Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

Resumo

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Resumo

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.

Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.

Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

Introdução

Human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, is caused by the vector-borne protozoan parasites of the Trypanosoma brucei spp¹. Estimated numbers of current cases is fewer than 7 thousand every year with almost 70 million people exposed to the risk of the parasite infection within the African continent. The disease, which is most often lethal if left untreated, comprises an early hemolymphatic stage where parasites are present in the blood, progressing to the late stage when parasites invade the central nervous system (CNS) and are no longer susceptible to treatment by early stage trypanosomal drugs². The current drug therapies for late-stage HAT have both complex, prolonged, treatment regimens and severe adverse effects as well as reported resistance, therefore research into new drug therapies is imperative^3,4.

The study of late-stage human African trypanosomiasis (HAT) within traditional mouse models is lengthy and complex, with the removal of brain tissue being required to monitor parasitic burden⁵. The animal infective strain T. b. brucei is used as the study model of trypanosomiasis with the late stage appearing 21 days post infection (dpi). To monitor the wild type nonbioluminescent parasite infection in the mouse model, peripheral blood films or quantitative PCR are the only methods to determine parasite burden. For parasite burden in the brain, the mouse needs to be culled, brain excised and qPCR carried out on tissues, making it impossible to track parasites through multiple time points in the late stage infection. This results in the inability to follow real-time infections within the central nervous system (CNS).

In vivo bioluminescence imaging (BLI) can provide highly sensitive, non-invasive detection of parasite dissemination and disease progression in a mouse model that can be followed in a single animal for the entirety of the experiment⁶. BLI is based on the emission of light in the visible spectrum produced by a luciferase-catalyzed reaction. The emitted photons are then detected by a charge coupled device (CCD) camera⁷. For this purpose, the pathogen is genetically modified to express a luciferase protein and the substrate, luciferin, is introduced at time points of interest by injection. The main advantage of this method is the ability to carry out longitudinal studies, in which the same animal can be imaged several times with minimal adverse effects. The acquired bioluminescence signal can be quantified, thus indicating the pathogen burden.

The optimization and validation of a red-shifted bioluminescent T. b. brucei has enabled the investigation of the late stage infection through non-invasive procedures, detecting parasites earlier than blood film microscopy and greatly reducing the time, cost and numbers of animals needed to study CNS infection and drug screening in late-stage trypanosomiasis^8,9. In this protocol we demonstrate infection of mice with bioluminescent trypanosomes and how to then visualize the parasites in vivo for quantification of disease progression and CNS penetration.

Protocolo

Ética
Todo o trabalho foi realizado sob a aprovação do Reino Unido Escritório Animais (Scientific Procedures) Act 1986 e da London School of Hygiene & Tropical Medicine Animal Welfare and Ethics Review Board. CHEGADA orientação são seguidos neste relatório.

1. In Vivo Passagem de Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei

1. Remover um estoque criopreservado (stabilate denominado) de T. b. brucei estirpe GVR35-VSL-2 (disponível a partir de Professor John Kelly na London School of Hygiene & Tropical Medicine através MTA) ⁹ de azoto líquido e deixar equilibrar à temperatura ambiente. Diluir stabilate a 2 x 10 ⁴ tripanossomas / ml em solução salina tamponada com fosfato de glicose (PBS-G) estéril de pH 8,0 (1 L PBS + glucose 15 g) ^10.
   Nota: T. b. brucei GVR35-VSL-2 é não infecciosa para os seres humanos e requer SAPO licenciado instalações para a realização de experimentos.
2. inject de 20-25 g feminina rato CD1 com 0,2 ml diluído tripanossomas por via intraperitoneal (ip) com uma agulha 25 G. Este é o "rato doador". Coloque o rato infectado em um Specific Pathogen Free (SPF) -cage e alimentação ad libitum.
   Nota: ratinhos CD1 são uma estirpe não consanguíneos e T. b. infecções brucei GVR35 estão bem caracterizados nesta estirpe. No entanto, este protocolo é igualmente aplicável às estirpes puras ou geneticamente modificados, mas é importante notar que a cor da pele pode ter impacto sobre a sensibilidade da imagem ^6,9.
3. Monitorar parasitemia periférica por amostragem de sangue. Colocar o rato dentro de um limitador de plástico e levar de 5 ul de sangue a partir da cauda por punção venosa com 21 L de agulha ou flebotomia e misturar 1/10 com cloreto de amónio estéril de 0,85%, para lisar as células vermelhas do sangue e permitir a contagem mais fácil.
4. Contar o sangue diluído em um Neubauer hemocitômetro.
   1. Carregar o sangue diluído em ambas as câmaras. Contagem de toda a central de grID de uma câmara para dar N tripanossomas. Concentração de tripanossomas sanguíneos em = N x 10 ⁴ / ml tripanossomas, ajustar para qualquer factor de diluição e calcular a média das duas câmaras.
      Nota: Após cerca de 5-7 dias após a infecção, parasitemia periférica deve subir suficientemente para levar a cabo uma infecção com uma concentração de 2 x 10 ⁴ tripanossomas / ml.
5. Quando os níveis de tripanossomas são altos o suficiente para o número de ratos necessários, vá para a etapa 1.6. Um nível de parasitémia de 6 x 10 ⁴ tripanossomas / ml em um rato dador é suficiente para a infecção de 10 ratinhos.
   Nota: Para tamanhos estatisticamente significativas de grupo, n = 6 para cada grupo de tratamento de ratinhos são necessários ^8. Para outros modelos de infecção, cálculos de alimentação teria de ser aplicado para determinar tamanhos de grupo apropriados.
6. Coloque ratos em uma caixa de calor (a 28-30 ° C durante cerca de 5-10 minutos) para permitir que as veias da cauda para dilatar.Para induzir a anestesia terminal, administrar 20 mg / kg iv pentobarbital com uma agulha 25 G. Confirmar rato é anestesiado, pressionando suavemente as patas para garantir que não haja reflexo de retirada.
7. Heparinizar uma agulha G 21, por alíquotas de 5 ml de heparina em 5.000 USP unidades / ml para um tubo de bijou e chupando duas vezes dentro e para fora da agulha ligada a uma seringa de 1 ml.
8. Leve o heparinizado 21 G agulha e seringa de 1 ml, e realizar punção cardíaca no rato passagem anestesiado pela inserção da agulha centralmente por baixo da caixa torácica (uma gota de sangue vai reunir na base da agulha) e puxe o êmbolo de modo a não entrar em colapso da câmara do coração. Recolha um mínimo de 0,7 ml de sangue.
9. Dilui-se o sangue infectado para produzir um inoculo de 2 x 10 ⁴ tripanossomas / ml em PBS-G a pH 8,0 como passo 1.1 acima.
   Nota: Neste ponto, o sangue restante pode ser criopreservadas para produzir stabilate por mistura com 8% de glicerol, 20% de Ca fetal inactivado pelo calorsoro lf (oi-FCS) e sangue infectado de 72%. Lentamente congelar a -80 ° C por meio de um processo lento de congelação-congelação recipiente para atingir uma taxa de arrefecimento de 1 ° C / min, antes de transferir para azoto líquido.

2. infecção de camundongos Experimental

1. Coloque CD1 camundongos fêmeas (~ 21-25 g) em uma caixa de aquecimento para gentilmente quente para dilatar veias. Colocar os ratinhos aquecidos em um sistema de retenção de plástico e injecção de 0,2 ml de inoculo diluiu-se por via intravenosa com uma agulha G 25 na veia da cauda, ​​o equivalente a 4.000 tripanossomas por ratinho. Coloque a pressão no local da injecção depois de deter a hemorragia.
   Nota: infecção intraperitoneal é um percurso válido de infecção e tem sido utilizado em estudos anteriores ^10, mas verificou-se esta menos reprodutível do que a via intravenosa.
2. Randomize camundongos infectados e gaiola em grupos de 3 em gaiolas SPF-ventilados. Como controle, injetar camundongos fêmeas CD1 com tipo selvagem parasita não bioluminescente, T. b. brucei GVR35 (n =3).
3. Monitorar a infecção através do sangue Film Microscopia
   1. Spot 5 ul de sangue de punção venosa ou venesection sobre uma lâmina de vidro e efectuar um esfregaço de sangue (utilizando uma segunda lâmina de vidro empurrar suavemente a gota de sangue através da corrediça para produzir uma película fina). Deixar as lâminas secar ao ar.
   2. Fixar o esfregaço de sangue com 100% de metanol e mancha com Giemsa durante 10 min antes de enxaguar com _dH2O e deixar secar ao ar. No âmbito do objectivo 100X contar o número de tripanossomas em 10 campos de visão (FOV).
      Nota: as filmagens de sangue é realizada juntamente com toda animais imagem não invasivos mais cedo um dia após a infecção. Quando o processamento de um número de animais, este método de quantificação tripanossoma é preferível a contagem em hemocitómetro que as amostras podem ser armazenadas à temperatura ambiente e contadas mais tarde.

3. A bioluminescência Imaging para Rastrear Infection

Nota: Para controlar a infecção, anim todaal imagem não invasiva pode ser usado.

1. Prepara-se uma solução stock de D-luciferina, o substrato da luciferase do pirilampo, em Dulbecco Salina Tamponada com Fosfato (DPBS) a 30 mg / ml. Filtro de esterilizar e congelar em alíquotas a -20 ° C.
   Nota: D-luciferina é sensível à luz, portanto, proteger da luz por envolvimento em folha de alíquotas. Não repetidamente congelamento-descongelamento luciferina, pois ele pode afetar a atividade ^11.
2. Aquecer-se uma alíquota de D-luciferina à temperatura ambiente. Remover cada ratinho a partir da gaiola (incluindo ratinhos de controlo infectadas com o tipo selvagem estirpe nonbioluminescent parasita) e injectar 150 mg / kg de D-luciferina aquecido (diluídas em DPBS) por via intraperitoneal com uma agulha 25 G. Colocar os ratos dentro de uma câmara de isofluorano durante aproximadamente 5 min para induzir a anestesia com 2% de isoflurano / _O2 mistura em 2,5 L / min.
   Nota: Os ratos tornam-se imóvel quando eles estão sob anestesia. Para o gerador de imagens usado aqui, 3 ratinhos pode ser processado de cada vez. Se os ratos são anesthetzado por mais de 30 min, pomada oftálmica lágrima artificial pode ser aplicada para evitar os olhos dos ratos de secar.
3. Para o gerador de imagens descrito aqui, abra o software e inicializar a máquina usando o software de acordo com as instruções do fabricante. Adquirir imagens depois da câmera e placa aquecida ter atingido a temperatura.
   Nota: Este instrumento não é normalmente desligado, permitindo que a máquina para realizar calibrações de fundo durante a noite. No caso em que ele precisa para reiniciar, ele deve executar uma verificação de calibração em primeiro lugar.
4. Coloque os ratos anestesiados para o gerador de imagens (ver 3.5). Use grandes separadores negros entre os ratos para minimizar a sangrar através de qualquer sinal bioluminescente brilhante. camundongos de imagem usando um conjunto de tempos de exposição; 1, 3, 10, 30, 60 e 180 segundos, com binning médio, 1 f / stop e um filtro aberto, eo campo de visão E (12,5 x 12,5 ^cm2).
   Nota: Os ratinhos de controlo infectadas com o tipo selvagem parasitas GVR35 nonbioluminescent fornecer um backgrvalor bioluminescência ound. A partir de uma experiência cinética de luciferina (Figura 6) com este modelo, verificou-se que os picos do sinal de bioluminescência em 10 minutos após a administração e de imagem demora aproximadamente 5 minutos para 3 ratinhos. Tome este prazo em consideração quando anestesiar e de imagem dos camundongos.
5. Para garantir a imagem completa dos ratos, gire para obter um ventral, dorsal e lateral. Manter a consistência da ordem de orientação para a imagem latente entre animais sequenciais.
6. Depois de imagem, permitem que os ratos se recuperar da anestesia sob observação antes de retornar a SPF-gaiola.
7. Continue imagiologia ratos a cada 7 dias até o dia 21 pós-infecção. Deveria haver um aumento constante no sinal de bioluminescência ao longo de todo o animal.
8. No D21, imagem e filme de sangue dos ratos, como descrito acima, e dose de ratos com 40 mg / kg diminazeno aceturate intraperitoneal. Esta droga irá limpar a parasitemia periférica, mas não vai atravessar a barreira sangue-braibarreira n, e, portanto, permite uma melhor visualização da infecção do SNC.
   Nota: Diminazena aceturate é uma droga bem estabelecida usados ​​para tratar em estágio inicial tripanossomíase animal.
9. Continue imagem e monitoramento em D28 e D35.

4. Confirmando CNS Infection

1. No D35, os ratinhos da imagem, como especificado acima (passos 3,1-3,4).
2. Após a imagiologia, permitir que os ratinhos recuperar da anestesia e ratinhos desangrar como detalhado no passo 1,6-1,8, recolha de sangue para posterior análise.
3. Após a punção cardíaca, perfundir ratos com 20 ml de PBS (opcional: adicionar 3 mg / ml de luciferina a solução de perfusão) através do coração para limpar o sangue dos órgãos e para reintroduzir etiqueta luciferina que pode ter afastada da região do cérebro ao longo do intervalo de tempo a partir do passo 4.1.
4. Suavemente remover o cérebro, usando tesoura curva, cortando a partir da base à volta da circunferência do crânio, e levantando a parte superior do crânio, para permitir que o cérebropara ser suavemente retirado com pinças curvas.
5. Colocar o cérebro excisada para uma secção de plástico preto e pipeta 50 ul de 15 mg / ml de luciferina sobre o órgão antes da imagem, para garantir luciferina adequada foi adicionado à cerebral excisado. Imagem usando as configurações acima. Isto irá demonstrar a localização da infecção para os hemisférios cerebrais.
   Nota: A jusante quantificação da parasitemia no cérebro excisado pode ser levada a cabo por qPCR como anteriormente descrito ^8. Outras aplicações a jusante alternativos podem incluir histologia ou imuno-histoquímica para identificar parasitas no tecido cerebral após a fixação.

5. A quantificação de bioluminescência de imagem

Nota: A bioluminescência pode ser quantificada utilizando-se a região de interesse (ROI) com o software de imagem e corrigido para o fundo bioluminescência.

1. Usando a ferramenta de ROI, criar um ROI rectangular para toda animais quantificação umand posicioná-lo sobre a imagem do mouse para cobrir ponta do nariz à base da cauda do rato. Usar a mesma caixa de tamanho para cada animal e cada ponto de tempo. Ao olhar para o ROI para o cérebro, use um ROI circular da mesma forma, posicionando-o sobre a região da cabeça do rato na imagem.
2. Se desejar, ajuste as imagens apareçam no mesmo espectro para uma representação visual da infecção.
   Nota: O software utilizado aqui gera um mapa de cores para cada imagem ajustada automaticamente para a contagem mínima e máxima de fótons. Para permitir a comparação visual entre uma série de imagens, a escala de cores deve ser ajustado para os mesmos valores para todas as imagens.
   1. Usando a imagem com a maior bioluminescência e na guia 'Ajuste de imagem "na paleta de ferramentas, selecione uma escala logarítmica e um mínimo de escala de cores adequado e máximo (a ser determinado empiricamente). Aplicar esta escala a todas as imagens durante todo o experimento.

Resultados

Este protocolo demonstra como seguir a progressão da doença após a infecção de camundongos com T. b. brucei, um modelo para a tripanossomíase humana Africano. A Figura 1 mostra a linha do tempo do protocolo experimental, demonstrando o calendário de tratamento e de imagem etapas. A Figura 2 mostra um típico campo de visão em um esfregaço de sangue Giemsa-manchadas fixa usada para quantificar parasitemia periférica, com tripanossomas e...

Discussão

O desenvolvimento de um T. bioluminescente b. brucei GVR35 estirpe permite a visualização de uma infecção por tripanossoma do início ao final de estágio. Modelos de infecção anteriores não foram capazes de detectar a fase tardia, quando os parasitas estão no cérebro, em tempo real, a partir de microscopia de esfregaço de sangue, e exigia o abate e remoção dos cérebros dos ratos infectados para determinar a carga parasitária ^12. A bioluminescência reduz a variabilidade inter-...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Sigma, UK	P4417	tablets pH 7.4
Glucose	Sigma, UK	G8270	99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride	Sigma, UK	A9434	99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt)	Sigma, UK	H0878
Hi-FCS	Gibco, Life Technologies, UK	10500-064	500 ml
DPBS	Sigma, UK	D4031	Sterile filtered
Mr. Frosty	Nalgene, UK
Giemsa	Sigma, UK	G5637
D-Luciferin	Perkin Elmer, UK
	Sigma, UK	115144-35-9
Diminazene aceturate	Sigma, UK	D7770	Analytical grade
IVIS Lumina II	Perkin Elmer, UK		other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2	Perkin Elmer, UK		proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10142104
20 ml syringe	Fisher Scientific, UK	10743785
25G Needles	Greiner Bio-one	N2516
21G Needles	Greiner Bio-one	N2138
Twin-frosted microscope slide	VWR, UK	631-0117
1.5 ml microcentrifuge tube	StarLab, UK	I1415-1000
7 ml Bijou tube	StarLab, UK	E1412-0710
Mouse restrainer	Sigma, UK	Z756903	our restrainer was made in-house, this is a similar model