Флуоресцентные Ортотопическая Мышь Модель панкреатического рака

Резюме

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Аннотация

Рак поджелудочной железы остается одним из видов рака, для которых выживание не значительно улучшилось за последние несколько десятилетий. Только 7% диагностированных пациентов проживут дольше, чем через пять лет. Для того, чтобы понять и имитируют микроокружение опухоли поджелудочной железы, мы использовали мышиную модель ортотопической рака поджелудочной железы, который позволяет неинвазивной визуализации прогрессии опухоли в режиме реального времени. Рак поджелудочной железы клетки , экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (PANC-1 GFP) суспендировали в матрице базальной мембраны, высокой концентрации (например, Матригель HC) с бессывороточной средой и затем вводили в хвост поджелудочной железы через лапаротомию. Суспензию клеток в матрице высокой концентрации базальной мембраны становится гелеобразной вещество, как только он достигнет комнатной температуры; Поэтому, гели, когда он вступает в контакт с поджелудочную железу, создавая уплотнение в месте инъекции и предотвратить утечку клеток. Рост опухоли и метастазирование в другие органы контролируются в прямом эфиреживотных с помощью флуоресценции. Очень важно использовать соответствующие фильтры для возбуждения и испускания GFP. Шаги для ортотопической имплантации подробно описаны в этой статье, так что исследователи могут легко повторить процедуру у голых мышей. Основные этапы этого протокола подготовка клеточной суспензии, хирургической имплантации, а также в целом флуоресцентный тела в естественных изображений. Эта ортотопическая модель предназначена для изучения эффективности новых терапевтических средств на первичных и метастатических опухолей.

Введение

Рак поджелудочной железы диагностируется с повышенной частотой по сравнению с другими видами рака и является 4 - ^й ведущей причиной смертности от онкологических заболеваний в Соединенных Штатах. С момента постановки диагноза, более 90% пациентов умирают в течение пяти лет ^1,2. В настоящее время хирургическое удаление опухоли является единственным лекарством от рака поджелудочной железы, но менее чем у 20% пациентов имеют право пройти операцию , главным образом потому , что в момент постановки диагноза болезнь находится на продвинутой стадии и метастазами ^3,4. Отсутствие конкретных симптомов делает рак поджелудочной железы молчком заболевание; некоторые симптомы включают боль в животе, боли в спине, потеря аппетита, желтуха и тошнота; которые могут быть легко интерпретированы как обычные заболеваний пищеварительного тракта ^4. По этой причине важно разработать новые инструменты фармакологические, чтобы помочь в диагностике и лечении рака поджелудочной железы.

Использование животных моделей позволяет нам понять биологию pancreATIC рака и дает представление о применении этих знаний для человека. Ксенотрансплантатных Ортотопическая модели рака поджелудочной железы являются реалистичными, поскольку опухоли растут в органе происхождения ^5. В отличие от моделей гетеротопных, где клеточные линии или фрагменты опухоли имплантируют подкожно, ортотопическая моделирование позволяет воссоздание микросреды опухоли и мимике взаимодействие опухолевых клеток с окружающей средой ^6. Модель ксенотрансплантата описанная здесь происходит от опухоли поджелудочной железы человека линии клеток рака PANC-1 GFP, который с помощью генной инженерии, чтобы выразить зеленый флуоресцентный белок (GFP). Обнаружение GFP позволяет для неинвазивной визуализации и мониторинга роста опухоли и метастаз ^7. Развитие опухоли происходит быстро, спонтанно, и близко напоминает первичных опухолей больных раком поджелудочной железы человека ^8. Ортотопической модели обеспечивают более точное предсказание эффективности лекарственного средства в ответ на терапевтических агентов, в то время какимитируя микросреды опухоли.

Как уже упоминалось выше, эта модель животного позволяет флуоресцентной детекции роста опухоли и метастаз в реальном масштабе времени. Флуоресцентные обнаружение позволяет более прямой / живого изображения по сравнению с люминесценцией. С помощью флуоресценции излучаемый свет является результатом возбуждения другим светом более короткой длиной волны; в то время как в люминесценции, излучаемый свет является результатом химической реакции и не может иметь сильное излучение ^9. Кроме того, все тело в естественных условиях флуоресцентной визуализации не наносит ущерба животному и позволяет исследователям контролировать рост опухоли с течением времени в ответ на терапевтические процедуры.

протокол

Протокол, описанный ниже, выполняется под руководством и утверждения животных по уходу и использованию комитета Западного университета. Все эксперименты выполняются в соответствии со всеми соответствующих руководящих принципов, правил и регулирующих органов.

1. Культура клеток

1. Приготовление полной среды
   1. Использование биологической безопасности II класса, подготовить полную среду путем добавления асептических фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллин стрептомицин (P / S) в 500 мл бутылка RPMI среды. Осторожно перемешать с помощью закрученного. Конечная концентрация каждого дополнения составляет 10% FBS и 1% P / S (об / об). Например, дополнить 500 мл среды с 56 мл FBS и 6 мл P / S.
   2. Поместите полную среду на водяной бане при 37 ° С.
2. Размораживание и распространяющихся клетки
   1. Получение PANC-1 GFP клеток из жидкого азота. Разморозьте флакон при осторожном перемешивании в водяной бане при 37 ° С.
      Заметка:Размораживание должно быть быстрым (примерно 2 - 3 мин).
   2. Этикетка Т-75 колб для использования с (а) название клеточной линии, дата (б) номер прохода, (с) и инициалов (D) исследователя.
   3. Протрите флакон с 70% этанола и переноса флакона в шкафу биологической безопасности.
   4. Размножать клетки, добавляют 9,0 мл полной среды в 15 мл коническую трубку. С помощью 1,0 мл пипетки, тщательно передачи клеточной суспензии и подвесить его в 9 мл полной среды.
   5. Центрифуга при 125 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре. Передача коническую флакон в шкафу биологической безопасности и аспирата супернатант, не нарушая гранул.
   6. Приостановить осадок в 10 мл свежей полной среды, осторожно пипеткой суспензию вверх и вниз.
   7. Граф клеток с гемоцитометра и пластины их в Т-75 колб при плотности 2,1 × 10 ⁶ клеток / колбу. Поместите колбу в термостате при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
   8. Монитор клетки ежедневно на глаз и под микроскопом. Если гриппID требуется обновление, асептически аспирация полную ростовую среду из колбы и выбросить. Добавить равный объем свежей полной среды.
3. Размножение клеток
   1. Консерванта удалить среду из колбы. Добавляют 5 мл фосфатного буферного солевого раствора Дульбекко (DPBS) ополаскивать клетки и выбросить.
   2. Открепления клеток из колбы путем добавления 3 мл 0,25% трипсина. Выдержите в колбу , содержащую трипсин при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение от 5 до 10 мин.
   3. Заметим клетки под микроскопом (10-кратным увеличением) и убедитесь, что они имеют круглую форму и смещаются.
   4. Нейтрализовать трипсина путем добавления равного объема полной среды и разбить комки, осторожно пипеткой вверх и вниз.
   5. Граф клеток с помощью гемоцитометра и передать соответствующий объем клеточной суспензии, к новым флаконах при плотности клеток, указанной в 1.2.7; добавить достаточно свежую среду, так что конечный объем 10 мл на колбу.
4. Клеточные SuspensПодготовка ионов для инъекций
   Примечание: Поскольку мембрана матрица подвал, высокая концентрация, затвердевает при комнатной температуре, хранить все материалы на льду. Поместите все стерильные наконечники пипеток и флаконов в морозильной камере в течение ночи, и держать на льду во время работы над подвеской.
   1. Держите бутылку RPMI СМИ без каких-либо добавок на льду. Оттепель матрицу базальной мембраны, высокую концентрацию, следуя инструкциям производителя. Предпочтительно, чтобы аликвоты на более мелкие пузырьки , чтобы избежать многократных циклов ¹⁰ замораживания-оттаивания.
   2. Аспирируйте средств массовой информации из всех колб и промыть 5 мл ДЗФР. Повторите все шаги на предыдущем разделе до шага 1.3.4.
   3. Перенесите содержимое в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируют при 125 х г в течение 8 мин при комнатной температуре. Передача коническую флакон с биозащитой и повторно приостанавливать осадок в 10 мл ДЗФР.
   4. Аккуратно пипеткой подвеску вверх и вниз, чтобы разбить осадок. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
   5. снова центрифуге, как указано в секундахТЭП 1.4.3. Отберите супернатант и в зависимости от количества клеток, добавить соответствующий разбавитель с получением 3 х 10 ⁶ клеток в объеме 50 мкл. Разбавитель будет представлять собой смесь бессывороточной среды и высокой концентрацией подвальный матрицы мембраны в 1: (об / об) соотношении 1.
   6. Vortex суспензию осторожно и держать на льду во все времена. Подвеска теперь готов к инъекции.
5. Хирургическая имплантация
   Примечание: Убедитесь, что все хирургические материалы и инструменты стерильны. Практика асептики во все времена.
   1. Поместите грелку на стол и накрыть стерильной драпировки. Установите наркозный аппарат и убедитесь, что все поставки находятся в пределах досягаемости руки.
   2. Поместите морду животного в маску анестезии и установить наркоз до 1 л / мин кислорода и 2,5% изофлуран.
   3. Аккуратно скраб фланг животного с йодом, и промыть 70% -ным этанолом. Повторите три раза.
   4. Подтвердитьживотное полностью под наркозом, зажимая заднюю лапу. Животное полностью под наркозом и готов к операции, если не наблюдается никакого ответа. Тем не менее, если животное вздрагивает, обеспечения достаточно эффективной анестезии в испарителем и позволить животному больше времени, чтобы пройти полностью под наркозом.
   5. Нагрузка приблизительно по 200 мкл суспензии клеток в 1,0 мл ТБ шприц с иглой 18 G (предварительно охлажденного). Заменить иглу с 27 G иглой и возвращают на лед, пока готов к использованию.
   6. Найдите общую область селезенки (левый верхний квадрант живота) и с помощью щипцов ущипнуть кожу на верхней части этого региона. Используя хирургические ножницы, делают надрез приблизительно 1,0 см, чтобы создать карман. Точно так же, зажать гладкие мышцы в верхней части селезенки и прорезать для того, чтобы получить доступ в брюшную полость.
   7. Осторожно возьмите Хвостовой конец селезенки и вытащить его из тела. Поджелудочная железа будет прикреплен к селезенке. Распространение поджелудочной железы с помощью влажной улerile Q-Tip и найти хвост поджелудочной железы.
   8. Доставьте инъекцию 50 мкл в хвост поджелудочной железы, оставьте иглу в течение 10 секунд и медленно вращать иглу из поджелудочной железы. Успешная имплантация будет выглядеть как поверхностный пузырь без каких-либо утечек.
   9. Возвращение поджелудочной железы и селезенки в брюшную полость. Сначала необходимо заключить мышцу, а затем приложите кожу отдельно. Используйте 6-0 шовного или скрепку, чтобы закрыть разрез. Для того, чтобы избежать боли в животном, администрировать кетопрофен подкожно (SC) (5 мг / кг) в течение 24 часов. В качестве альтернативы, управлять бупренорфин SC (0,05 - 0,1 мг / кг) через каждые 12 ч в течение периода 36 ч.
   10. Восстановить животное от наркоза и вернуть его в клетку. Также монитор для боли. Животные должны быть обеспечены облегчения боли во время (или даже до - упреждающий) хирургии. Дополнительное облегчение боли должна быть предоставлена ​​животных, которые испытывают боль в соответствии с IACCUC-протоколу или, как это предписано встремящейся к ветеринару или исполняющему.
6. В естественных изображений
   Примечание: Захват изображения был выполнен с использованием коммерческой системы формирования изображения, оснащенного темной камерой и соответствующими фильтрами для визуализации GFP. Получение изображений осуществляли с использованием ПЗС-камеры и оптическую систему, состоящую из сменных объективов возбуждения / испускания (возбуждение: 455 - 495 нм; Излучение: 513 - 557 нм). Яркие образы полей были захвачены без фильтра на 1 х 1 биннинга для каждой временной точки. Возбуждение GFP используется ксеноновая мультиспектральных источник света. Животных содержали под наркозом в течение всего процесса формирования изображения, подключив машина анестезии к газовой анестезии коллектор интегрирован в темную камеру системы формирования изображения.
   1. Обезболить животное, как указано в 1.5.2. Маска анестезия в интерьере темной камере коммерческого системы формирования изображения для того, чтобы держать животное под наркозом во время визуализацииобработать.
   2. Настройка правильного возбуждения и эмиссии фильтров.
   3. Начните с получения исходного изображения, используя только белый свет. Держите ту же позицию животного в течение всей сессии визуализации и переключиться на GFP фильтров, чтобы занять второе изображение.
   4. Для достижения наилучших результатов накладываться оба изображения. Анализ изображения для флуоресцентной области и интенсивности.

Результаты

Этот метод описан хирургический ортотопической имплантации флуоресцентных человека клеток рака поджелудочной железы, сосредоточив внимание на подготовке клеточной суспензии для инъекций, надлежащей анестезии для грызунов, поставка клеточной суспензии через лапа?...

Обсуждение

Мы описываем ортотопической мышиной модели рака поджелудочной железы , который выражает GFP, таким образом , позволяя неинвазивный мониторинг роста опухоли с использованием всего тела в естественных условиях флуоресцентной визуализации (Рисунок 1). Этот метод позволяет к?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI media 1640	Caisson Labs	RPL03-500ML
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-077
Penicillin Streptomycin	Thermo Ficher Sci	15140-122
Matrigel HC basement membrane, high concentration	Corning	354248
SutureVet PGA 6-0 PGA	Henry Schein	39010
Alcare or Foamed Antiseptic Handrub	Steris	639680
DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline)	Thermo Ficher Sci	21300025
TB Syringe 27 G 1/2	Becton Dickinson	305620
Isoflurane	Blutler Schein	50562
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health
Surgical Scissors, 5.5" straight mayo	Henry Schein	22-1600
PANC-1 GFP cell line	Anticancer, Inc
Small Animal Imaging System: iBox Scientia	UVP, LLC. Upland, CA.		Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals