Fluoreszierende orthotopen Mausmodell des Bauchspeicheldrüsenkrebs

Zusammenfassung

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Zusammenfassung

Bauchspeicheldrüsenkrebs bleibt eine der Krebsarten, für die das Überleben verbessert hat sich nicht wesentlich in den letzten Jahrzehnten. Nur 7% der diagnostizierten Patienten werden länger als fünf Jahre überleben. Um die Mikroumgebung von Tumoren der Bauchspeicheldrüse zu verstehen und nachzuahmen, verwendeten wir einen murinen orthotopen Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs, die in Echtzeit nicht-invasive Bildgebung von Tumorprogression ermöglicht. Bauchspeicheldrüsenkrebszellen exprimieren , grün fluoreszierendes Protein (GFP PANC-1) wurden in Basalmembran - Matrix, hoher Konzentration, ausgesetzt (zB Matrigel HC) mit serumfreiem Medium und dann in den Schwanz der Bauchspeicheldrüse durch Laparotomie injiziert. Die Zellsuspension in der hohen Konzentration Basalmembran-Matrix wird zu einer gelartigen Substanz, sobald es Raumtemperatur erreicht; daher geliert es, wenn es in Kontakt mit der Bauchspeicheldrüse kommt, um eine Dichtung an der Injektionsstelle zu schaffen und eine beliebige Zelle Auslaufen zu verhindern. Tumorwachstum und Metastasierung in andere Organe werden in lebenden wachtenTiere durch Fluoreszenz unter Verwendung. Es ist wichtig, die geeigneten Filter für die Anregung und Emission von GFP zu verwenden. Die Schritte für die orthotope Implantation sind in diesem Artikel beschrieben so Forscher leicht, das Verfahren in nackten Mäusen replizieren können. Die wesentlichen Schritte dieses Protokolls sind Herstellung der Zellsuspension, chirurgische Implantation, und der ganze Körper fluoreszierendes in vivo Bildgebung. Dieses orthotoper Modell ist entwickelt, um die Wirksamkeit neuer Therapeutika auf primären und metastatischen Tumoren zu untersuchen.

Einleitung

Bauchspeicheldrüsenkrebs ist mit einer erhöhten Frequenz im Vergleich zu anderen Krebsarten diagnostiziert und ist das ^4. häufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in den Vereinigten Staaten. Ab dem Zeitpunkt der Diagnose, über 90% der Patienten sterben innerhalb von fünf Jahren ^1,2. Derzeit ist die chirurgische Tumorentfernung die einzige Heilung für Bauchspeicheldrüsenkrebs, aber weniger als 20% der Patienten sind berechtigt , Chirurgie vor allem , weil zum Zeitpunkt der Diagnose zu unterziehen , die Krankheit in einem fortgeschrittenen Stadium und hat ^3,4 metastasiert. Der Mangel an spezifischen Symptome macht Bauchspeicheldrüsenkrebs eine stille Krankheit; einige der Symptome sind Bauchschmerzen, Rückenschmerzen, Appetitlosigkeit, Gelbsucht und Übelkeit; die als gemeinsame Verdauungskrankheiten werden kann ⁴ leicht zu interpretieren. Aus diesem Grund ist es wichtig, neue pharmakologische Werkzeuge zur Entwicklung in der Diagnose und Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs zu unterstützen.

Die Verwendung von Tiermodellen ermöglicht es uns, die Biologie der Pancré zu verstehenatic Krebs und bietet einen Einblick in dieses Wissen auf den Menschen anzuwenden. Xenograft orthotoper Modelle von Bauchspeicheldrüsenkrebs sind realistisch, da Tumoren im Ursprungsorgan ⁵ wachsen. Im Gegensatz zu heterotoper Modelle, in denen Zelllinien oder Tumorfragmente subkutan implantiert werden, ermöglicht orthotoper Modellierung für die Erholung der Tumor - Mikroumgebung und ahmt die Wechselwirkung von Tumorzellen mit ihrer Umgebung ^6. Das Xenograftmodell hier beschrieben leitet Tumoren aus der menschlichen Pankreas-Krebszelllinie PANC-1-GFP, die gentechnisch verändert ist das grün fluoreszierende Protein (GFP) zum Ausdruck bringen. GFP Detektion ermöglicht für eine nicht-invasive Abbildung und Überwachung von Tumorwachstum und Metastasierung ^7. Tumorentwicklung erfolgt schnell, spontan und sehr ähnlich , dass von primären Tumoren des menschlichen Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs ^8. Orthotope Modelle bieten eine genauere Vorhersage der Arzneimittelwirksamkeit in Reaktion auf therapeutische Mittel, währendNachahmen der Tumor-Mikroumgebung.

Wie oben erwähnt, ermöglicht dieses Tiermodell Fluoreszenz Nachweis von Tumorwachstum und Metastasierung in Echtzeit. Fluoreszenznachweis ermöglicht eine direkte / Live-Bildgebung zu Lumineszenz verglichen. Mit Fluoreszenz ist das emittierte Licht das Ergebnis einer Anregung durch ein anderes Licht einer kürzeren Wellenlänge; wohingegen in Lumineszenz, ist das emittierte Licht das Ergebnis einer chemischen Reaktion und nicht starke Emission ⁹ aufweisen. Weiterhin ist ganzen Körper in vivo Fluoreszenzabbildung für das Tier nicht nachteilig und ermöglicht es den Forschern Tumorwachstum über die Zeit in Reaktion auf therapeutische Behandlungen zu überwachen.

Protokoll

Das Protokoll weiter unten beschrieben wird, unter Anleitung und Genehmigung der Western University Animal Care und Verwenden Ausschuss ausgeführt. Alle Versuche werden unter Einhaltung aller einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden durchgeführt.

1. Zellkultur

1. Herstellung von Komplettmedium
   1. Mit einer Klasse-II-biologischen Sicherheitsschrank, bereiten komplettes Medium durch aseptisches Zugabe von fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin (P / S) in einen 500-ml-Flasche RPMI-Medium. Vorsichtig mischen durch Schwenken. Die Endkonzentration jedes Ergänzungsmittel ist 10% FBS und 1% P / S (v / v). Beispielsweise ergänzen 500 ml Medium mit 56 ml FBS und 6 ml P / S.
   2. Platzieren Komplettmedium in einem Wasserbad bei 37 ° C.
2. Auftauen und Propagierung von Zellen
   1. Abrufen PANC-1-GFP-Zellen aus flüssigem Stickstoff. Tauen Sie das Fläschchen durch vorsichtiges Schütteln in einem Wasserbad bei 37 ° C.
      Hinweis:Auftauen sollte schnell sein (ca. 2 - 3 min).
   2. Aufkleber-T-75-Flaschen verwendet werden mit (a) Zell-Linie Name, (b) Passage-Nummer, (c) das Datum und (d) Forscher Initialen.
   3. Wischen Sie das Fläschchen mit 70% Ethanol und Transfer Fläschchen zu einem Bio-Sicherheitsschrank.
   4. Um die Zellen zu propagieren, fügen 9,0 ml vollständigem Medium in ein 15 ml konischen Röhrchen. Unter Verwendung einer 1,0 ml Pipette vorsichtig die Zellsuspension und suspendieren es in 9 ml Vollmedium.
   5. Zentrifuge bei 125 × g für 8 min bei RT. Übertragen Sie die konische Fläschchen auf einem Bio-Sicherheitsschrank und den Überstand aspirieren, ohne das Pellet zu stören.
   6. Hängen Sie das Pellet in 10 ml frischem Komplettmedium durch sanft die Suspension bis Pipettieren und ab.
   7. Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer und Platte sie in T-75 - Kolben mit einer Dichte von 2,1 x 10 ⁶ Zellen / Kolben. Danach wird der Kolben in einen Inkubator bei 37 ° C und 5% CO _2.
   8. Überwachen Sie die Zellen täglich von Auge und unter dem Mikroskop. Wenn Grippeid Erneuerung erforderlich ist, aseptisch aspirieren die vollständige Wachstumsmedium aus dem Kolben und entsorgen. In gleichem Volumen von frischem Vollmedium.
3. Propagierung von Zellen
   1. Aseptisch entfernen Medium aus dem Kolben. 5 ml Dulbecco-Phosphatpuffer-Salzlösung (DPBS) Zellen zu spülen und zu verwerfen.
   2. Lösen sich die Zellen aus dem Kolben durch Zugabe von 3 ml 0,25% Trypsin. Inkubieren Kolben bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 5 bis 10 min , enthaltend Trypsin.
   3. Beobachten Zellen unter dem Mikroskop (10-facher Vergrößerung) und sicherzustellen, dass sie sind rund und verdrängt.
   4. Neutralisieren Trypsin durch ein gleiches Volumen von komplettem Medium Zugabe und brechen Klumpen durch vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten.
   5. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und übertragen die entsprechenden Zellsuspensionsvolumen an neue Kolben bei der Zelldichte in 1.2.7 erwähnt; fügen Sie genug frische Medien so das endgültige Volumen 10 ml pro Flasche ist.
4. Handy SuspensIonen-Injektionspräparat
   Hinweis: Da die Basalmembranmatrix, hohe Konzentration, bei RT erstarrt, halten alle Materialien auf dem Eis. Legen Sie alle sterilen Pipettenspitzen und Fläschchen in den Gefrierschrank über Nacht, und auf Eis halten, während auf der Aufhängung arbeiten.
   1. Halten Sie eine Flasche von RPMI-Medium ohne Zusätze auf Eis. Auftauen Basalmembranmatrix, hohe Konzentration, durch Anweisungen folgenden Herstellers. Vorzugsweise aliquoten in kleinere Fläschchen , um mehrere Gefrier-Auftau - Zyklen ¹⁰ zu vermeiden.
   2. Absaugen Medien aus allen Flaschen und spülen mit 5 ml DPBS. Wiederholen Sie alle Schritte auf dem letzten Abschnitt bis 1.3.4 zu treten.
   3. Übertragen Inhalt in einen 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugiert bei 125 g für 8 min bei RT. Übertragen konische Fläschchen auf die biologische Sicherheit Kabinett und erneut zu suspendieren Pellet mit 10 ml DPBS.
   4. Pipette vorsichtig die Suspension des Pellets aufzubrechen nach oben und unten. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
   5. Zentrifuge wieder wie in s skizzierttep 1.4.3. Überstand absaugen und in Abhängigkeit von der Anzahl der Zellen, fügen geeignete Verdünnungsmittel , um 3 x 10 ⁶ Zellen in einem Volumen von 50 & mgr; l. 1 (v / v) Verhältnis: Das Verdünnungsmittel wird in einer 1 ein Gemisch von serumfreien Medien und hohe Konzentration Keller Matrix Membran sein.
   6. Vortex die Suspension sanft und auf Eis halten zu allen Zeiten. Die Suspension ist jetzt bereit für die Injektion.
5. chirurgische Implantation
   Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Materialien und Instrumente sind steril. Üben Sie aseptische Techniken zu allen Zeiten.
   1. Legen Sie ein Heizkissen auf den Tisch und Deckel mit einem sterilen Tuch. Stellen Sie die Anästhesiegerät und sicherzustellen, alle Lieferungen in greifbarer Nähe sind.
   2. Legen Sie die Schnauze des Tieres in die Narkosemaske und eingerichtet, um die Anästhesie bis 1 l / min Sauerstoff und 2,5% Isofluran.
   3. Vorsichtig schrubben die Flanke des Tieres mit Jod und spülen mit 70% Ethanol. Dreimal wiederholen.
   4. Bestätige dasTier wird durch Einklemmen der Hinterpfote vollständig betäubt. Das Tier ist völlig betäubten und bereit für die Operation, wenn keine Antwort beobachtet wird. Wenn jedoch das Tier zuckt zusammen, gewährleisten eine ausreichende Anästhesie im Verdampfer ist und lassen Sie das Tier mehr Zeit vollständig unter Narkose zu gehen.
   5. Last etwa 200 & mgr; l der Zellsuspension in ein 1,0 ml TB-Spritze mit einer 18 G-Nadel (vorher abgekühlt). Ersetzen Sie die Nadel mit einer 27 G-Nadel und zurück zum Eis bis zum Gebrauch.
   6. Suchen Sie den allgemeinen Bereich der Milz (linken oberen Quadranten des Bauches) und mit einer Pinzette Drücken Sie die Haut an der Spitze dieser Region. Mit chirurgische Scheren einen Einschnitt machen von etwa 1,0 cm eine Tasche zu erstellen. In ähnlicher Weise eine Prise der glatten Muskulatur auf der Oberseite der Milz und durchgeschnitten, um die Bauchhöhle zu gelangen.
   7. greifen Sie vorsichtig das Schwanzende der Milz und ziehen Sie sie aus dem Körper heraus. Die Bauchspeicheldrüse wird die Milz angebracht werden. Verbreiten Sie die Bauchspeicheldrüse ein nasses st miterile Q-Tip und den Schwanz des Pankreas finden.
   8. die 50 & mgr; l Injektion in den Schwanz des Pankreas liefern, lassen Sie die Nadel innerhalb 10 Sekunden und drehen sich langsam die Nadel aus der Bauchspeicheldrüse. Eine erfolgreiche Implantation wird aussehen wie eine oberflächliche Blase ohne Leckagen.
   9. Rückkehr der Bauchspeicheldrüse und Milz in die Bauchhöhle. Zuerst die Muskeln umschließen und dann die Haut getrennt umschließen. Verwenden Sie einen 6-0 Naht oder Klammer den Schnitt zu schließen. Zur Vermeidung von Schmerzen im Tier, verabreichen Ketoprofen subkutan (SC) (5 mg / kg) über 24 Stunden. (- 0,1 mg / kg 0,05) alle 12 Stunden über einen 36 Stunden-Zeitraum Alternativ Buprenorphin sc verabreichen.
   10. Gewinnen Sie das Tier aus der Narkose und wieder in seinem Käfig. Auch für Schmerzen zu überwachen. Chirurgie - Die Tiere müssen mit der Schmerzlinderung bei der (präemptive oder sogar vor) zur Verfügung gestellt werden. Zusätzliche Schmerzlinderung müssen Tiere zur Verfügung gestellt werden, die Schmerzen nach IACCUC-Protokoll auftreten oder wie sie die vorgeschriebene beidazu neigt, Tierarzt oder designee.
6. In vivo Imaging
   Hinweis: Bildaufnahme wurde ein kommerzieller Bildsystem mit einer dunklen Kammer und den entsprechenden Filtern für GFP-Bildgebung ausgestattet unter Verwendung. Die Bildaufnahme wurde mit einer CCD-Kamera und ein optisches System durchgeführt, bestehend aus austauschbaren Anregungs- / Emissionslinsen (Anregung: 455 bis 495 nm; Emission: 513-557 nm). Hellfeldbilder wurden für jeden Zeitpunkt bei 1 x 1 Binning ohne Filter eingefangen. Die Anregung von GFP verwendet, um eine Xenon Multispektraldaten Lichtquelle. Die Tiere wurden unter Anästhesie während des gesamten Bilderzeugungsprozesses gehalten , indem die Anästhesiemaschine zu einem Gasverteiler Anästhesie in die dunkle Kammer des Abbildungssystems integriert verbindet.
   1. Anesthetize das Tier, wie in 1.5.2 beschrieben. Ein Narkosemaske ist im Inneren der kommerziellen dunklen Kammer des Bildgebungssystems, um das Tier unter Narkose während der Bildgebung zu haltenverarbeiten.
   2. Stellen Sie die richtigen Anregungs- und Emissionsfilter auf.
   3. Beginnen Sie, indem nur ein Anfangsbild mit weißem Licht zu erhalten. Halten Sie die gleiche Position des Tieres in der gesamten Imaging-Sitzung und wechseln Sie zu GFP Filter ein zweites Bild zu nehmen.
   4. Die besten Ergebnisse erzielen beide Bilder überlagern. Analysieren Sie das Bild für fluoreszierende Fläche und Intensität.

Ergebnisse

Dieses Verfahren beschreibt eine chirurgische orthotope Implantation von fluoreszierenden menschlichen Zellen Bauchspeicheldrüsenkrebs, bei der Herstellung der Zellsuspension zur Injektion, richtige Anästhesie für Nagetiere, Lieferung der Zellsuspension durch Laparotomie Fokussierung und die Verwendung von Fluoreszenz - in - vivo Kleintierbildgebung. Die Detektion eines grünen Fluoreszenzsignal (GFP - Signal) zwischen zwei und drei Wochen nach der Implantation, biet...

Diskussion

Wir beschreiben ein orthotoper murinen Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs , die GFP zum Ausdruck bringt, so dass nicht-invasive Überwachung des Tumorwachstums unter Verwendung von ganzen Körper in vivo Fluoreszenz - Bildgebung (Abbildung 1). Diese Technik ermöglicht es, die Tumor - Entwicklung in Echtzeit (Abbildung 3) zu überwachen; es kann ein wichtiges Instrument für die Forscher, die therapeutische Wirksamkeit von neuen Wirkstoffen gegen Bauchspeicheldrüsenkrebs zu ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI media 1640	Caisson Labs	RPL03-500ML
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-077
Penicillin Streptomycin	Thermo Ficher Sci	15140-122
Matrigel HC	Corning	354248
SutureVet PGA 6-0 PGA	Henry Schein	39010
Alcare or Foamed Antiseptic Handrub	Steris	639680
DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline)	Thermo Ficher Sci	21300025
TB Syringe 27G1/2	Becton Dickinson	305620
Isoflurane	Blutler Schein	50562
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health
Surgical Scissors, 5.5"straight mayo	Henry Schein	22-1600
PANC-1 GFP cell line	Anticancer, Inc
Small Animal Imaging System:
iBOx Scientia, UVP :	UVP, LLC  Upland, CA.	Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals