Pankreas Kanseri Floresan Ortotopik Fare Modeli

Özet

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Özet

Pankreas kanseri sağkalım son birkaç on yıl içinde önemli ölçüde artmadı hangi kanser biridir. Sadece tanısı alan hastaların% 7'si beş yıldan daha uzun yaşayacak. anlamak ve pankreas tümörlerinin mikro-taklit etmek için, gerçek zamanlı olarak, tümör ilerlemesinin invazif olmayan görüntüleme sağlar pankreas kanseri bir murin ortotopik bir model kullanılabilir. Yeşil floresan proteini (Panc-1 GFP) ifade Pankreas kanseri hücrelerinin (örneğin, Matrigel HC) serumsuz ortam ile ve daha sonra hastaya da pankreas kuyruk enjekte bazal membran matrisi yüksek konsantrasyon içinde süspansiyon haline getirildi. bu sırada oda sıcaklığına ulaştıktan sonra yüksek konsantrasyonda bazal membran matris içinde hücre süspansiyonu, jel benzeri bir madde olur; Enjeksiyon bölgesinde bir sızdırmazlık oluşturmak ve herhangi bir hücre sızıntısını önlemek, pankreas ile temas, bu nedenle, bu jelleri. diğer organlara tümör büyümesi ve metastaz canlı izlenirfloresan kullanılarak hayvanlar. GFP uyarma ve emisyon için uygun bir filtre kullanımı için çok önemlidir. Araştırmacılar kolayca çıplak farelerde prosedürü çoğaltmak böylece ortotopik implantasyon için adımlar Bu makalede ayrıntılı olarak verilmiştir. Bu protokol ana adımları in vivo görüntüleme hücre süspansiyonu hazırlanması, cerrahi implantasyon ve tüm vücut floresan. Bu ortotopik model, primer ve metastatik tümörler üzerinde yeni tedavilerin etkinliğini araştırmak üzere tasarlanmıştır.

Giriş

Pankreas kanseri, diğer kanserler göre artan sıklıkta tanı ve ABD'de kansere bağlı ölümlerin ^4. önde gelen nedenidir edilir. Tanı zaman, hastaların% 90 üzerinde beş yıl ^1,2 içinde ölmektedir. Şu anda, cerrahi tümör çıkarılması pankreas kanseri için tek çare olduğunu, ancak hastaların% 20 den az, çünkü hastalığın ileri bir aşamada olduğunu ve ^3,4 metastas yapmış tanı anında başta ameliyat için uygundur. spesifik semptomların olmaması pankreas kanseri sessiz hastalık yapar; bazı belirtilerin karın ağrısı, sırt ağrısı, iştahsızlık, sarılık ve bulantı kaybı arasında; hangi kolayca ortak sindirim hastalıkları ⁴ olarak yorumlanabilir. Bu nedenle, pankreas kanseri tanı ve tedavisinde yardımcı olmak için yeni farmakolojik araçlar geliştirmek önemlidir.

hayvan modellerin kullanımı Pankreas biyolojisinin anlaşılmasında bize izin veriratic kanseri ve insanlara bu bilgiyi uygulayarak içine bir bakış açısı sağlar. Tümörler köken ⁵ organ büyümesi nedeniyle pankreas kanseri ksenograft ortotopik modelleri, gerçekçi. Hücre çizgileri veya tümör fragmanları deri altından implante heterotopik modelleri, aksine, ortotopik modelleme çevresi ⁶ tümörün mikro ve taklit tümör hücrelerinin etkileşimini dinlenme sağlar. Burada açıklanan ksenograft modeli, genetik olarak, yeşil floresan proteini (GFP) ifade etmek üzere geliştirilen insan pankreas kanseri hücre çizgisi Panc-1 GFP ile ilgili tümörleri gelmektedir. GFP algılama non-invazif görüntüleme ve tümör büyümesi ve metastaz ⁷ izlenmesi için olanak sağlar. Tümör gelişimi kendiliğinden hızla oluşur ve yakın insan pankreas kanser hastalarında ⁸ birincil tümörlerin benzemektedir. Ortotopik model ise, terapötik maddeler karşılık olarak ilaç etkinliğinin daha doğru bir tahmintümör mikro taklit.

Yukarıda sözü edildiği gibi, bu hayvan modeli gerçek zamanlı olarak, tümör büyümesi ve metastazın flüoresan tespit edilmesine olanak sağlar. Floresan algılama lüminesans kıyasla daha doğrudan / canlı görüntüleme için izin verir. floresan ile yayılan ışık, bir kısa dalga boylu bir başka ışık tarafından uyarılmasının bir sonucu olduğu; ışıma oysa yayılan ışık bir kimyasal reaksiyon sonucu ve güçlü emisyon ⁹ olmayabilir. Ayrıca, in vivo flüoresan görüntüleme tüm vücut hayvana zararlı değildir ve araştırmacılar terapötik uygulamaya yanıt olarak, zaman içinde, tümör büyümesini izlemek için olanak sağlar.

Protokol

Aşağıda açıklanan protokol rehberlik ve Batı Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayı altında yürütülür. Bütün deneyler ilgili tüm kurallar, yönetmelik ve düzenleyici kurumlar ile uyumlu yapılmaktadır.

1. Hücre Kültürü

1. Komple ortam hazırlanması
   1. Sınıf biyolojik güvenlik kabini kullanılarak aseptik olarak RPMI medyum 500 ml'lik bir şişeye fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin streptomisin (P / S) eklenerek tam bir ortam hazırlar. dönen hafifçe karıştırın. Her bir ek nihai konsantrasyonu% 10 FBS ve% 1 P / S (hac / hac). Örneğin, 56 ml FBS ve 6 ml P / S ile medya 500 ml tamamlar.
   2. 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde tam orta yerleştirin.
2. Çözülme ve yayılan Hücreler
   1. sıvı azot PANC-1 GFP hücreleri alın. 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde yavaşça sallanarak şişe çözülme.
      Not:(- 3 dakika, yaklaşık 2) Çözülme hızlı olmalıdır.
   2. Etiket, T-75 şişeler, (a) hücre hattı adı, (B) geçiş sayısı, (c) güncel, ve (d) Araştırmacının baş ile birlikte kullanılmak üzere.
   3. Bir Biyogüvenlik kabini için% 70 etanol ve transfer flakon ile flakon silin.
   4. Hücreler yaymak 15 ml konik tüp tam orta 9.0 ml ekleyin. 1.0 ml pipet kullanarak dikkatli bir şekilde hücre süspansiyonu transferi ve tam ortam 9 ml asın.
   5. Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 125 x g'de santrifüjleyin. Bir biyogüvenlik kabini konik flakon transfer ve pelet bozmadan süpernatant aspire.
   6. hafifçe yukarı ve aşağı süspansiyon pipetleme taze tamamlanmış besiyeri 10 ml pelet askıya.
   7. Bir hemasitometre ile hücre sayımı 2.1 x 10 ⁶ hücre / şişe yoğunluğunda, T-75 şişelerinde bunları plaka. 37 ° C'de bir inkübatör içine yerleştirilir ve% 5 _CO2.
   8. gözle ve mikroskopla günlük hücreleri izleyin. grip iseyenileme gerekli id, aseptik şişesi tam büyüme ortamı aspire ve atın. Taze tam orta eşit miktarda ekleyin.
3. Hücreler yayılan
   1. Aseptik olarak şişesi bulunan ortamı çıkarın. hücreleri durulayın ve atmak için Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) içinde 5 ml.
   2. % 0.25 tripsin 3 ml ekleyerek şişeden hücreler ayırın. 5 ila 10 dakika boyunca 37 ° C'de tripsin ve% 5 _CO2 ihtiva eden bir şişeye inkübe edin.
   3. mikroskobu (10X büyütme) altında hücreleri gözlemleyin ve yuvarlak ve yerinden sağlamak.
   4. tam orta eşit hacimde ekleyerek tripsin nötralize ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme öbekler kırmak.
   5. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 1.2.7 belirtilen hücre yoğunluğunda yeni şişelere uygun hücre süspansiyonu hacmi aktarmak; son hacim şişesi başına 10 ml olacak şekilde yeterli taze medya ekleyin.
4. hücre SuspensEnjeksiyon için iyon Hazırlık
   Not: bazal membran matrisi yüksek konsantrasyonu, oda sıcaklığında katılaşan için, buz üzerinde tüm malzemeleri tutmak. gece boyunca dondurucuya tüm steril pipet uçları ve şişeleri yerleştirin ve süspansiyon üzerinde çalışırken buz üzerinde tutmak.
   1. buz üzerinde hiçbir katkı maddesi olmadan RPMI medya bir şişe tutun. Üreticinin talimatlarını takip ederek bazal membran matrisi, yüksek konsantrasyon, çözülme. Tercihen, küçük şişeleri içine kısım birden donma-çözülme döngüleri ¹⁰ önlemek için.
   2. Aspire Bütün şişeler ortam ve DPBS 5 ml ile yıkayın. 1.3.4 adıma bir önceki bölümünde tüm adımları tekrarlayın.
   3. Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 125 x g'de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj aktarın. Biyogüvenlik kabini konik flakon transfer ve DPBS 10 ml kullanılarak pelet yeniden askıya.
   4. Yavaşça pelet kırmaya yukarı ve aşağı süspansiyonu pipetle. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
   5. s belirtilen daha santrifüj1.4.3 TEP. Süpernatant aspire ve hücrelerin sayısına bağlı olarak, 50 ul bir hacmi içine 3 x 10 ⁶ hücre elde etmek için uygun bir seyreltici ekleyin. 1 (h / h) oranında bir seyreltici 1 serum barındırmayan ortam ve yüksek konsantrasyonu temel matris dokunun bir karışımı olacaktır.
   6. nazikçe süspansiyon vorteks ve her zaman buz üzerinde tutmak. Süspansiyon enjeksiyon için hazırdır.
5. cerrahi İmplantasyon
   Not: Tüm cerrahi malzemeler ve aletler steril olduğundan emin olun. Her zaman aseptik teknikler uygulayın.
   1. Masanın üzerinde bir ısıtma yastığı yerleştirin ve steril bir örtü ile kaplayın. Anestezi Makinenizi kurup tüm malzemeleri kol ulaşılabilecek olmasını sağlamak.
   2. Anestezi maskesi içine hayvanın burun yerleştirin ve oksijen 1 L / dk ve% 2.5 izofluran anestezi kurmak.
   3. Yavaşça iyot ile hayvanın kanadını fırçalayın ve% 70 etanol ile durulayın. üç kez tekrarlayın.
   4. onaylamakHayvan tamamen arka pençe kısma anestezi uygulandı. cevap görülmektedir eğer hayvan cerrahisi için tam anestezi ve hazırdır. Ancak, hayvan kaçınmaları halinde, buharlaştırıcı yeterli anestezi olmadığından emin ve hayvana anestezi altında tamamen gitmek için daha fazla zaman tanıyın.
   5. Yükü yaklaşık 18 G iğne ile bir 1.0 ml TB enjektöre hücre süspansiyonu 200 ul (daha önce soğutulmuş). 27 G iğne ile iğne değiştirin ve Kullanıma hazır olana kadar buz dönün.
   6. Dalağın genel alan (karnın sol üst kadran) bulun ve kullanan forseps o bölgenin üstünde cilt çimdik. cerrahi makas, yaklaşık 1.0 cm'lik bir kesi yapmak kullanarak bir cep oluşturmak için. Benzer şekilde, dalak üzerine düz kas tutam ve periton boşluğu erişmek için kesilmiştir.
   7. Yavaşça dalağın kaudal ucunu yakala ve vücudun dışına doğru çekin. Pankreas dalak eklenecektir. ıslak st kullanarak pankreas yaymakerile Q-tip pankreas kuyruk bulun ve.
   8. pankreas kuyruğunda içine 50 ul enjeksiyon sunun, 10 saniye boyunca içeride iğne bırakın ve yavaş yavaş pankreas dışına iğne döndürün. Başarılı bir implantasyon herhangi bir sızıntı olmadan yüzeysel balonu gibi görünecek.
   9. periton boşluğuna pankreas ve dalak geri dönün. İlk kas içine ve daha sonra ayrı ayrı cilt içine alın. insizyon kapatmak için 6-0 sütür veya zımba kullanın. Yönetici ketoprofen deri altından (SC) (5 mg / kg) 24 saat boyunca, bir hayvanda ağrı önlemek için. (- 0.1 mg / kg 0.05) 36 saatlik bir süre boyunca her 12 saat Seçenek olarak ise, buprenorfin sc verilmesi.
   10. anestezi hayvan kurtarmak ve kendi kafesine geri. Ayrıca ağrı için monitör. cerrahi - Hayvanlar (Rüçhan hatta önce) sırasında ağrı kesici sağlanmalıdır. Ek ağrı kesici de öngördüğü şekilde IACCUC-protokole göre veya ağrı hayvanlara sağlanmalıdırveteriner veya designee otlatırken.
6. İn vivo
   Not: Görüntü yakalama bir karanlık oda ve GFP görüntüleme için uygun filtreler ile donatılmış bir ticari bir görüntüleme sistemi kullanılarak yapıldı. (: -;: 513-557 nm emisyon 495 nm 455 uyarma) görüntü elde etme, bir CCD kamera ve değiştirilebilir uyarma / emisyon lensten oluşan bir optik sistem kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Parlak alan görüntüleri her zaman noktası için 1 x 1 binning bir filtre olmadan ele geçirildi. GFP Uyarma Xenon bantlı ışık kaynağı kullanılmıştır. Hayvanlar görüntüleme sisteminin karanlık odacıktan entegre bir gaz anestezi manifolduna anestezi makinesi bağlayarak görüntüleme işlemi boyunca anestezi altında muhafaza edilmiştir.
   1. 1.5.2 tarif edilen hayvan anestezisi. Bir anestezi maskesi görüntüleme sırasında anestezi altında hayvan tutmak için ticari görüntüleme sisteminin karanlık odanın iç olduğunusüreç.
   2. Doğru uyarma ve emisyon filtreleri ayarlayın.
   3. sadece beyaz ışık kullanarak bir başlangıç ​​görüntü alarak başlayın. görüntüleme oturum boyunca hayvanın aynı pozisyonda tutmak ve ikinci bir görüntü almak için GFP filtreler geçin.
   4. En iyi sonuçları her iki görüntüleri üst üste. Floresan alan ve yoğunluğu görüntüyü analiz.

Sonuçlar

Bu yöntem, enjeksiyon, kemirgenler için uygun anestezi laparotomi ile hücre süspansiyonu verilmesi için, hücre süspansiyonunun hazırlanması odaklanarak, floresan insan pankreas kanser hücrelerinin cerrahi ortotopik implantasyon tarif eder ve floresan in vitro küçük hayvan görüntüleme kullanımı. Iki ve üç hafta arasında bir yeşil floresan sinyali (GFP sinyali) implantasyon sonrası tespiti, gelişmekte olan pankreas kanseri tümörünün (Şekil 1)

Tartışmalar

Böylece in vivo floresan görüntüleme (Şekil 1) bütün vücudu kullanılarak tümör büyümesinin non-invaziv izleme sağlayan GFP ifade pankreas kanseri ortotopik fare modeli açıklanmaktadır. Bu teknik, gerçek zamanlı olarak tümör gelişimini izlemek için bize izin verir (Şekil 3); araştırmacıların pankreas kanserine karşı yeni ajanların etkinlikleri incelemek için önemli bir araç olabilir. Bu modelin bir diğer önemli yönü, GFP flöresanmm...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI media 1640	Caisson Labs	RPL03-500ML
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-077
Penicillin Streptomycin	Thermo Ficher Sci	15140-122
Matrigel HC	Corning	354248
SutureVet PGA 6-0 PGA	Henry Schein	39010
Alcare or Foamed Antiseptic Handrub	Steris	639680
DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline)	Thermo Ficher Sci	21300025
TB Syringe 27G1/2	Becton Dickinson	305620
Isoflurane	Blutler Schein	50562
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health
Surgical Scissors, 5.5"straight mayo	Henry Schein	22-1600
PANC-1 GFP cell line	Anticancer, Inc
Small Animal Imaging System:
iBOx Scientia, UVP :	UVP, LLC  Upland, CA.	Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals