Fluorescente ortotopico modello murino di cancro al pancreas

Riepilogo

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Abstract

Il tumore al pancreas rimane uno dei tumori per i quali la sopravvivenza non è migliorata notevolmente negli ultimi decenni. Solo il 7% dei pazienti diagnosticati sopravviverà più di cinque anni. Al fine di comprendere e imitare il microambiente dei tumori pancreatici, abbiamo utilizzato un modello murino ortotopico di cancro al pancreas che permette l'imaging non invasivo di progressione del tumore in tempo reale. Le cellule tumorali pancreatiche che esprimono la proteina fluorescente verde (PANC-1 GFP) sono state sospese in matrice di membrana basale, ad alta concentrazione, (ad esempio, Matrigel HC) con mezzi privi di siero e poi iniettate nella coda del pancreas attraverso laparotomia. La sospensione cellulare nella matrice alta concentrazione membrana basale diventa una sostanza gelatinosa, una volta raggiunta la temperatura ambiente; Pertanto, si gelifica quando entra in contatto con il pancreas, creando un'occlusione sito di iniezione e da evitare fuoriuscite cellule. la crescita del tumore e metastasi ad altri organi sono monitorati in tempo realeanimali utilizzando la fluorescenza. È fondamentale utilizzare i filtri appropriati per l'eccitazione e l'emissione di GFP. La procedura per l'impianto ortotopico sono descritti in questo articolo per cui i ricercatori possono facilmente replicare la procedura in topi nudi. Le fasi principali di questo protocollo sono preparazione della sospensione cellulare, impianto chirurgico, e tutto il corpo fluorescente imaging in vivo. Questo modello ortotopico è stato progettato per valutare l'efficacia di nuove terapie per i tumori primari e metastatici.

Introduzione

Il tumore al pancreas viene diagnosticato con maggior frequenza rispetto ad altri tipi di cancro ed è la 4 ^° causa principale di decessi correlati al cancro negli Stati Uniti. Dal momento della diagnosi, oltre il 90% dei pazienti muoiono entro cinque anni ^1,2. Attualmente, la rimozione del tumore chirurgica è l'unica cura per il cancro al pancreas, ma meno del 20% dei pazienti hanno diritto a sottoporsi ad intervento chirurgico soprattutto perché al momento della diagnosi della malattia è in fase avanzata e ha metastatizzato ^3,4. La mancanza di sintomi specifici rende cancro al pancreas una malattia silenziosa; alcuni dei sintomi includono dolore addominale, mal di schiena, perdita di appetito, ittero e nausea; che può essere facilmente interpretato come malattie digestive comuni ^4. Per questo motivo, è importante sviluppare nuovi strumenti farmacologici per aiutare nella diagnosi e nel trattamento del cancro pancreatico.

L'uso di modelli animali ci permette di capire la biologia del Pancrécancro e ATIC fornisce una panoramica di applicare questa conoscenza per gli esseri umani. Xenotrapianto modelli ortotopici del cancro del pancreas sono realistici, perché i tumori crescono nell'organo di origine ^5. A differenza dei modelli eterotopici, in cui le linee di cellule o frammenti di tumore vengono impiantati per via sottocutanea, la modellazione ortotopico permette per la ricreazione del microambiente tumorale e imita l'interazione delle cellule tumorali con l'ambiente circostante ^6. Il modello di xenotrapianto descritto qui deriva tumori dal pancreas linea di cellule umane di cancro PANC-1 GFP, che è geneticamente per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP). Rilevamento GFP permette di imaging e monitoraggio della crescita tumorale e metastasi ⁷ non invasivo. Lo sviluppo del tumore avviene rapidamente, spontaneamente, e assomiglia molto a quello dei tumori primari di umani malati di cancro del pancreas ^8. modelli ortotopico fornire una previsione più accurata della efficacia del farmaco in risposta ad agenti terapeutici, mentreimitando il microambiente tumorale.

Come accennato in precedenza, questo modello animale permette la rilevazione fluorescente della crescita tumorale e metastasi in tempo reale. rilevazione fluorescente consente una formazione immagine più diretta / dal vivo rispetto a luminescenza. Con la fluorescenza della luce emessa è il risultato di una eccitazione da un'altra luce di una lunghezza d'onda; mentre in luminescenza, la luce emessa è il risultato di una reazione chimica e non può avere forti emissioni ^9. Inoltre, tutto il corpo imaging in vivo fluorescente non è dannoso per l'animale e permette ai ricercatori di monitorare la crescita del tumore nel tempo in risposta a trattamenti terapeutici.

Protocollo

Il protocollo descritto di seguito viene eseguito sotto la guida e l'approvazione del Comitato di cura e l'uso di animali di Western University. Tutti gli esperimenti sono eseguiti in conformità con tutte le linee guida, dei regolamenti e agenzie di regolamentazione.

Cultura 1. cellulare

1. Preparazione del terreno completo
   1. Utilizzando una cappa di sicurezza biologica Classe II, preparare terreno completo aggiungendo asetticamente siero fetale bovino (FBS) e la penicillina streptomicina (P / S) ad una bottiglia da 500 ml di terreno RPMI. Mescolare delicatamente agitando. La concentrazione finale di ogni supplemento è del 10% FBS e 1% P / S (v / v). Ad esempio, integrare 500 ml di media con 56 ml di FBS e 6 ml P / S.
   2. Posizionare terreno completo in un bagno d'acqua a 37 ° C.
2. Scongelamento e cellule di moltiplicazione
   1. Recupera le cellule PANC-1 GFP da azoto liquido. Scongelare il flacone delicatamente l'agitazione in un bagno d'acqua a 37 ° C.
      Nota:Scongelamento dovrebbe essere rapida (circa 2 - 3 min).
   2. Label T-75 palloni da utilizzare con (a) nome di cella-line, la data (b) il numero di passaggio, (c), e le iniziali (d), del ricercatore.
   3. Pulire la fiala con il 70% di etanolo e il trasferimento fiala di un armadio biosicurezza.
   4. Per propagare le cellule, aggiungere 9,0 ml di mezzo completo in un tubo da 15 ml. Usando una pipetta 1,0 ml, trasferire accuratamente la sospensione cellulare e sospenderlo in 9 ml di mezzo completo.
   5. Centrifugare a 125 xg per 8 minuti a temperatura ambiente. Trasferire la fiala conica di un armadio biosicurezza e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet.
   6. Sospendere il pellet in 10 ml di mezzo fresco completa pipettando delicatamente la sospensione su e giù.
   7. Contare le cellule con un emocitometro e piastra in T-75 flaconi ad una densità di 2,1 x 10 ⁶ cellule / fiasco. Inserire pallone in un incubatore a 37 ° C e 5% CO _2.
   8. Monitorare le cellule giornaliera a occhio e al microscopio. Se l'influenzaid è necessario il rinnovo, in modo asettico aspirare il mezzo di crescita completo dal pallone e scartare. Aggiungere uguale volume di mezzo fresco completa.
3. propagazione Cells
   1. Asetticamente rimuovere media dal pallone. Aggiungere 5 ml di tampone fosfato salina Dulbecco (DPBS) per lavare le cellule e scartare.
   2. Staccare le cellule dal pallone con l'aggiunta di 3 ml di 0,25% tripsina. Incubare pallone contenente tripsina a 37 ° C e 5% CO ₂ per 5 a 10 min.
   3. Osservare le cellule al microscopio (ingrandimento 10x) e assicurarsi che sono rotondi e sloggiato.
   4. Neutralizzare tripsina aggiungendo un volume uguale di mezzo completo e rompere i grumi delicatamente pipettando su e giù.
   5. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e trasferire il volume di sospensione cellulare opportuno nuovi palloni alla densità cellulare di cui al 1.2.7; aggiungere abbastanza mezzi freschi in modo che il volume finale è di 10 ml per pallone.
4. Suspens cellulariione Preparazione per l'iniezione
   Nota: Dal momento che la matrice di membrana basale, ad alta concentrazione, solidifica a temperatura ambiente, conservare i materiali sul ghiaccio. Mettere tutti puntali sterili e fiale nel congelatore durante la notte, e tenere in ghiaccio mentre si lavora sulla sospensione.
   1. Tenere una bottiglia di RPMI mezzi senza additivi su ghiaccio. Scongelare la matrice di membrana basale, ad alta concentrazione, seguendo le istruzioni del produttore. Preferibilmente, aliquota in fiale piccole per evitare più cicli di gelo-disgelo ^10.
   2. supporti Aspirare da tutti i palloni, e risciacquare con 5 ml di DPBS. Ripetere tutti i passaggi nella sezione precedente, fino al punto 1.3.4.
   3. Trasferire contenuto in una provetta conica da 15 ml e centrifugare a 125 xg per 8 minuti a temperatura ambiente. Trasferimento fiala conica all'armadietto biosicurezza e risospendere pellet con 10 ml di DPBS.
   4. pipettare delicatamente la sospensione su e giù per rompere il pellet. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
   5. ancora Centrifugare come indicato in sTep 1.4.3. Aspirare il surnatante e in funzione del numero di cellule, aggiungere diluente appropriato produrre 3 x 10 ⁶ cellule in un volume di 50 microlitri. Il diluente sarà una miscela di siero media liberi e alta concentrazione membrana matrice interrato in 1: (v / v) rapporto 1.
   6. Agitare la sospensione delicatamente e tenere in ghiaccio in ogni momento. La sospensione è ora pronto per l'iniezione.
5. impianto chirurgico
   Nota: Assicurarsi che tutti i materiali e gli strumenti chirurgici sono sterili. Pratica tecniche asettiche in ogni momento.
   1. Posizionare una piastra elettrica sul tavolo e coprire con un telo sterile. Impostare la macchina per anestesia e garantire tutte le forniture sono a portata di mano.
   2. Posizionare muso dell'animale nella maschera anestesia e impostare l'anestesia a 1 L / min di ossigeno e 2,5% isoflurano.
   3. Pulire delicatamente il fianco dell'animale con iodio, e risciacquare con il 70% di etanolo. Ripetete tre volte.
   4. confermare laanimale è completamente anestetizzato pizzicando la zampa posteriore. L'animale è completamente anestetizzato e pronta per la chirurgia se non si osserva alcuna risposta. Tuttavia, se l'animale indietreggia, assicurarsi che ci sia sufficiente l'anestesia vaporizzatore e permettere all'animale più tempo per andare completamente sotto anestesia.
   5. Caricare circa 200 ml di sospensione cellulare in una siringa 1,0 ml TB con un ago da 18 G (precedentemente raffreddato). Sostituire l'ago con un ago G 27 e tornare al ghiaccio fino al momento dell'uso.
   6. Individuare l'area generale della milza (quadrante superiore sinistro dell'addome) e l'utilizzo di pinze pizzicare la pelle sulla parte superiore di quella regione. Utilizzando le forbici chirurgiche fare un'incisione di circa 1,0 centimetri per creare una tasca. Analogamente, pizzicare la muscolatura liscia sulla parte superiore della milza e tagliare per accedere alla cavità peritoneale.
   7. afferrare delicatamente l'estremità caudale della milza e tirarlo fuori dal corpo. Il pancreas verrà allegato alla milza. Stendere il pancreas con una st bagnatoerile Q-tip e individuare la coda del pancreas.
   8. Fornire l'iniezione di 50 ml nella coda del pancreas, lasciare l'ago dentro per 10 secondi e ruotare lentamente l'ago del pancreas. Un impianto di successo sarà simile a una bolla superficiale, senza perdite.
   9. Ritorno il pancreas e la milza alla cavità peritoneale. In primo luogo racchiudere il muscolo e quindi racchiudere la pelle separatamente. Utilizzare una sutura 6-0 o fiocco per chiudere l'incisione. Per evitare il dolore negli animali, amministrare ketoprofene per via sottocutanea (SC) (5 mg / kg) oltre 24 ore. In alternativa, amministrare buprenorfina sc (0,05 - 0,1 mg / kg) ogni 12 ore in un periodo di 36 ore.
   10. Recuperare l'animale dall'anestesia e restituirlo alla sua gabbia. monitorare anche per il dolore. Gli animali devono essere dotati di sollievo dal dolore al momento della (o anche prima - preventiva) un intervento chirurgico. sollievo dal dolore supplementare deve essere fornita agli animali che soffrono di dolore in base alla IACCUC-protocollo o come prescritto dal altendente veterinario o designato.
6. Imaging in vivo
   Nota: la cattura immagine è stata effettuata utilizzando un sistema di imaging commerciale dotato di una camera oscura ei filtri adeguati per l'imaging GFP. acquisizione delle immagini è stato realizzato con una telecamera CCD e un sistema ottico composto da lenti intercambiabili di eccitazione / emissione (eccitazione: 455-495 nm di emissione: 513-557 nm). immagini in campo chiaro sono stati catturati senza un filtro 1 x 1 binning per ogni punto di tempo. Eccitazione di GFP utilizzata una sorgente di luce multispettrale allo xeno. Gli animali sono stati mantenuti in anestesia durante il processo di imaging collegando la macchina anestesia per un collettore anestesia gas integrato nella camera oscura del sistema di imaging.
   1. Anestetizzare l'animale come indicato nel 1.5.2. Una maschera anestesia è all'interno della camera oscura del sistema di imaging commerciale al fine di mantenere l'animale in anestesia durante l'imagingProcesso.
   2. Impostare i corretti filtri eccitazione e di emissione.
   3. Iniziare ottenendo un'immagine iniziale utilizzando solo la luce bianca. Mantenere la stessa posizione dell'animale per tutta la sessione di imaging e passare ai filtri GFP prendere una seconda immagine.
   4. Per ottenere i migliori risultati si sovrappongono due immagini. Analizzare l'immagine per l'area fluorescenti e intensità.

Risultati

Il metodo descrive un impianto ortotopico chirurgica delle cellule tumorali pancreatiche umane fluorescenti, concentrandosi sulla preparazione della sospensione cellulare iniettabile, anestesia adeguata per roditori, la consegna di sospensione cellulare tramite laparotomia, e l'uso di fluorescenza in vivo piccola dell'imaging animali. Il rilevamento di un segnale verde di fluorescenza (segnale GFP) tra due e tre settimane dopo l'impianto, fornisce ai ricercatori un s...

Discussione

Descriviamo un modello murino ortotopico di cancro pancreatico che esprime GFP, consentendo così il monitoraggio non invasivo della crescita tumorale mediante intero corpo imaging fluorescente vivo (Figura 1). Questa tecnica permette di monitorare lo sviluppo del tumore in tempo reale (figura 3); può essere uno strumento importante per i ricercatori di studiare l'efficacia terapeutica dei nuovi farmaci contro il cancro al pancreas. Un altro aspetto importante di ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI media 1640	Caisson Labs	RPL03-500ML
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-077
Penicillin Streptomycin	Thermo Ficher Sci	15140-122
Matrigel HC	Corning	354248
SutureVet PGA 6-0 PGA	Henry Schein	39010
Alcare or Foamed Antiseptic Handrub	Steris	639680
DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline)	Thermo Ficher Sci	21300025
TB Syringe 27G1/2	Becton Dickinson	305620
Isoflurane	Blutler Schein	50562
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health
Surgical Scissors, 5.5"straight mayo	Henry Schein	22-1600
PANC-1 GFP cell line	Anticancer, Inc
Small Animal Imaging System:
iBOx Scientia, UVP :	UVP, LLC  Upland, CA.	Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals