, tagliando dalla base attorno alla circonferenza del cranio e sollevamento fuori la parte superiore del cranio, per permettere al cervelloper essere delicatamente tirato fuori con le pinze curve.
5. Posizionare il cervello asportato su una sezione di plastica nera e pipettare 50 ml di 15 mg / ml luciferina sopra l'organo prima di imaging, per garantire un'adeguata luciferina è stato aggiunto al cervello asportato. Immagine utilizzando le impostazioni come sopra. Questo dimostrerà localizzazione dell'infezione agli emisferi cerebrali.
   Nota: quantificazione valle parassitemia sul cervello asportato può essere effettuata da qPCR come precedentemente descritto ^8. Altre applicazioni a valle alternative potrebbero includere l'istologia o immunoistochimica per identificare i parassiti nel tessuto cerebrale dopo la fissazione.

5. La quantificazione della bioluminescenza Imaging

Nota: bioluminescenza sia quantificabile secondo la regione di interesse (ROI) con il software di imaging e corretta per lo sfondo bioluminescenza.

1. Utilizzando lo strumento ROI, creare un ROI di forma rettangolare per intero animale quantificazione unnd posizionarlo dell'immagine mouse sopra per coprire punta del naso alla base della coda del topo. Utilizzare la stessa casella di dimensione per ogni animale e ogni punto del tempo. Osservando il ROI per il cervello, utilizzare una ROI circolare nello stesso modo, posizionandolo sopra la regione della testa del mouse nell'immagine.
2. Se necessario, regolare le immagini a comparire sullo stesso spettro per una rappresentazione visiva di infezione.
   Nota: il software utilizzato qui genera una mappa di colori per ogni immagine regolata automaticamente per i conteggi minimo e massimo di fotoni. Per consentire un confronto visivo tra una serie di immagini, la scala di colore deve essere impostato gli stessi valori per tutte le immagini.
   1. Usando l'immagine con il più alto bioluminescenza e la scheda 'Regolazione immagine' sulla tavolozza degli strumenti, selezionare una scala logaritmica e un adeguato minima scala di colori e massima (da determinare empiricamente). Applicare questa scala a tutte le immagini di tutto l'esperimento.

Risultati

Questo protocollo dimostra come seguire la progressione della malattia dopo l'infezione di topi con T. b. brucei, un modello per la tripanosomiasi africana umana. La figura 1 mostra la sequenza temporale del protocollo sperimentale, dimostrando il calendario per la fasi di trattamento e di imaging. La Figura 2 mostra un tipico campo di vista in uno striscio di sangue Giemsa-macchiate fisso utilizzato per quantificare parassitemia periferico,...

Discussione

Lo sviluppo di un T. bioluminescente b. brucei GVR35 ceppo permette la visualizzazione di una infezione tripanosoma dalla presto per la fase tardiva. Precedenti modelli di infezione erano in grado di rilevare la fase avanzata, quando i parassiti sono nel cervello, in tempo reale dalla microscopia striscio di sangue, e richiedevano l'abbattimento e la rimozione dei cervelli dal topi infettati per determinare parassita fardello ^12. La bioluminescenza riduce la variabilità inter-mouse come...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Sigma, UK	P4417	tablets pH 7.4
Glucose	Sigma, UK	G8270	99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride	Sigma, UK	A9434	99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt)	Sigma, UK	H0878
Hi-FCS	Gibco, Life Technologies, UK	10500-064	500 ml
DPBS	Sigma, UK	D4031	Sterile filtered
Mr. Frosty	Nalgene, UK
Giemsa	Sigma, UK	G5637
D-Luciferin	Perkin Elmer, UK
	Sigma, UK	115144-35-9
Diminazene aceturate	Sigma, UK	D7770	Analytical grade
IVIS Lumina II	Perkin Elmer, UK		other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2	Perkin Elmer, UK		proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10142104
20 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10743785
25G Needles	Greiner Bio-one	N2516
21G Needles	Greiner Bio-one	N2138
Twin-frosted microscope slide	VWR, UK	631-0117
1.5 ml microcentrifuge tube	StarLab, UK	I1415-1000
7 ml Bijou tube	StarLab, UK	E1412-0710
Mouse restrainer	Sigma, UK	Z756903	our restrainer was made in-house, this is a similar model