فلوري مثلي نموذج الفأر من سرطان البنكرياس

Summary

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Abstract

يبقى سرطان البنكرياس أحد أكثر أنواع السرطان التي البقاء على قيد الحياة لم تتحسن بشكل كبير في العقود القليلة الماضية. 7٪ فقط من المرضى الذين شخصت سوف يعيش لفترة أطول من خمس سنوات. من أجل فهم وتقليد المكروية من أورام البنكرياس، ونحن استخدام نموذج مثلي الفئران من سرطان البنكرياس الذي يسمح التصوير غير الغازية لتطور الورم في الوقت الحقيقي. علقت الخلايا السرطانية في البنكرياس التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (PANC-1 GFP) في الطابق السفلي مصفوفة الغشاء، وارتفاع تركيز، (على سبيل المثال، Matrigel HC) مع وسائل الإعلام الحرة المصل ثم حقنها في ذيل البنكرياس عن طريق فتح البطن. تعليق الخلية في المصفوفة تركيز عال الطابق السفلي الغشاء يصبح مادة تشبه الجل مرة واحدة تصل درجة حرارة الغرفة. وبالتالي، فإنه المواد الهلامية عندما يتعلق الأمر في اتصال مع البنكرياس، وخلق ختم في موقع الحقن، ومنع أي تسرب الخلية. ويتم رصد نمو الورم والانبثاث إلى أعضاء أخرى في العيشالحيوانات باستخدام مضان. ومن الأهمية بمكان استخدام مرشحات مناسبة لإثارة وانبعاث GFP. وفيما يلي تفصيل الخطوات لزرع مثلي في هذه المقالة بحيث يمكن للباحثين تكرار بسهولة الإجراء في الفئران عارية. الخطوات الرئيسية لهذا البروتوكول هي إعداد تعليق الخلية، زرع الجراحية، وكله الفلورسنت الجسم في التصوير الجسم الحي. تم تصميم هذا النموذج مثلي للتحقيق في فعالية علاجات جديدة على الأورام الابتدائية والمتنقل.

Introduction

يتم تشخيص سرطان البنكرياس مع زيادة تواتر مقارنة مع أنواع أخرى من السرطان وهو السبب الرئيسي ^ال 4 من الوفيات الناجمة عن السرطان في الولايات المتحدة. من وقت التشخيص، أكثر من 90٪ من المرضى يموتون في غضون خمس سنوات ^1،2. حاليا، إزالة ورم الجراحية هي العلاج الوحيد لسرطان البنكرياس، ولكن أقل من 20٪ من المرضى الذين هم وحدهم المؤهلون لإجراء عملية جراحية أساسا لأن في ذلك الوقت من تشخيص المرض في مرحلة متقدمة وانتشر ^3،4. عدم وجود أعراض محددة يجعل سرطان البنكرياس مرض صامت. بعض الأعراض تشمل ألم في البطن، وآلام الظهر، وفقدان الشهية، واليرقان والغثيان. وهو ما يمكن تفسيره بسهولة للأمراض الهضمية شيوعا ^4. لهذا السبب، من المهم لتطوير أدوات الدوائية جديدة للمساعدة في تشخيص وعلاج سرطان البنكرياس.

استخدام النماذج الحيوانية يتيح لنا أن نفهم بيولوجيا pancreسرطان آتيك ويوفر نظرة ثاقبة في تطبيق هذه المعرفة على البشر. نماذج مثلي طعم أجنبي من سرطان البنكرياس واقعية، لأن الأورام تنمو في الجهاز من أصل ^5. وعلى النقيض من نماذج غيري الموضع، حيث تزرع خطوط الخلايا أو شظايا ورم تحت الجلد، والنمذجة مثلي يسمح للاستجمام المكروية الورم ويحاكي التفاعل بين الخلايا السرطانية مع محيطه ^6. نموذج طعم أجنبي هو موضح هنا يستمد أورام من البنكرياس خط الخلايا السرطانية البشرية PANC-1 GFP، الذي وراثيا للتعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP). تمكين الكشف عن GFP لتصوير غير الغازية ورصد نمو الورم والانبثاث ^7. يحدث نمو الورم بسرعة، بشكل عفوي، ويشبه ذلك من الأورام الأولية لمرضى سرطان البنكرياس البشري ^8. توفر نماذج مثلي تنبؤ أكثر دقة من فعالية الدواء في استجابة لعوامل علاجية، في حينمحاكاة المكروية الورم.

وكما ذكر أعلاه، وهذا نموذج حيواني يتيح الكشف الفلوري من نمو الورم والانبثاث في الوقت الحقيقي. الكشف الفلوري يسمح لتصوير أكثر مباشرة / الحية بالمقارنة مع التألق. مع مضان الضوء المنبعث هو نتيجة الإثارة التي كتبها ضوء آخر من طول موجي أقصر، في حين أنه في التلألؤ، والضوء المنبعث هو نتيجة لتفاعل كيميائي وقد لا يكون انبعاث قوي ^9. وعلاوة على ذلك، الجسم كله في التصوير المجراة الفلورسنت هو لا يضر الحيوان ويسمح للباحثين لمراقبة نمو الورم أكثر من مرة ردا على العلاجات العلاجية.

Protocol

يتم تنفيذ البروتوكول هو موضح أدناه تحت إشراف وموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة الغربية. يتم تنفيذ جميع التجارب في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية ذات الصلة، وتنظيم والهيئات التنظيمية.

1. خلية ثقافة

1. إعداد المتوسطة كاملة
   1. استخدام خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية، وإعداد المتوسطة كاملة عن طريق إضافة جو معقم و مطهر مصل الجنين البقري (FBS) والستربتومايسين البنسلين (P / S) لزجاجة 500 مل من RPMI المتوسطة. المزيج بلطف يحوم. التركيز النهائي من كل ملحق 10٪ FBS و 1٪ P / S (ت / ت). على سبيل المثال، تكملة 500 مل من وسائل الاعلام مع 56 مل FBS و 6 مل P / S.
   2. ضع المتوسطة كاملة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
2. ذوبان الجليد وخلايا المكاثره
   1. استرداد خلايا PANC-1 GFP من النيتروجين السائل. ذوبان الجليد قارورة من الإثارة لطيف في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة:وينبغي أن يكون الذوبان السريع (حوالي 2-3 دقائق).
   2. التسمية T-75 قوارير ليتم استخدامها مع (أ) اسم خط الخلية، تاريخ (ب) عدد مرور، (ج)، وبالاحرف الاولى (د) الباحث.
   3. مسح القارورة مع الايثانول 70٪ ونقل قنينة إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
   4. لنشر الخلايا، إضافة 9.0 مل من المتوسط ​​الشامل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. باستخدام ماصة 1.0 مل، ونقل بعناية تعليق الخلية وتعليقه في 9 مل من المتوسط ​​الشامل.
   5. أجهزة الطرد المركزي في 125 x ج لمدة 8 دقائق على RT. نقل قارورة المخروطية إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، ونضح طاف دون الإخلال بيليه.
   6. تعليق بيليه في 10 مل من المتوسط ​​كاملة جديدة من قبل pipetting بلطف تعليق صعودا وهبوطا.
   7. عدد الخلايا مع عدادة الكريات ولوحة منها في T-75 قوارير في مناطق ذات كثافة من 2.1 × 10 ⁶ خلايا / قارورة. ضع قارورة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
   8. مراقبة الخلايا يوميا بالعين وتحت المجهر. إذا الانفلونزامعرف هناك حاجة إلى التجديد، جو معقم و مطهر نضح المتوسط ​​النمو الكامل من القارورة وتجاهل. إضافة حجم مساو من المتوسط ​​كاملة جديدة.
3. نشر خلايا
   1. جو معقم و مطهر إزالة المتوسطة من القارورة. إضافة 5 مل من Dulbecco والمالحة العازلة الفوسفات (DPBS) لشطف الخلايا والتخلص منها.
   2. فصل الخلايا من قارورة وذلك بإضافة 3 مل من التربسين 0.25٪. احتضان القارورة التي تحتوي على التربسين عند 37 درجة مئوية وCO ₂ 5٪ لمدة 5 إلى 10 دقائق.
   3. مراقبة الخلايا تحت المجهر (10X التكبير) وضمان أن تكون مستديرة وينحي.
   4. تحييد التربسين بإضافة حجم مساو من المتوسط ​​كاملة وتفتيت كتل من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
   5. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ونقل حجم التعليق الخلية المناسبة لقوارير جديدة في كثافة الخلية المذكورة في 1.2.7. إضافة وسائط جديدة بما فيه الكفاية بحيث الحجم النهائي هو 10 مل لكل قارورة.
4. Suspens خليةإعداد أيون لحقن
   ملاحظة: منذ الغشاء مصفوفة الطابق السفلي، وتركيز عال، يتصلب في RT، والحفاظ على جميع المواد على الجليد. ضع كل نصائح ماصة معقمة وقارورة في الثلاجة بين عشية وضحاها، والحفاظ على الجليد بينما كان يعمل على التعليق.
   1. إبقاء زجاجة من وسائل الاعلام RPMI دون أي إضافات على الجليد. ذوبان الجليد في غشاء مصفوفة الطابق السفلي، وتركيز عال، وذلك باتباع تعليمات الشركة الصانعة. ويفضل، قسامة في قوارير صغيرة لتجنب متعددة تجميد أذاب دورات ^10.
   2. وسائل الإعلام نضح من جميع القوارير، وشطف مع 5 مل من DPBS. كرر جميع الخطوات في القسم السابق تصل إلى الخطوة 1.3.4.
   3. نقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 125 x ج لمدة 8 دقائق على RT. نقل قارورة المخروطية إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية وإعادة تعليق بيليه باستخدام 10 مل من DPBS.
   4. ماصة بلطف تعليق صعودا وهبوطا لتفريق بيليه. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
   5. الطرد المركزي مرة أخرى كما هو مبين في الصورةتيب 1.4.3. نضح طاف واعتمادا على عدد من الخلايا، إضافة مخفف المناسب لانتاج 3 × 10 ⁶ الخلايا في حجم 50 ميكرولتر. سوف مخفف يكون مزيجا من وسائل الإعلام الحرة في الدم وتركيز عال الغشاء القاعدي مصفوفة في 1: (ت / ت) نسبة 1.
   6. دوامة تعليق بلطف والحفاظ على الجليد في جميع الأوقات. تعليق جاهز الآن للحقن.
5. زرع الجراحية
   ملاحظة: تأكد من أن جميع المواد والأدوات الجراحية المعقمة. ممارسة تقنيات العقيم في جميع الأوقات.
   1. وضع وسادة التدفئة على الطاولة، وتغطي مع ثنى العقيمة. إعداد آلة التخدير وضمان كافة المستلزمات هي في متناول الذراع.
   2. ضع خطم الحيوان في قناع التخدير وإعداد التخدير إلى 1 لتر / دقيقة من الأوكسجين و 2.5٪ الأيزوفلورين.
   3. فرك بلطف الجهة الحيوان مع اليود، وشطف مع 70٪ من الإيثانول. كرر ثلاث مرات.
   4. تأكيدهو تخدير الحيوان بالكامل من قبل معسر مخلب هند. الحيوان هو تخدير كامل وعلى استعداد لإجراء عملية جراحية إذا لوحظ أي رد. ومع ذلك، إذا flinches الحيوان، وضمان وجود تخدير كاف في المرذاذ والسماح للحيوان المزيد من الوقت للذهاب تماما تحت التخدير.
   5. تحميل ما يقرب من 200 ميكرولتر من تعليق خلية في حقنة 1.0 مل السل مع إبرة G 18 (تبريد سابقا). استبدال الإبرة مع 27 G إبرة والعودة إلى الجليد حتى جاهزة للاستخدام.
   6. تحديد المنطقة العامة للالطحال (الربع العلوي الأيسر من البطن) وباستخدام ملقط قرصة الجلد على رأس تلك المنطقة. باستخدام مقص جراحي إجراء شق ما يقرب من 1.0 سم إلى خلق جيب. وبالمثل، قرصة العضلات الملساء على رأس الطحال وقطع طريق من أجل الوصول إلى التجويف البريتوني.
   7. انتزاع بلطف نهاية الذيلية من الطحال والخروج به من الجسم. وسوف تعلق البنكرياس إلى الطحال. نشر البنكرياس باستخدام الحادي والرطبerile Q-طرف وتحديد ذيل البنكرياس.
   8. تقديم حقن 50 ميكرولتر في ذيل البنكرياس، وترك الإبرة داخل لمدة 10 ثانية، وتناوب ببطء الإبرة من البنكرياس. وهناك زرع ناجحة تبدو وكأنها فقاعة سطحية دون أي تسرب.
   9. العودة البنكرياس والطحال إلى تجويف البريتوني. أولا ضع العضلات ثم أرفق الجلد بشكل منفصل. استخدام خياطة 6-0 أو مشبك لإغلاق الجرح. لتجنب الألم في الحيوان وإدارة كيتوبروفين تحت الجلد (SC) (5 ملغ / كلغ) على مدى 24 ساعة. بدلا من ذلك، إدارة الشوري البوبرينورفين (0،05 حتي 0،1 ملغ / كلغ) كل 12 ساعة خلال فترة 36 ​​ساعة.
   10. استرداد الحيوانات من التخدير وإعادته إلى قفصه. كما رصد للألم. يجب توفير الحيوانات مع تخفيف الآلام في وقت (أو حتى قبل - وقائي) عملية جراحية. يجب توفير تخفيف الآلام إضافية للحيوانات التي تواجه الألم وفقا لIACCUC بروتوكول أو على النحو الذي يحدده فيتميل البيطري أو من ينوب عنه.
6. في التصوير فيفو
   ملاحظة: تم تنفيذ التقاط الصور باستخدام نظام التصوير التجاري مجهزة غرفة مظلمة والفلاتر المناسبة للتصوير GFP. تم إنجاز الحصول على الصور باستخدام كاميرا CCD ونظام بصري تتكون من عدسات قابلة للتبديل الإثارة / الانبعاثات (الإثارة: 455-495 نانومتر، الانبعاثات: 513-557 نانومتر). تم القبض على الصور الحقل مشرق بدون فلتر في 1 × 1 binning عن كل نقطة زمنية. الإثارة من GFP استخدمت مصدر زينون ضوء متعدد الأطياف. واستمرت الحيوانات تحت التخدير في جميع مراحل عملية التصوير من خلال ربط جهاز التخدير لمشعب التخدير الغاز المتكامل في غرفة مظلمة من نظام التصوير.
   1. تخدير الحيوان على النحو المبين في 1.5.2. قناع التخدير في المناطق الداخلية من غرفة مظلمة نظام التصوير التجاري من أجل الحفاظ على الحيوان تحت التخدير أثناء التصويرعملية.
   2. إعداد الصحيحة الإثارة وانبعاث المرشحات.
   3. تبدأ عن طريق الحصول على الصورة الأولية باستخدام الضوء الأبيض فقط. الحفاظ على نفس الموقف من الحيوانات طوال الدورة التصوير والتحول إلى المرشحات GFP لالتقاط صورة الثانية.
   4. للحصول على أفضل النتائج ركب كل من الصور. تحليل صورة لمنطقة الفلورسنت وكثافة.

النتائج

يصف هذا الأسلوب زرع مثلي الجراحية للخلايا السرطانية في البنكرياس الإنسان الفلورسنت، مع التركيز على إعداد تعليق خلية للحقن، والتخدير المناسبة للقوارض، والتسليم من التعليق الخلية عن طريق فتح البطن، واستخدام الفلورسنت في الجسم الحي التصوير ال?...

Discussion

نحن تصف نموذج الفئران مثلي من سرطان البنكرياس الذي يعبر عن GFP، مما يسمح بمراقبة غير الغازية من نمو الورم باستخدام الجسم كله في الجسم الحي التصوير فلوري (الشكل 1). هذه التقنية تتيح لنا مراقبة تطور الورم في الوقت الحقيقي (الشكل 3). يمكن أن يكون أداة ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI media 1640	Caisson Labs	RPL03-500ML
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-077
Penicillin Streptomycin	Thermo Ficher Sci	15140-122
Matrigel HC basement membrane, high concentration	Corning	354248
SutureVet PGA 6-0 PGA	Henry Schein	39010
Alcare or Foamed Antiseptic Handrub	Steris	639680
DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline)	Thermo Ficher Sci	21300025
TB Syringe 27 G 1/2	Becton Dickinson	305620
Isoflurane	Blutler Schein	50562
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health
Surgical Scissors, 5.5" straight mayo	Henry Schein	22-1600
PANC-1 GFP cell line	Anticancer, Inc
Small Animal Imaging System: iBox Scientia	UVP, LLC. Upland, CA.		Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals