Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

Zusammenfassung

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Zusammenfassung

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.

Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.

Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

Einleitung

Human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, is caused by the vector-borne protozoan parasites of the Trypanosoma brucei spp¹. Estimated numbers of current cases is fewer than 7 thousand every year with almost 70 million people exposed to the risk of the parasite infection within the African continent. The disease, which is most often lethal if left untreated, comprises an early hemolymphatic stage where parasites are present in the blood, progressing to the late stage when parasites invade the central nervous system (CNS) and are no longer susceptible to treatment by early stage trypanosomal drugs². The current drug therapies for late-stage HAT have both complex, prolonged, treatment regimens and severe adverse effects as well as reported resistance, therefore research into new drug therapies is imperative^3,4.

The study of late-stage human African trypanosomiasis (HAT) within traditional mouse models is lengthy and complex, with the removal of brain tissue being required to monitor parasitic burden⁵. The animal infective strain T. b. brucei is used as the study model of trypanosomiasis with the late stage appearing 21 days post infection (dpi). To monitor the wild type nonbioluminescent parasite infection in the mouse model, peripheral blood films or quantitative PCR are the only methods to determine parasite burden. For parasite burden in the brain, the mouse needs to be culled, brain excised and qPCR carried out on tissues, making it impossible to track parasites through multiple time points in the late stage infection. This results in the inability to follow real-time infections within the central nervous system (CNS).

In vivo bioluminescence imaging (BLI) can provide highly sensitive, non-invasive detection of parasite dissemination and disease progression in a mouse model that can be followed in a single animal for the entirety of the experiment⁶. BLI is based on the emission of light in the visible spectrum produced by a luciferase-catalyzed reaction. The emitted photons are then detected by a charge coupled device (CCD) camera⁷. For this purpose, the pathogen is genetically modified to express a luciferase protein and the substrate, luciferin, is introduced at time points of interest by injection. The main advantage of this method is the ability to carry out longitudinal studies, in which the same animal can be imaged several times with minimal adverse effects. The acquired bioluminescence signal can be quantified, thus indicating the pathogen burden.

The optimization and validation of a red-shifted bioluminescent T. b. brucei has enabled the investigation of the late stage infection through non-invasive procedures, detecting parasites earlier than blood film microscopy and greatly reducing the time, cost and numbers of animals needed to study CNS infection and drug screening in late-stage trypanosomiasis^8,9. In this protocol we demonstrate infection of mice with bioluminescent trypanosomes and how to then visualize the parasites in vivo for quantification of disease progression and CNS penetration.

Protokoll

Ethik
Alle Arbeiten wurden im Rahmen der Genehmigung der britischen Home Office Tiere durchgeführt (Scientific Procedures) Act 1986 und der London School of Hygiene & Tropical Medicine Tierschutz und Ethik Review Board. ANKOMMEN Leitlinie werden in diesem Bericht folgt.

1. In - vivo - Passage von Biolumineszenz Trypanosoma brucei brucei

1. Entfernen eines kryokonservierten Lager (genannt Stabilat) von T. b. brucei Stamm GVR35-VSL-2 (erhältlich von Professor John Kelly an der London School of Hygiene & Tropical Medicine durch MTA) ⁹ aus flüssigem Stickstoff und auf Raumtemperatur äquilibrieren. Verdünnte Stabilat bis 2 x 10 ⁴ Trypanosomen / ml in steriler Phosphat - gepufferter Glukosesalzlösung (PBS-G) pH 8,0 (1 l PBS + 15 g Glucose) ^10.
   Anmerkung: T. b. brucei GVR35-VSL-2 ist nicht infektiös für den Menschen und erfordert SAPO Einrichtungen lizenziert Experimente durchzuführen.
2. inject 20-25 g weiblichen CD1-Maus mit 0,2 ml Trypanosomen über die intraperitoneale Injektion (ip) mit einer 25 G-Nadel verdünnt. Dies ist der "Spendermaus". Legen Sie die infizierte Maus in eine spezifische pathogenfreie (SPF) -cage und Futter ad libitum.
   Hinweis: CD1 - Mäuse sind ein Auszucht Stamm und T. b. brucei GVR35 - Infektionen sind in diesem Stamm gut charakterisiert. Jedoch ist dieses Protokoll auch für angeboren oder genetisch veränderte Stämme, aber es ist wichtig , dass die Fellfarbe zu beachten , kann auf die Empfindlichkeit der Bildgebung ^6,9 auswirken.
3. Überwachen peripheren Parasitämie durch Blutentnahme. Platzieren Sie die Maus in eine Plastik Verzögerer und nehmen 5 ul Blut aus dem Schwanz von venepuncture mit 21 G-Nadel oder Aderlässe und mischen 1/10 mit 0,85% sterilem Ammoniumchlorid roten Blutkörperchen zu lysieren und einfacher Zählung ermöglichen.
4. Zählen Sie die verdünntes Blut in einer Neubauer-Zählkammer.
   1. Legen Sie das verdünnte Blut in beiden Kammern. Zählen Sie die gesamte zentrale grID von einer Kammer zu geben n Trypanosomen. Konzentration von Trypanosomen in Blut = n x 10 ⁴ Trypanosomen / ml, für jede Verdünnungsfaktor einzustellen und die Mittel der beiden Kammern berechnen.
      Hinweis: Nach ca. 5-7 Tage nach der Infektion sollte peripheren Parasitämie steigen ausreichend um eine Infektion bei einer Konzentration von 2 x 10 ⁴ Trypanosomen / ml durchzuführen.
5. Wenn Trypanosomen ist hoch genug für die Anzahl der Mäuse erforderlich, bewegen sich auf 1,6 zu treten. Ein Parasitämie Niveau von 6 x 10 ⁴ Trypanosomen / ml in einer Spendermaus ist für die Infektion von 10 Mäusen ausreichend.
   Hinweis: Für die statistisch signifikante Gruppengrößen, n = 6 für jede Behandlungsgruppe von Mäusen werden ⁸ benötigt. Für andere Modelle der Infektion, müssten Leistungsberechnungen angewandt werden, um geeignete Gruppengrößen zu bestimmen.
6. Ort Mäuse in einem Wärmefeld (bei 28-30 ° C für etwa 5-10 min) die Schwanzvenen zu erlauben, zu dilatieren.Zur Auslösung einer Klemme Narkose verabreichen 20 mg / kg Pentobarbital iv mit einer 25 G-Nadel. Bestätigen Sie die Maus wird durch sanftes Drücken der Fußballen narkotisiert, um sicherzustellen, gibt es keine Rückzugsreflex ist.
7. Heparinisierung eine 21 G Nadel durch Aliquotieren 5 ml Heparin bei 5000 USP-Einheiten / ml in einem Bijou Rohr und Saugen zweimal in die und aus der Nadel in eine 1 ml Spritze befestigt.
8. Nehmen Sie die heparinisierte 21 G Nadel und 1-ml-Spritze und führen Herzpunktur auf der narkotisierten Passage Maus durch die Nadel mittig unter dem Brustkorb eingefügt (eine Perle von Blut wird in der Basis des Nadel Pool) und ziehen Sie vorsichtig zurück auf den Kolben um nicht die Kammer des Herzens zu kollabieren. Sammeln Sie ein Minimum von 0,7 ml Blut.
9. Verdünnte infiziertem Blut ein Inokulum von 2 x 10 ⁴ Trypanosomen / ml in PBS-G pH 8,0 als Schritt 1.1 oben zu erzeugen.
   Hinweis: An dieser Stelle kann das restliche Blut kryokonserviert werden Stabilat herzustellen, indem man mit 8% Glycerin mischen, 20% hitzeinaktiviertem fötalen calf Serum (hallo-FCS) und 72% infiziertem Blut. Langsam bei -80 ° C einfrieren ein langsam einfrieren Behälter mit einer Kühlrate von 1 ° C / min zu erreichen, bevor sie mit flüssigem Stickstoff übertragen.

2. Infektion von Versuchsmäusen

1. Platzieren CD1 weibliche Mäuse (~ 21-25 g) in einen Heizkasten sanft warmen Venen zu dilatieren. Legen Sie die erwärmte Mäuse in eine Plastikstütze und injizieren 0,2 ml verdünnte Inokulum intravenös mit einer 25 G-Nadel in die Schwanzvene, das entspricht 4000 Trypanosomen pro Maus. Platzieren Druck an der Injektionsstelle danach die Blutung einzudämmen.
   Hinweis: Die intraperitoneale Infektion eine gültige Route der Infektion und wurde in früheren Studien verwendet worden , ^10, aber wir haben festgestellt , diese weniger reproduzierbar als intravenöser Applikation.
2. Randomize infizierten Mäusen und Käfig in Gruppen von 3 in SPF-belüftete Käfige. Als Kontrolle injizieren CD1 weibliche Mäuse mit Wildtyp nicht Biolumineszenz - Parasiten, T. b. brucei GVR35 (n =3).
3. Überwachen Sie die Infektion durch Blut Film Mikroskopie
   1. Spot 5 ul Blut aus venepuncture oder Aderlässe auf einen Glasträger und führen Sie einen Blutabstrich (mit einem zweiten Glasträger vorsichtig die Tropfen Blut schieben über die Rutsche einen dünnen Film zu erzeugen). Lassen Sie Folien an der Luft trocknen.
   2. Befestigen Sie den Blutabstrich mit 100% Methanol und Fleck mit Giemsa für 10 Minuten , bevor sie mit dH ₂ O gespült und an der Luft trocknen lassen . Unter 100X Ziel zählen die Anzahl der Trypanosomen in 10 Bereichen (FOV).
      Hinweis: Blutdreharbeiten wird neben ganzen Tier nicht-invasive Bildgebung bereits einen Tag nach der Infektion durchgeführt. Wenn eine Anzahl von Tieren Verarbeitung dieses Verfahren der Trypanosomen Quantifizierung über Hämozytometer Zählen bevorzugt, da die Proben können später bei Raumtemperatur und gezählt gespeichert werden.

3. Biolumineszenz Imaging-Infektion zu verfolgen

Hinweis: Um die Infektion zu überwachen, ganze animal nichtinvasive Bildgebung verwendet werden.

1. Vorbereitung einer Stammlösung von D-Luciferin, das Glühwürmchen-Luciferase-Substrat, in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) bei 30 mg / ml. Filter sterilisieren und in Aliquots bei -20 ° C einfrieren.
   Hinweis: D-Luciferin Licht empfindlich ist, daher schützen sie vor Licht von Aliquoten in Folie gewickelt wird. Nicht wiederholt Frost-Tau - Luciferin , wie es ¹¹ - Aktivität beeinflussen können.
2. Wärmen eines Aliquots von D-Luciferin auf Raumtemperatur. Entfernen Sie jede Maus aus dem Käfig (einschließlich Kontrollmäuse infiziert mit nonbioluminescent Stamm Wildtyp-Parasiten) und injizieren 150 mg / kg des erwärmten D-Luciferin (verdünnt in DPBS) intraperitoneal mit einer 25 G-Nadel. Legen Sie die Mäuse in eine Isofluran Kammer für ca. 5 min zu induzieren Anästhesie mit 2% Isofluran / O ₂ Mix bei 2,5 l / min.
   Hinweis: Die Mäuse werden unbeweglich, wenn sie unter Narkose sind. Für den Bildaufnehmer hier verwendet, 3 Mäuse können gleichzeitig verarbeitet werden. Wenn Mäuse sind anesthetized länger als 30 min, können ophthalmische künstliche Tränen Salbe angewendet werden, um die Augen der Mäuse verhindert das Austrocknen.
3. Verwendung der Software gemäß den Anweisungen des Herstellers für den Imager hier beschrieben, die Software öffnen und die Maschine zu initialisieren. Erwerben Sie Bilder einmal Kamera und beheizte Plattentemperatur erreicht haben.
   Hinweis: Dieses Gerät nicht in der Regel ausgeschaltet ist, so dass die Maschine über Nacht Hintergrund Kalibrierungen durchzuführen. Für den Fall, dass es neu gestartet werden muss, es muss eine Überprüfung der Kalibrierung laufen zuerst.
4. Legen Sie die narkotisierten Mäusen in den Imager (siehe 3.5). Verwenden Sie große schwarze Trennzeichen zwischen den Mäusen zu minimieren bluten durch jedes helle Biolumineszenz-Signal. Bild Mäuse eine Reihe von Belichtungszeiten; 1, 3, 10, 30, 60 und 180 Sekunden, mit mittlerer Binning, 1 f / stop und einem offenen Filter und Sichtfeld E (12,5 x 12,5 cm ^2).
   Hinweis: Die Kontrollmäuse infiziert mit den Wildtyp-nonbioluminescent GVR35 Parasiten bieten eine background Biolumineszenz Wert. Aus einem Luciferin Kinetik Experiment (Abbildung 6) mit diesem Modell haben wir die Biolumineszenz Signalspitzen bei 10 Minuten nach der Verabreichung und Imaging dauert ca. 5 min für 3 Mäuse gefunden. Nehmen Sie diesen Zeitplan in Betracht, wenn anesthetizing und Abbilden der Mäuse.
5. Um sicherzustellen, gründliche Abbildung der Mäuse, drehen einen ventralen, dorsalen und Seitenansicht zu erhalten. Pflegen Sie die Konsistenz in der Reihenfolge der Orientierung für die Bildgebung zwischen aufeinanderfolgenden Tieren.
6. Nach der Bebilderung erlauben Mäuse aus der Narkose unter Beobachtung zu erholen, bevor zu SPF-Käfig zurück.
7. Weiter Mäuse Bildgebung alle 7 Tage bis zum Tag 21 nach der Infektion. Es sollte eine stetige Zunahme der Biolumineszenz-Signal über das gesamte Tier sein.
8. Bei D21, Bild und Blut Film die Mäuse wie oben beschrieben, und der Dosis-Mäuse mit 40 mg / kg Diminazen aceturat intraperitoneal. Dieses Medikament wird die periphere Parasitämie klar, aber das Blut-brai nicht überquerenn-Schranke und ermöglicht somit eine bessere Visualisierung der ZNS-Infektion.
   Hinweis: Diminazen aceturat ist ein gut etabliertes Medikament zur Frühstadium nagana behandeln.
9. Weiter Bildgebung und Überwachung bei D28 und D35.

4. Bestätigen ZNS-Infektion

1. Bei D35, Bild Mäuse wie oben beschrieben (Schritte 3,1-3,4).
2. Nach der Bebilderung erlauben Mäuse aus der Narkose und exsanguinate Mäuse in so detailliert Schritt 1,6-1,8, das Sammeln zur weiteren Analyse Blut zu erholen.
3. Nach Herzpunktur, perfuse Mäuse, die mit 20 ml PBS (optional: add 3 mg / ml Luciferin zu Perfusionslösung) über das Herz das Blut aus den Organen zu löschen und Luciferin Etikett wieder einführen, die aus der Region des Gehirns über das Zeitintervall gelöscht haben könnte aus Schritt 4.1.
4. Vorsichtig in das Gehirn zu entfernen, die durch gekrümmte Schere, die um den Umfang des Schädels von der Basisschneiden und das Oberteil des Schädels Abhebens, das Gehirn zu ermöglichen,sanft herausgehoben mit einer gebogenen Pinzette werden.
5. Legen Sie das ausgeschnittene Gehirn auf einen Abschnitt aus schwarzem Kunststoff und Pipette 50 ul 15 mg / ml Luciferin über das Organ vor der Bildgebung, um sicherzustellen, ausreichende Luciferin hat ausgeschnittenen Gehirn hinzugefügt. Bild die Einstellungen wie oben. Dies wird die Lokalisierung der Infektion zu den Gehirnhälften demonstrieren.
   Hinweis: Downstream Quantifizierung von Parasitämie am exzidiert Gehirn kann durch qPCR , durchgeführt werden , wie zuvor ⁸ beschrieben. Andere alternative Downstream-Anwendungen könnte Histologie oder Immunhistochemie umfassen Parasiten im Hirngewebe folgenden Fixierung zu identifizieren.

5. Die Quantifizierung der Biolumineszenz-Bildgebung

Hinweis: Die Biolumineszenz quantifiziert werden können, die Region von Interesse (ROI) mit der Bildverarbeitungssoftware und für die Hintergrund Biolumineszenz korrigiert.

1. den ROI-Tool verwenden, erstellen Sie einen rechteckigen ROI für ganze Tier Quantifizierung einnd positionieren sie über die Maus Bild der Nasenspitze zur Basis des Schwanzes der Maus zu decken. Verwenden Sie die gleiche Größe Box für jedes Tier und jeden Zeitpunkt. Bei der Betrachtung der ROI für das Gehirn suchen, verwenden Sie einen kreisförmigen ROI in der gleichen Art und Weise, sie über die Maus Kopfbereich in die Bildposition.
2. Falls gewünscht, einstellen Bilder auf dem gleichen Spektrum für eine visuelle Darstellung der Infektion zu erscheinen.
   Hinweis: Die Software, die hier erzeugt eine Farbkarte für jedes Bild automatisch angepasst für minimale und maximale Photonenzählungen. Um einen visuellen Vergleich zwischen einer Reihe von Bildern zu ermöglichen, die Farbskala muss für alle Bilder auf die gleichen Werte eingestellt werden.
   1. Mit dem Bild mit der höchsten Biolumineszenz und der "Bild anpassen" Registerkarte auf der Werkzeugpalette, wählen Sie eine logarithmische Skala und eine entsprechende Farbskala Minimum und Maximum (empirisch ermittelt werden). Wenden Sie diese Skala auf alle Bilder während des gesamten Experiments.

Ergebnisse

Dieses Protokoll zeigt , wie Krankheitsprogression nach einer Infektion von Mäusen mit T. folgen b. brucei, ein Modell für die afrikanische Trypanosomiasis. 1 , die die Zeitleiste des Versuchsprotokoll zeigt, den Zeitplan für die Behandlung und Imaging - Schritte zeigt, Fig . 2 eine typische Sichtfeld in einer festen Giemsa-gefärbten Blutausstrich zeigt , verwendet periphere Parasitämie quantitativ zu bestimmen, mi...

Diskussion

Die Entwicklung eines biolumineszenten T. b. brucei GVR35 Stamm ermöglicht die Visualisierung eines Trypanosomeninfektion von den frühen bis späten Stadium. Zurück Infektionsmodellen konnten die späten Stadium zu erkennen, wenn Parasiten im Gehirn, in Echtzeit aus dem Blut Film Mikroskopie sind und erforderlich , um die Keulung und Beseitigung von Gehirnen von der infizierten Mäuse Parasitenlast ¹² zu bestimmen. Die Biolumineszenz reduziert inter Maus Variabilität als eine einzige Maus kann ü...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Sigma, UK	P4417	tablets pH 7.4
Glucose	Sigma, UK	G8270	99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride	Sigma, UK	A9434	99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt)	Sigma, UK	H0878
Hi-FCS	Gibco, Life Technologies, UK	10500-064	500 ml
DPBS	Sigma, UK	D4031	Sterile filtered
Mr. Frosty	Nalgene, UK
Giemsa	Sigma, UK	G5637
D-Luciferin	Perkin Elmer, UK
	Sigma, UK	115144-35-9
Diminazene aceturate	Sigma, UK	D7770	Analytical grade
IVIS Lumina II	Perkin Elmer, UK		other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2	Perkin Elmer, UK		proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10142104
20 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10743785
25G Needles	Greiner Bio-one	N2516
21G Needles	Greiner Bio-one	N2138
Twin-frosted microscope slide	VWR, UK	631-0117
1.5 ml microcentrifuge tube	StarLab, UK	I1415-1000
7 ml Bijou tube	StarLab, UK	E1412-0710
Mouse restrainer	Sigma, UK	Z756903	our restrainer was made in-house, this is a similar model