Fluorescente modelo de ratón ortotópico de cáncer de páncreas

Resumen

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Resumen

El cáncer de páncreas es uno de los cánceres para los que la supervivencia no ha mejorado sustancialmente en las últimas décadas. Sólo el 7% de los pacientes diagnosticados sobrevivirá más de cinco años. Con el fin de entender y imitar el microentorno de los tumores pancreáticos, se utilizó un modelo ortotópico murino de cáncer de páncreas que permite formación de imágenes no invasiva de la progresión del tumor en tiempo real. Cáncer de páncreas células que expresan la proteína verde fluorescente (PANC-1 GFP) se suspendieron en matriz de la membrana basal, de alta concentración (por ejemplo, Matrigel HC) con medio libre de suero y luego se inyectan en la cola del páncreas a través de laparotomía. La suspensión de células en la matriz de alta concentración de la membrana basal se convierte en una sustancia similar al gel una vez que alcanza la temperatura ambiente; Por lo tanto, gelifica cuando entra en contacto con el páncreas, creando una obturación en el lugar de la inyección y la prevención de cualquier fuga de células. El crecimiento del tumor y la metástasis a otros órganos son monitoreados en vivoanimales mediante el uso de fluorescencia. Es fundamental utilizar los filtros adecuados para la excitación y emisión de GFP. Los pasos para la implantación ortotópico se detallan en este artículo que los investigadores puedan reproducir fácilmente el procedimiento en ratones desnudos. Los pasos principales de este protocolo son la preparación de la suspensión celular, la implantación quirúrgica, y todo fluorescente cuerpo de imágenes in vivo. Este modelo ortotópico está diseñado para investigar la eficacia de nuevos productos terapéuticos en tumores primarios y metastásicos.

Introducción

El cáncer de páncreas se diagnostica con mayor frecuencia en comparación con otros tipos de cáncer y es la principal causa ^4º de muertes relacionadas con cáncer en los Estados Unidos. Desde el momento del diagnóstico, más del 90% de los pacientes mueren dentro de los cinco años ^1,2. Actualmente, extirpación quirúrgica del tumor es la única cura para el cáncer de páncreas, pero menos del 20% de los pacientes son elegibles para someterse a una cirugía, principalmente porque en el momento del diagnóstico la enfermedad está en una etapa avanzada y se ha hecho metástasis ^3,4. La falta de síntomas específicos hace que el cáncer de páncreas una enfermedad silenciosa; algunos de los síntomas incluyen dolor abdominal, dolor de espalda, pérdida de apetito, ictericia y náuseas; que puede interpretarse fácilmente como enfermedades digestivas comunes ^4. Por esta razón, es importante desarrollar nuevas herramientas farmacológicas para ayudar en el diagnóstico y tratamiento del cáncer de páncreas.

El uso de modelos animales nos permite comprender la biología de Pancrécáncer y ATIC da una idea de aplicar este conocimiento a los seres humanos. Ortotópico modelos de xenoinjertos de cáncer de páncreas son realistas, ya que los tumores crecen en el órgano de origen ^5. En contraste con los modelos heterotópico, donde las líneas de células o fragmentos de tumor se implantaron subcutáneamente, modelado ortotópico permite la recreación del microambiente del tumor e imita la interacción de las células tumorales con su entorno ^6. El modelo de xenoinjerto descrito aquí deriva tumores de la línea celular de cáncer pancreático humano PANC-1 GFP, que se manipula genéticamente para expresar la proteína fluorescente verde (GFP). Detección de GFP permite para una formación de imágenes y el seguimiento del crecimiento del tumor y la metástasis ⁷ no invasiva. El desarrollo de tumores se produce rápidamente, de forma espontánea, y se asemeja mucho a la de los tumores primarios de pacientes con cáncer de páncreas humano ^8. modelos ortotópico proporcionan una predicción más precisa de la eficacia del fármaco en respuesta a los agentes terapéuticos, mientrasimitando el microambiente tumoral.

Como se mencionó anteriormente, este modelo animal permite la detección fluorescente de crecimiento tumoral y metástasis en tiempo real. detección fluorescente permite una imagen más directa / en vivo en comparación con la luminiscencia. Con la fluorescencia la luz emitida es el resultado de una excitación por otra luz de una longitud de onda más corta; mientras que en la luminiscencia, la luz emitida es el resultado de una reacción química y no puede tener una fuerte emisión ^9. Además, todo el cuerpo de imagen fluorescente in vivo no es perjudicial para el animal y permite a los investigadores para controlar el crecimiento del tumor con el tiempo en respuesta a los tratamientos terapéuticos.

Protocolo

El protocolo se describe a continuación se ejecuta bajo la guía y aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Western. Todos los experimentos se llevan a cabo de conformidad con todas las directrices pertinentes, la regulación y las agencias reguladoras.

1. Cultura de la célula

1. Preparación de medio completo
   1. El uso de una cabina de seguridad biológica de Clase II, preparar medio completo mediante la adición aséptica de suero bovino fetal (FBS) y penicilina estreptomicina (P / S) a una botella de 500 ml de medio RPMI. Mezclar suavemente por agitación. La concentración final de cada suplemento es / S (v / v). 10% de FBS y 1% P Por ejemplo, como complemento a 500 ml de medio con 56 ml de FBS y 6 ml P / S.
   2. Coloque medio completo en un baño de agua a 37 ° C.
2. Descongelación y células de multiplicación
   1. Recuperar las células PANC-1 GFP de nitrógeno líquido. Descongelar el vial por agitación suave en un baño de agua a 37 ° C.
      Nota:La descongelación debe ser rápida (aproximadamente 2 - 3 min).
   2. Etiqueta matraces T-75 para ser utilizado con (a) el nombre de la línea celular, la fecha (b) el número de pases, (c), y las iniciales (d) del investigador.
   3. Limpiar el vial con 70% de etanol y el vial de transferencia a una cabina de bioseguridad.
   4. Para propagar las células, añadir 9,0 ml de medio completo a un tubo cónico de 15 ml. Usando una pipeta 1,0 ml, transferir cuidadosamente la suspensión de células y suspender en 9 ml de medio completo.
   5. Centrifugar a 125 xg durante 8 minutos a TA. Transferir el vial cónica a una cabina de bioseguridad y aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
   6. Se suspende el precipitado en 10 ml de medio completo nuevo pipeteando suavemente la suspensión de arriba a abajo.
   7. Contar las células con un hemocitómetro y la placa en matraces T-75 a una densidad de 2,1 x 10 ⁶ células / matraz. Colocar el frasco en una incubadora a 37 ° C y 5% de _CO2.
   8. Supervisar las células diariamente por ojo y bajo el microscopio. Si la gripeIdentificación del que se necesita renovación, asépticamente aspirar el medio de crecimiento completo del matraz y se descarta. Añadir un volumen igual de medio completo fresco.
3. La propagación de las células
   1. Asépticamente eliminar medio del matraz. Añadir 5 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) para enjuagar las células y desechar.
   2. Separar las células del matraz mediante la adición de 3 ml de 0,25% de tripsina. Incubar matraz que contenía tripsina a 37 ° C y CO ₂ al 5% durante 5 a 10 min.
   3. Observar las células bajo el microscopio (aumento de 10X) y asegurarse de que son redondos y desalojado.
   4. Neutralizar la tripsina mediante la adición de un volumen igual de medio completo y romper los grumos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
   5. Contar las células usando un hemocitómetro y transferir el volumen de suspensión celular apropiada a nuevos matraces en la densidad celular se menciona en 1.2.7; añadir una cantidad suficiente de medio nuevo por lo que el volumen final es de 10 ml por frasco.
4. Suspens celularesPreparación de iones para Inyección
   Nota: Dado que la matriz de la membrana basal, alta concentración, se solidifica a temperatura ambiente, mantener todos los materiales en el hielo. Coloque todos los puntas de pipeta estériles y viales en el congelador durante la noche, y mantener en hielo mientras se trabaja en la suspensión.
   1. Mantenga una botella de medio RPMI sin ningún tipo de aditivos en el hielo. Descongelar la matriz de la membrana basal, alta concentración, siguiendo las instrucciones del fabricante. Preferiblemente, alícuota en viales más pequeños para evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación ^10.
   2. Aspirar los medios de comunicación de todos los frascos, y enjuague con 5 ml de DPBS. Repita todos los pasos en la sección anterior hasta el paso 1.3.4.
   3. Transferir el contenido a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 125 xg durante 8 minutos a TA. Transferir vial cónico de cabina de bioseguridad y volver a suspender el uso de pellets 10 ml de DPBS.
   4. pipeta suavemente la suspensión arriba y hacia abajo para romper la pastilla. Recuento de células utilizando un hemocitómetro.
   5. Centrifugar de nuevo como se indica en sTEP 1.4.3. Aspirar el sobrenadante y en función del número de células, añadir diluyente apropiado para producir 3 x 10 ⁶ células en un volumen de 50 l. El diluyente será una mezcla de medio libre de suero y la alta concentración de membrana de matriz en un sótano 1: (v / v) relación 1.
   6. Vórtex con la suspensión suavemente y mantener en hielo en todo momento. La suspensión está ahora lista para la inyección.
5. implantación quirúrgica
   Nota: Asegúrese de que todos los materiales e instrumentos quirúrgicos son estériles. Practicar técnicas asépticas en todo momento.
   1. Coloque una almohadilla térmica sobre la mesa y cubrir con un paño estéril. Configurar la máquina de anestesia y garantizar todos los suministros están al alcance de la mano.
   2. Coloque el hocico del animal en la máscara de anestesia y configurar la anestesia a 1 l / min de oxígeno y 2,5% de isoflurano.
   3. Frote suavemente el costado del animal con yodo, y enjuagar con etanol al 70%. Repetir tres veces.
   4. Confirmar laanimal esté totalmente anestesiado pellizcando la pata trasera. El animal es anestesiado completamente y listo para la cirugía si no se observa respuesta. Sin embargo, si el animal se estremece, asegurarse de que hay suficiente anestesia en el vaporizador y permitir que el animal más tiempo para ir completamente bajo anestesia.
   5. Cargar aproximadamente 200 l de la suspensión celular en una jeringa de 1,0 ml de TB con una aguja de 18 G (previamente enfriada). Vuelva a colocar la aguja con una aguja de 27 G y volver al hielo hasta que esté listo para su uso.
   6. Localizar el área general del bazo (cuadrante superior izquierdo del abdomen) y el uso de fórceps pellizcar la piel en la parte superior de esa región. Usando tijeras quirúrgicas hacer una incisión de aproximadamente 1,0 cm para crear un bolsillo. Del mismo modo, apretar el músculo liso en la parte superior del bazo y cortar a través con el fin de acceder a la cavidad peritoneal.
   7. agarrar suavemente el extremo caudal del bazo y tire de ella fuera del cuerpo. El páncreas se adjuntará al bazo. Difundir el páncreas usando una st húmedaerile Q-tip y localizar la cola del páncreas.
   8. Entregar la inyección de 50 l en la cola del páncreas, deje la aguja en el interior durante 10 segundos y gire lentamente la aguja del páncreas. Un éxito de la implantación se verá como una burbuja superficial sin cualquier fuga.
   9. Devolver el páncreas y el bazo a la cavidad peritoneal. En primer lugar encerrar el músculo y luego encerrar la piel por separado. Utilice una sutura o grapas 6-0 para cerrar la incisión. Para evitar el dolor en el animal, administrar ketoprofeno por vía subcutánea (SC) (5 mg / kg) durante 24 hr. Alternativamente, administrar sc buprenorfina (0,05 hasta 0,1 mg / kg) cada 12 horas durante un período de 36 horas.
   10. Recuperar el animal de la anestesia y devolverlo a su jaula. También tiene que controlar el dolor. Los animales deben estar provistos de alivio del dolor en el momento de (o incluso antes - preventivo) de la cirugía. el alivio del dolor adicional debe ser proporcionada a los animales que experimentan dolor según IACCUC protocolo o según lo prescrito por el altendiendo veterinario o persona designada.
6. En imágenes in vivo
   Nota: la captura de imágenes se realizó usando un sistema de formación de imágenes comercial equipado con una cámara oscura y los filtros adecuados para formación de imágenes GFP. La adquisición de imágenes se realizó utilizando una cámara CCD y un sistema óptico que consiste en lentes intercambiables de excitación / emisión de excitación (455 - 495 nm de emisión; 513 - 557 nm). imágenes de campo claro fueron capturados sin un filtro a 1 x 1 binning para cada punto de tiempo. La excitación de GFP utiliza una fuente de luz de xenón multiespectral. Los animales se mantuvieron bajo anestesia durante todo el proceso de formación de imágenes mediante la conexión de la máquina de anestesia a un colector de anestesia de gas integrado en la cámara oscura del sistema de imagen.
   1. Anestesiar al animal como se indica en 1.5.2. Una máscara de anestesia se encuentra en el interior de la cámara oscura del sistema de imagen comercial con el fin de mantener al animal bajo anestesia durante la formación de imágenesproceso.
   2. Configurar los filtros de excitación y emisión correctas.
   3. Comience por la obtención de una imagen inicial utilizando sólo la luz blanca. Mantener la misma posición del animal durante toda la sesión de imágenes y cambiar a los filtros de GFP para tomar una segunda imagen.
   4. Para obtener los mejores resultados se superponen las dos imágenes. Analizar la imagen para el área de fluorescencia e intensidad.

Resultados

Este método describe un implante ortotópico quirúrgica de las células cancerosas pancreáticas humanas fluorescentes, centrándose en la preparación de la suspensión de células para la inyección, la anestesia adecuada para los roedores, la entrega de la suspensión celular a través de laparotomía, y el uso de formación de imágenes fluorescente animal in vivo pequeño. La detección de una señal verde de fluorescencia (señal GFP) entre dos y tres semanas después de...

Discusión

Se describe un modelo murino ortotópico de cáncer de páncreas, que expresa GFP, lo que permite la monitorización no invasiva del crecimiento tumoral usando el cuerpo entero en imágenes fluorescentes vivo (Figura 1). Esta técnica nos permite monitorear el desarrollo de tumores en tiempo real (Figura 3); puede ser una herramienta importante para los investigadores estudiar la eficacia terapéutica de nuevos fármacos contra el cáncer de páncreas. Otro aspecto imp...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI media 1640	Caisson Labs	RPL03-500ML
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-077
Penicillin Streptomycin	Thermo Ficher Sci	15140-122
Matrigel HC	Corning	354248
SutureVet PGA 6-0 PGA	Henry Schein	39010
Alcare or Foamed Antiseptic Handrub	Steris	639680
DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline)	Thermo Ficher Sci	21300025
TB Syringe 27G1/2	Becton Dickinson	305620
Isoflurane	Blutler Schein	50562
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health
Surgical Scissors, 5.5"straight mayo	Henry Schein	22-1600
PANC-1 GFP cell line	Anticancer, Inc
Small Animal Imaging System:
iBOx Scientia, UVP :	UVP, LLC  Upland, CA.	Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals