Fluorescente modelo de camundongo ortotópico de câncer de pâncreas

Resumo

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Resumo

O câncer de pâncreas continua a ser um dos cancros para os quais a sobrevivência não melhorou substancialmente nos últimos décadas. Apenas 7% dos pacientes diagnosticados vai sobreviver mais do que cinco anos. De modo a compreender e imitar o microambiente de tumores pancreáticos, utilizou-se um modelo murino ortotópico de cancro do pâncreas que permite imagem não invasiva de progressão do tumor em tempo real. Células de cancro do pâncreas que expressam a proteína fluorescente verde (GFP PANC-1) foram suspensos em matriz da membrana basal, de alta concentração, (por exemplo, Matrigel HC) com meio isento de soro e, em seguida, injectado no cauda do pâncreas por laparotomia. A suspensão de células na matriz de membrana basal elevada concentração torna-se uma substância do tipo gel, uma vez que atinja a temperatura ambiente; Portanto, gelifica quando entra em contacto com o pâncreas, criando uma vedação no local da injecção e impedir qualquer fuga de células. O crescimento do tumor ea metástase para outros órgãos são monitorados em directoanimais usando fluorescência. É fundamental utilizar os filtros apropriados para a excitação e de emissão de GFP. Os passos para a implantação ortotópica são detalhados neste artigo para que os pesquisadores podem facilmente replicar o processo em ratinhos nus. Os passos principais deste protocolo são preparação da suspensão de células, a implantação cirúrgica, e todo o corpo fluorescente imagiologia in vivo. Este modelo ortotópico foi concebido para investigar a eficácia de novos terapêutica em tumores primários e metastáticos.

Introdução

O câncer de pâncreas é diagnosticada com maior frequência em comparação com outros tipos de câncer e é o ^4º principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. A partir do momento do diagnóstico, mais de 90% dos pacientes morrem dentro de cinco anos ^1,2. Actualmente, a remoção cirúrgica do tumor é a única cura para o cancro do pâncreas, mas menos do que 20% dos doentes são elegíveis para se submeter a cirurgia, principalmente devido ao momento do diagnóstico da doença é em fase avançada e tem metástase ^3,4. A falta de sintomas específicos faz com que o câncer de pâncreas uma doença silenciosa; alguns dos sintomas incluem dor abdominal, dor nas costas, perda de apetite, náuseas e icterícia; que pode ser facilmente interpretado como doenças digestivas comuns ^4. Por esta razão, é importante desenvolver novas ferramentas farmacológicas para auxiliar no diagnóstico e tratamento de cancro pancreático.

A utilização de modelos animais nos permite compreender a biologia do pancrecâncer e atic proporciona um insight sobre a aplicação deste conhecimento para os seres humanos. Modelos ortotópicos xenoenxerto de câncer de pâncreas são realistas, porque os tumores crescem no órgão de origem ^5. Em contraste com os modelos heterotópicos, onde as linhas de células tumorais ou fragmentos são implantados subcutaneamente, modelagem ortotópico permite a recriação do microambiente tumoral e imita a interacção das células tumorais com os seus arredores ^6. O modelo de xenoenxerto de tumores descrito aqui deriva a partir da linha celular de cancro pancreático humano PANC-1 GFP, que é geneticamente manipulada para expressar a proteína fluorescente verde (GFP). Detecção de GFP permite para uma imagiologia e monitorização do crescimento do tumor e metástases ⁷ não-invasiva. O desenvolvimento do tumor ocorre rapidamente, de forma espontânea, e se assemelha a de tumores primários de pacientes com câncer pancreático humanos ^8. modelos ortotópicos proporcionar uma previsão mais exacta da eficácia do fármaco em resposta a agentes terapêuticos, enquantosimulando o microambiente do tumor.

Como mencionado acima, este modelo animal permite a detecção de fluorescência do crescimento de tumores e metástases em tempo real. detecção fluorescente permite uma imagem mais direta / live comparação com luminescência. Com a fluorescência, a luz emitida é um resultado de uma excitação por luz de um outro comprimento de onda menor; Considerando que, a emissão de luz, a luz emitida é o resultado de uma reacção química e pode não ter forte emissão ^9. Além disso, todo o corpo in vivo de imagens de fluorescência não é prejudicial para o animal e permite aos investigadores para monitorizar o crescimento do tumor ao longo do tempo em resposta a tratamentos terapêuticos.

Protocolo

O protocolo descrito a seguir é executado sob a orientação e aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Ocidental. Todos os experimentos são realizados em conformidade com todas as orientações pertinentes, regulação e agências reguladoras.

Cultura 1. celular

1. Preparação de Meio Completo
   1. Usando uma câmara de segurança biológica de Classe II, preparar meio completo por adição asséptica de soro fetal de bovino (FBS) e penicilina estreptomicina (P / S) para um frasco de 500 ml de meio RPMI. Misture delicadamente por agitação. A concentração final de cada um suplemento é 10% de FBS e 1% de P / S (v / v). Por exemplo, completar a 500 ml de meio com FBS a 56 ml e 6 ml de P / S.
   2. Coloque meio completo num banho de água a 37 ° C.
2. Descongelamento e Células Propagação
   1. Recuperar células PANC-1 GFP de nitrogênio líquido. Descongelar o frasco por agitação suave num banho de água a 37 ° C.
      Nota:O descongelamento deve ser rápida (aproximadamente 2-3 minutos).
   2. Etiqueta frascos T-75 para ser usado com (a) o nome de linha de células, data (b) Número de passagem, (c), e as iniciais (d) do pesquisador.
   3. Limpe o frasco com 70% de etanol e transferência frasco a uma cabine de segurança biológica.
   4. Para propagar as células, adicionar 9,0 ml de meio completo a um tubo de 15 ml. Usando uma pipeta de 1,0 ml, transferir cuidadosamente a suspensão de células e suspendê-lo em 9 ml de meio completo.
   5. Centrifugar a 125 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente. Transferir o frasco cónico de uma cabine de segurança biológica e aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
   6. Suspende-se o sedimento em 10 ml de meio completo fresco pipetando suavemente a suspensão para cima e para baixo.
   7. Contar as células com um hemocitómetro e placa-los em frascos T-75 a uma densidade de 2,1 X 10 ⁶ células / balão. Coloque balão numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
   8. Monitorizar as células por dia por olho e sob o microscópio. Se a gripeID de renovação é necessária, de forma asséptica aspirar o meio de crescimento completo do frasco e descarte. Adicionar um volume igual de meio completo fresco.
3. propagação Cells
   1. Assepticamente remover o meio do frasco. Adicionar 5 ml de solução salina de tampão de fosfato de Dulbecco (DPBS) para lavar as células e descartar.
   2. Separe as células a partir do balão por adição de 3 ml de 0,25% de tripsina. Incubar balão contendo tripsina a 37 ° C e _CO2 a 5% durante 5 a 10 min.
   3. Observar células ao microscópio (aumento de 10x) e garantir que eles são redondos e desalojado.
   4. Neutralizar a tripsina, adicionando um volume igual de meio completo e quebrar aglomerados cuidado pipetando para cima e para baixo.
   5. Contar as células utilizando um hemocitómetro e transferir o volume de suspensão de células apropriado para novos frascos à densidade celular indicado em 1.2.7; adicionar meio fresco suficiente para que o volume final é de 10 ml por frasco.
4. Suspens celularesPreparação ion para Injecção
   Nota: Uma vez que a matriz de membrana basal, alta concentração, solidifica à temperatura ambiente, manter todos os materiais no gelo. Coloque todas as pontas de pipetas estéreis e frascos no congelador durante a noite, e manter em gelo durante o trabalho sobre a suspensão.
   1. Mantenha uma garrafa de meio RPMI sem quaisquer aditivos no gelo. Descongelar a matriz da membrana basal, de alta concentração, seguindo as instruções do fabricante. De preferência, alíquota em frascos menores para evitar a múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento ^10.
   2. media aspirado de todos os frascos, e lavar com 5 ml de DPBS. Repita todas as etapas na seção anterior até ao passo 1.3.4.
   3. Transferir o conteúdo para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 125 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente. Transferir frasco cónico a cabine de segurança biológica e re-suspender pellet usando 10 ml de DPBS.
   4. Pipeta suavemente a suspensão cima e para baixo para quebrar o sedimento. Contagem de células utilizando um hemocitómetro.
   5. Centrifugar mais uma vez como descrito em Step 1.4.3. Aspirar o sobrenadante e, dependendo do número de células, adicionar diluente adequado, para se obter 3 X 10 ⁶ células num volume de 50 ul. O diluente será uma mistura de meio isento de soro e membrana basal da matriz concentração elevada numa proporção de 1: (v / v) relação 1.
   6. Vortex a suspensão suavemente e manter em gelo em todos os momentos. A suspensão é agora pronto para a injecção.
5. O implante cirúrgico
   Nota: Certifique-se de que todos os materiais e instrumentos cirúrgicos são estéreis. Pratique técnicas de assepsia em todos os momentos.
   1. Coloque uma almofada de aquecimento sobre a mesa e cobrir com uma cortina estéril. Configurar o aparelho de anestesia e assegurar todos os suprimentos estão dentro do alcance do braço.
   2. Coloque o focinho do animal para a máscara de anestesia e configurar a anestesia a 1 L / min de oxigênio e 2,5% de isoflurano.
   3. Esfregar suavemente no flanco do animal com iodo, e lavar com 70% de etanol. Repita três vezes.
   4. Confirme oanimal é totalmente anestesiados por beliscar a pata traseira. O animal é totalmente anestesiado e pronto para a cirurgia se não houver resposta é observada. No entanto, se o animal se encolhe, garantir que há anestesia suficiente no vaporizador e permitir que o animal mais tempo para ir completamente sob anestesia.
   5. Carga de aproximadamente 200 mL da suspensão de células para uma seringa de 1,0 ml de TB com uma agulha G 18 (previamente arrefecida). Substituir a agulha com uma agulha de 27 G e voltar ao gelo até estar pronto para usar.
   6. Localize a área geral do baço (quadrante superior esquerdo do abdome) e usando uma pinça beliscar a pele em cima daquela região. Usando uma tesoura cirúrgica fazer uma incisão de aproximadamente 1,0 cm para criar um bolso. Do mesmo modo, apertar o músculo liso no topo do baço e a atravessar a fim de aceder à cavidade peritoneal.
   7. Agarram delicadamente a extremidade caudal do baço e puxe-o para fora do corpo. O pâncreas será ligado ao baço. Espalhe o pâncreas usando um st molhadaerile Q-tip e localizar a cauda do pâncreas.
   8. Entregue a injeção de 50 mL para a cauda do pâncreas, deixe a agulha dentro de 10 seg e girar lentamente a agulha do pâncreas. A implantação bem sucedida será parecido com uma bolha superficial, sem qualquer vazamento.
   9. Devolver o pâncreas e baço para a cavidade peritoneal. Primeiro coloque o músculo e, em seguida, coloque a pele separadamente. Utilize uma sutura ou agrafo 6-0 para fechar a incisão. Para evitar a dor no animal, administrar cetoprofeno por via subcutânea (SC) (5 mg / kg) ao longo de 24 h. Alternativamente, SC administrar buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg) a cada 12 horas durante um período de 36 h.
   10. Recuperar o animal de anestesia e devolvê-lo à sua gaiola. Igualmente controlar a dor. Os animais devem ser fornecidos com o alívio da dor no momento da (ou mesmo antes - de preferência) a cirurgia. alívio adicional da dor deve ser fornecido aos animais que experimentam a dor de acordo com IACCUC-protocolo ou como prescrito pelo notendendo veterinário ou pessoa designada.
6. Na imagem in vivo
   Nota: A captura de imagem foi realizada utilizando um sistema de imagem comercial equipado com uma câmara escura e os filtros apropriados para imagiologia de GFP. A aquisição de imagens foi realizada utilizando uma câmera CCD e um sistema óptico consistindo de lentes intercambiáveis ​​excitação / emissão (excitação: 455-495 nm; emissão: 513-557 nm). as imagens de campo claro foram capturados sem um filtro de 1 x 1 binning para cada ponto de tempo. Excitação de GFP utilizada uma fonte de luz xenon multiespectral. Os animais foram mantidos sob anestesia durante o processo de imagiologia por ligar o aparelho de anestesia com um colector de anestesia de gás integrada na câmara escura do sistema de imagem.
   1. Anestesiar o animal, tal como descrito em 1.5.2. Uma máscara de anestesia é, no interior da câmara escura do sistema de imagem comercial, a fim de manter o animal sob anestesia durante a imagiologiaprocesso.
   2. Configure os filtros de excitação e emissão corretas.
   3. Comece a obtenção de uma imagem inicial usando apenas luz branca. Mantenha a mesma posição do animal durante toda a sessão de imagem e mudar para filtros GFP para tomar uma segunda imagem.
   4. Para obter melhores resultados sobrepor as duas imagens. Analisar a imagem para a área fluorescente e intensidade.

Resultados

Este método descreve um implante ortotópico cirúrgica das células cancerosas pancreáticas humanas fluorescentes, com foco na preparação da suspensão de células para injecção, anestesia adequada para os roedores, a entrega de suspensão de células via laparotomia, eo uso de fluorescente em imagens de pequenos animais in vivo. A detecção de um sinal verde fluorescente (sinal GFP) entre duas e três semanas pós-implantação, fornece investigadores uma suges...

Discussão

Descreve-se um modelo murino ortotópico de cancro do pâncreas que expressa GFP, permitindo, assim, a monitorização não invasiva do crescimento do tumor usando todo o corpo in vivo imagiologia fluorescente (Figura 1). Esta técnica permite monitorar o desenvolvimento do tumor em tempo real (Figura 3); ele pode ser uma ferramenta importante para pesquisadores para estudar a eficácia terapêutica de novos agentes contra o câncer de pâncreas. Outro aspecto importante deste ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI media 1640	Caisson Labs	RPL03-500ML
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-077
Penicillin Streptomycin	Thermo Ficher Sci	15140-122
Matrigel HC	Corning	354248
SutureVet PGA 6-0 PGA	Henry Schein	39010
Alcare or Foamed Antiseptic Handrub	Steris	639680
DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline)	Thermo Ficher Sci	21300025
TB Syringe 27G1/2	Becton Dickinson	305620
Isoflurane	Blutler Schein	50562
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health
Surgical Scissors, 5.5"straight mayo	Henry Schein	22-1600
PANC-1 GFP cell line	Anticancer, Inc
Small Animal Imaging System:
iBOx Scientia, UVP :	UVP, LLC  Upland, CA.	Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals