Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Özet

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Özet

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.

Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.

Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

Giriş

Human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, is caused by the vector-borne protozoan parasites of the Trypanosoma brucei spp¹. Estimated numbers of current cases is fewer than 7 thousand every year with almost 70 million people exposed to the risk of the parasite infection within the African continent. The disease, which is most often lethal if left untreated, comprises an early hemolymphatic stage where parasites are present in the blood, progressing to the late stage when parasites invade the central nervous system (CNS) and are no longer susceptible to treatment by early stage trypanosomal drugs². The current drug therapies for late-stage HAT have both complex, prolonged, treatment regimens and severe adverse effects as well as reported resistance, therefore research into new drug therapies is imperative^3,4.

The study of late-stage human African trypanosomiasis (HAT) within traditional mouse models is lengthy and complex, with the removal of brain tissue being required to monitor parasitic burden⁵. The animal infective strain T. b. brucei is used as the study model of trypanosomiasis with the late stage appearing 21 days post infection (dpi). To monitor the wild type nonbioluminescent parasite infection in the mouse model, peripheral blood films or quantitative PCR are the only methods to determine parasite burden. For parasite burden in the brain, the mouse needs to be culled, brain excised and qPCR carried out on tissues, making it impossible to track parasites through multiple time points in the late stage infection. This results in the inability to follow real-time infections within the central nervous system (CNS).

In vivo bioluminescence imaging (BLI) can provide highly sensitive, non-invasive detection of parasite dissemination and disease progression in a mouse model that can be followed in a single animal for the entirety of the experiment⁶. BLI is based on the emission of light in the visible spectrum produced by a luciferase-catalyzed reaction. The emitted photons are then detected by a charge coupled device (CCD) camera⁷. For this purpose, the pathogen is genetically modified to express a luciferase protein and the substrate, luciferin, is introduced at time points of interest by injection. The main advantage of this method is the ability to carry out longitudinal studies, in which the same animal can be imaged several times with minimal adverse effects. The acquired bioluminescence signal can be quantified, thus indicating the pathogen burden.

The optimization and validation of a red-shifted bioluminescent T. b. brucei has enabled the investigation of the late stage infection through non-invasive procedures, detecting parasites earlier than blood film microscopy and greatly reducing the time, cost and numbers of animals needed to study CNS infection and drug screening in late-stage trypanosomiasis^8,9. In this protocol we demonstrate infection of mice with bioluminescent trypanosomes and how to then visualize the parasites in vivo for quantification of disease progression and CNS penetration.

Protokol

ahlâk
Tüm çalışmalar UK Home Office Animals onayı (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 ve Hijyen ve Tropikal Tıp Hayvan Refahı ve Etik Değerlendirme Kurulu London School of altında yürütülmüştür. kılavuz ARRIVE bu raporda takip edilmektedir.

Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei Vivo Passage 1.

1. T. bir Kriyoprezerve stok (adlandırılır stabilate) çıkarın b. brucei suşu sıvı azot ⁹ (MTA aracılığıyla Hijyen ve Tropikal Tıp London School Profesörü John Kelly temin edilebilir) GVR35-VSL-2 ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Steril fosfat tamponlu glukoz tuz (PBS-G), pH 8.0 (1 L PBS + 15 g glukoz) ^10, 2 x 10 ⁴ tripanozomlar / ml stabilate seyreltilir.
   Not: T. b. brucei GVR35-VSL-2 insanlarda bulaşıcı olmayan ve SAPO deneyleri yürütmek için imkanları lisanslı gerektirir.
2. enjvb 25 G iğne ile intraperitonal yoldan (İP) ile tripanozomlarına seyreltilmiş 0.2 ml 20-25 gram ağırlığında dişi CD1 fare. Bu "donör fare" dir. Belirli Patojen Free (SPF) -cage ve yem ad libitum içine enfekte fare yerleştirin.
   Not: CD1 fareler bir outbred zorlanma ve T. vardır b. brucei GVR35 enfeksiyonlar suşta iyi karakterize edilir. Ancak, bu protokol aynı zamanda doğal ya da genetiği değiştirilmiş suşları için geçerli olmakla birlikte, görüntüleme ^6,9 hassasiyetine etkileyebilecek o kürk rengi dikkat etmek önemlidir.
3. kan numunesi alarak periferik parasitemia izleyin. plastik süzgeç içine fare koyun ve 21 G iğne veya venesection ile venepunkturdan tarafından kuyruk kan 5 ul almak ve kırmızı kan hücreleri parçalanması ve daha kolay sayım sağlamak için% 0.85 steril amonyum klorür ile 1/10 karıştırın.
4. Neubauer hemositometrede Seyreltilmiş Kan sayın.
   1. Her iki odalarına seyreltilmiş kan yükleyin. tüm merkez gr saymakbir odanın id n tripanozomlann vermek. Kan = n x 10 ⁴ tripanozomlar / ml tripanozomlann konsantrasyonu, herhangi bir seyreltme faktörü ayarlamak ve iki odadan ortalamasını hesaplar.
      Not: Yaklaşık 5-7 gün sonra enfeksiyon, periferal parazitemi 2 x 10 ⁴ tripanozomlar / ml'lik bir konsantrasyonda bir enfeksiyon gerçekleştirmek için yeterli artacaktır.
5. tripanosom seviyeleri 1.6 adıma geçmek, gerekli farelerin sayısı için yeterince yüksek olduğunda. Bir verici bir fare 6 x 10 ⁴ tripanozomlar / ml'lik bir parazit seviyesi 10 farelerin enfeksiyonu için yeterlidir.
   Not: istatistiksel olarak anlamlı bir grup boyutları için, n = 6 fare, her tedavi grubu için ⁸ ihtiyaç vardır. diğer enfeksiyon modeller için, güç hesapları uygun grup boyutlarını belirlemek için uygulanacak gerekir.
6. (Yaklaşık 5-10 dakika 28-30 ° C'de) bir ısı kutusu içine yerleştirin fareler kuyruk damarları genişletmek için izin vermek.Terminal anestezi neden 20 mg / 25 G iğne ile kg pentobarbital iv yönetmek için. Onayla fare hafifçe hiçbir geri çekilme refleksi olmadığından emin olmak için, pedallar Sürüş Esnasında basılarak uyuşturulduktan.
7. Bir Bijou tüpüne 5.000 USP birim / ml'de 5 mi heparin aliquoting ve bir 1 ml şırınga ucunda iğne üzerinden iki emerek, bir 21 G iğne Heparinize.
8. heparinize 21 G iğne ile 1 ml şırınga alın ve göğüs kafesi altında merkezi iğne sokarak anestezi geçiş fare üzerinde kalp ponksiyon gerçekleştirin (kan boncuk iğne tabanında havuz olacak) ve yavaşça pistonu geri çekin böylece kalbin odasına daraltmak için değil. kan 0.7 ml az toplayın.
9. Yukarıdaki adım 1.1 olarak PBS-G pH 8.0 içinde 2 x 10 ⁴ tripanozomlar / ml'lik bir aşının üretilmesi için enfekte olmuş kan seyreltilir.
   Not: Bu noktada, geri kalan kan% 8 gliserol,% 20 ısıyla inaktive edilmiş cenin ca karıştırılarak stabilate üretilmesi için dondurularak saklanabilirEğer serumu (hi-FCS) ve% 72 enfekte kan. Yavaş yavaş sıvı azot aktarmadan önce, C / dk ° -1 soğutma hızını elde etmek için bir kap dondurma yavaş dondurma kullanılarak -80 ° C 'de dondurma.

Deneysel Fare 2. Enfeksiyon

1. nazikçe ılık damarları genişletmek için bir ısıtma kutusu içine CD1 dişi fareler (~ 21-25 gr) yerleştirin. plastik kısıtlama içine ısıtılmış fareler yerleştirin ve fare başına 4.000 tripanozomlann eşdeğer kuyruk damar içine 25 G iğne ile damar 0.2 ml seyreltilmiş inokulum enjekte. Kanamayı durdurmak için daha sonra enjeksiyon yerinde basıncı yerleştirin.
   Karın içi enfeksiyon enfeksiyonun geçerli bir yol olduğunu ve daha önceki çalışmalarda ¹⁰ kullanılmıştır, ancak intravenöz yolla bu daha az tekrarlanabilir bulduk: edin.
2. SPF-havalandırmalı kafeslerde 3'lü gruplar halinde enfekte fare ve kafesi Rastgele. Bir kontrol olarak, yabani tip olmayan biyolojik olarak ışık veren parazit, T ile CD1 dişi farelerin enjekte b. brucei GVR35 (n =3).
3. Kan Film Mikroskopi sayesinde Enfeksiyon Monitör
   1. Noktası 5 ul bir cam lam üzerine venepunkturdan ya venesection kan ve (hafifçe ince bir film oluşturmak için bir slayt üzerinde kan damlayı ikinci cam slayt kullanılarak) kan yayma gerçekleştirin. kuru hava slaytlar bırakın.
   2. DH ₂ O ile yıkamadan önce 10 dakika süreyle Giemsa ile% 100 metanol ve leke kan yayma düzeltmek ve kurumaya bırakın. 100X objektif altında görünümü (fov) 10 alanda tripanozomlann sayısını.
      Not: Kan çekim gibi erken bir gün sonrası enfeksiyon gibi bütün hayvan invaziv olmayan görüntüleme yanında yapılır. Hayvanlar, bir dizi işleme tabi tutarken numuneler, oda sıcaklığında saklanabilir ve daha sonra sayılabilir gibi, tripanosom kantitatif bu yöntem hemositometre sayımı tercih edilir.

3. Biyoparlaklık Görüntüleme Enfeksiyon iz

Not: enfeksiyon izlemek için, bütün animEl non-invaziv görüntüleme kullanılabilir.

1. 30 mg / ml'de Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) D-lusiferin, ateşböceği lusiferaz alt-tabaka, bir stok çözelti hazırlayın. Filtre sterilize ve -20 ° C'de parçalar halinde dondurma.
   Not: D-luciferase duyarlı ışık, bu nedenle folyo alikotları sararak ışıktan korumak. Bu aktiviteyi ¹¹ etkileyebilir olarak art arda luciferase-çözülme donma yok.
2. Oda sıcaklığına kadar D-luciferase bir kısım ısıtın. (Nonbioluminescent vahşi tip parazit türü ile enfekte edilmiş kontrol farelerinde de dahil olmak üzere), kafesin her fare çıkarın ve intraperitonal 25 G iğne ile 150 mg / (DPBS içinde seyreltilmiş) ısıtıldı, D-luciferase kg enjekte edilir. / Dakika 2.5 L% 2 izofloran / O ₂ karışımı ile anestezi sağlamak için yaklaşık 5 dakika boyunca, bir izofloran odasına fareler yerleştirin.
   Not: Onlar anestezi altında olduğunda Fareler hareketsiz hale gelir. Burada kullanılan kamera için, 3 fare, bir anda işlenebilir. farenin anesthet isedaha uzun bir süre 30 dakika yanıstarak, oftalmik merhem, yapay gözyaşı kurumasını farelerinin gözleri önlemek için uygulanabilir.
3. Burada anlatılan görüntüleyici için Yazılımı açmak ve üreticinin talimatlarına göre yazılımı kullanarak makineyi başlat. Kamera ve ısıtmalı plaka sıcaklığı ulaştığında görüntü kazanır.
   Not: Bu cihaz, genellikle bir gecede arka plan kalibrasyonları yapmak için makinenin sağlayan kapalı değil. yeniden başlatmak gerekiyor durumunda, öncelikle bir kalibrasyon kontrolü çalıştırmanız gerekir.
4. (3.5 bakınız) kamera içine anestezi fareler yerleştirin. herhangi bir parlak bioluminescent sinyal yoluyla kanama en aza indirmek için fareler arasında büyük siyah ayırıcılar kullanın. pozlama süreleri bir dizi kullanarak görüntü fareler; Görünüm E orta binning, 1 f / durdurma ve açık filtre ve alanla 1, 3, 10, 30, 60 ve 180 saniye, (12.5 x 12.5 cm ^2).
   Not: vahşi tip nonbioluminescent GVR35 parazit ile enfekte kontrol fareleri bir backgr sağlamakound biyoparlaklık değer. Bu model ile, bir lusiferin kinetik deney (Şekil 6), biz 10 dakika biyoışıldama sinyal tepe Uygulamayı takip ve görüntüleme yaklaşık 3 fareler için 5 dakika sürer bulmuşlardır. anestezi ve fareler görüntüleme dikkate bu zaman ölçeği alın.
5. Farelerin tam görüntüleme sağlamak için, ventral, dorsal ve lateral görünüm elde etmek için döndürün. ardışık hayvanlar arasındaki görüntüleme için oryantasyon sırayla tutarlılığı korumak.
6. görüntüleme sonra fareler SPF-kafes dönmeden önce gözlem altında anestezi kurtarmak için izin verir.
7. gün 21 sonrası enfeksiyon kadar her 7 gün fareler görüntüleme devam edin. tüm hayvan üzerinde biyoparlaklık sinyali istikrarlı bir artış olmalıdır.
8. D21, görüntü ve kan filmi / kg diminazene aceturate intraperitonal 40 mg fareler, yukarıda tarif edilen ve bir doz olarak fareler. Bu ilaç periferik parasitemia silecektir ancak kan Brai geçmeyeceğimn bariyer ve bu nedenle MSS enfeksiyonu daha iyi görselleştirme sağlar.
   Not: Diminazene aceturate erken evre, hayvan trypanosomiasis tedavisi için kullanılan iyi bilinen bir ilaçtır.
9. D28 ve D35 de görüntüleme ve izleme devam edin.

4. MSS Enfeksiyon Onaylama

1. D35 'de, yukarıda açıklandığı gibi resim fareleri (3.1-3.4 adım).
2. görüntüleme sonra, daha fazla analiz için kan toplama aşamasında 1.6-1.8 detaylı olarak farenin anestezi ve asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​farelerden kurtarmak için izin verir.
3. kardiyak delme ardından, 20 ml PBS ile fareler serpmek (isteğe bağlı: 3 mg / perfüzyon çözüm luciferase ml ekleyin) organlara kan temizlemek ve zaman aralığındaki beyin bölgesi temizlenir olabilir luciferin etiketi reintroduce kalp yoluyla adım 4.1.
4. Yavaşça beyin izin, kavisli makas kullanılarak kafatası çevresi etrafında tabanından kesme ve kafatasının üst kısmı kapalı kaldırarak beyin kaldırmakhafifçe kavisli bir forseps ile kaldırılması gerekir.
5. Yeterli luciferase Kesilerek çıkarılan beynin eklendi sağlamak için, siyah plastik pipet önce görüntüleme organ üzerindeki 15 mg / ml lusiferin 50 ul bir bölümü üzerine Kesilerek çıkarılan beynin yerleştirin. Yukarıdaki ayarları kullanarak görüntü. Bu beyin hemisfer enfeksiyon lokalizasyonu gösterecektir.
   Not: Daha önce ⁸ açıklandığı gibi kesilmiştir beyin üzerinde parazitemi Mansap miktar qPCR yapılabilir. Diğer alternatif aşağı uygulamalar tespit sonucu beyin dokusunda parazitleri tespit etmek histoloji veya immünohistokimyasal içerebilir.

Biyoparlaklık Görüntüleme 5. kantitasyonu

Not: Biyoparlaklık görüntüleme yazılımı ile ilgi alanları (ROI) bölgesini kullanarak sayısal ve arka plan biyoparlaklık için düzeltilebilir.

1. ROI aracını kullanarak, bütün hayvan kantitatif a için bir dikdörtgen ROI oluşturmaknd fare kuyruk tabanına burnunun ucunu kapatmak için fare resmin üzerine getirin. Her hayvan ve her zaman noktası için aynı boyutta kutusunu kullanın. beyin için ROI bakarken, görüntüdeki fare kafası bölge üzerinde konumlandırma, aynı şekilde dairesel ROI kullanın.
2. İstenirse, enfeksiyon görsel gösterimi için aynı spektrum görüntülenmesini ayarlayın.
   Not: Burada kullanılan yazılım otomatik olarak minimum ve maksimum foton sayıları için ayarlanmış her bir görüntü için bir renk haritası oluşturur. görüntülerin bir dizi arasındaki görsel karşılaştırma etkinleştirmek için, renk skalası, tüm görüntüler için aynı değerlere ayarlanmalıdır.
   1. En yüksek biyolüminesans ve araç paleti üzerinde 'Görüntü ayarlamak' sekmesi ile görüntüyü kullanarak, logaritmik ölçek ve uygun bir renk skalası minimum ve maksimum (ampirik olarak tespit edilmesi) seçin. deney boyunca tüm görüntüleri bu ölçek uygulayın.

Sonuçlar

Bu protokol T. ile farelerin enfeksiyonu takiben hastalığın ilerlemesini takip etmek nasıl gösterir b. brucei, insan Afrika trypanosomiasis için bir model. Şekil 1 tedavi ve görüntüleme aşamaları için takvimi gösteren deneysel protokol çizelgesini gösterir. 2 periferik parasitemia ölçmek için kullanılan sabit bir Giemsa lekeli kan yayması bakış tipik bir alanı gösterir Şekil, tripanozomlar ve k...

Tartışmalar

Bir biyolojik olarak ışık veren T gelişimi b. brucei GVR35 suşu geç dönemde erken bir tripanozom enfeksiyon görselleştirme sağlar. Önceki enfeksiyon modelleri parazitler beyin olduğunda kan filmi mikroskopi gerçek zamanlı olarak, geç evre tespit koyamadık ve parazit yükünün ¹² belirlemek için enfekte farelerin beyinleri seçilmesini ve çıkarılması gerekti. tek bir fare enfeksiyon bütünlükleri içinde ve herhangi bir aşamada gözlemlenebilir enfeksiyonun hızlı bi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Sigma, UK	P4417	tablets pH 7.4
Glucose	Sigma, UK	G8270	99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride	Sigma, UK	A9434	99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt)	Sigma, UK	H0878
Hi-FCS	Gibco, Life Technologies, UK	10500-064	500 ml
DPBS	Sigma, UK	D4031	Sterile filtered
Mr. Frosty	Nalgene, UK
Giemsa	Sigma, UK	G5637
D-Luciferin	Perkin Elmer, UK
	Sigma, UK	115144-35-9
Diminazene aceturate	Sigma, UK	D7770	Analytical grade
IVIS Lumina II	Perkin Elmer, UK		other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2	Perkin Elmer, UK		proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10142104
20 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10743785
25G Needles	Greiner Bio-one	N2516
21G Needles	Greiner Bio-one	N2138
Twin-frosted microscope slide	VWR, UK	631-0117
1.5 ml microcentrifuge tube	StarLab, UK	I1415-1000
7 ml Bijou tube	StarLab, UK	E1412-0710
Mouse restrainer	Sigma, UK	Z756903	our restrainer was made in-house, this is a similar model