عالية الإنتاجية، متعدد صورة Cryohistology من تمعدن الأنسجة

Summary

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

Abstract

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

Introduction

وغالبا ما يتطلب الأبحاث البيولوجية phenotyping كفاءة، والتي كثيرا ما يرتبط مع بعض النوع من التحليل النسيجي ^1-3. وهذه الحاجة هي أكثر وضوحا مع المشاريع الطموحة لتعطيل كل جين في الماوس الجينوم ^4. ويمكن لهذه التحليلات النسيجية تتراوح من تقييم مورفولوجيا الخلايا و / أو الخصائص التشريحية للتعبير رسم خرائط جينات معينة أو البروتينات إلى الخلايا الفردية. في الواقع، واحدة من المساهمات الأساسية من الأنسجة في مجال علم الجينوم هو القدرة على ربط إشارة الجزيئية محددة لمنطقة أو خلية معينة نوع.

الطرق التقليدية في الأنسجة، وخاصة لأنسجة العضلات والعظام، وغالبا ما تكون مضيعة للوقت وشاقة، تتطلب أسابيع لإصلاح بعض الأحيان، ويزيل الكلس، القسم، وصمة عار، وصورة العينة ثم تحليل الصور عن طريق تفسير بشري. تحليل الإشارات الجزيئية متعددة، سواء عن طريق المناعية، في hybridizat الموقعيتطلب أيون، أو البقع الخاصة، مقاطع متعددة وحتى عينات متعددة لأداء مناسب. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الاستجابات متعددة لا يمكن أن يشترك في تتمركز في نفس الخلية، وأحيانا لا يمكن أن يشترك مترجمة إلى منطقة محددة ضمن عينة معينة. كما يتحرك علم الجينوم وepigenomics الملعب في العصر الرقمي، يجب مجال النسيجي أيضا أن تحذو حذوها لتوفير كفاءة والإنتاجية العالية، والتحليل الآلي من مجموعة متنوعة من العلامات الجزيئية في قسم النسيجي واحد.

في الواقع، هناك طلب لتحسين تقنيات النسيجية التي يمكن ربط الإشارات الجزيئية متعددة لخلايا معينة في عينة معينة. في الآونة الأخيرة، نشرنا طريقة cryohistological الإنتاجية العالية جديد لتقييم العديد من تدابير الاستجابة في قسم معين من الأنسجة المعدنية ^5-14. وتنطوي العملية على استقرار cryosection مع cryotape المجمدة، والتمسك قسم مسجلة بشكل صارم لشريحة المجهر، وإجراء عدة جولات من تلطيخ والتصوير على كل قسم. ثم يتم محاذاة هذه الجولات من الصور يدويا أو عن طريق أتمتة الكمبيوتر قبل تحليل الصور (الشكل 1). هنا، نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لهذه العملية وتقديم أمثلة حيث تحسنت هذه التقنيات فهمنا من العمليات البيولوجية المختلفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وافقت جامعة جنة رعاية الحيوانات المؤسسي واستخدام مركز الصحة كونيتيكت جميع الإجراءات الحيوانية.

1. التثبيت وتضمينها

1. الموت ببطء الحيوان عبر CO ₂ الخنق أو طرق أخرى معتمدة.
2. حصاد الأنسجة من الاهتمام (على سبيل المثال، أطرافهم، فقرات، الخ) ووضعه في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة في 4 درجات مئوية حتى الثابتة بشكل صحيح. عناية خاصة للحفاظ على وضع تشريحي ثابت قبل التثبيت. على سبيل المثال، وتحديد أطرافه مع المفاصل في انثناء ثابت، والتناوب الداخلي، والدوران الخارجي زوايا ^11. عادة، وتحديد أطرافه الماوس كاملة ل1-3 أيام.
   تحذير: الفورمالين غير سامة، ويجب أن يتم التعامل معها في غطاء الدخان في حين ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
   ملاحظة: الإطار الزمني لتثبيت يعتمد على حجم العينة. إذا سمحت التجربة، وقطع مفتوحة عظم شأنها تحسين تثبيت للمقصورة نخاع.قد تتطلب بعض العينات نضح تثبيت ¹⁵ للحد من الخلفية الفلورسنت (على سبيل المثال، إشارات الفلورسنت باهتة داخل نخاع العظام).
3. نقل العينات المأخوذة من الفورمالين إلى 30٪ سكروز المحرز في برنامج تلفزيوني 1X واحتضان لمدة 12-24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: بمجرد المحتضنة لمدة 12-24 ساعة، ويمكن بعد ذلك أن توضع العينات في -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. ينصح بهذا الأسلوب لتخزين التجارب التي الباحثين تنوي تضمين عينات متعددة في نفس الكتلة ولكن قد لا يحصد كل من هذه العينات في نفس الوقت (على سبيل المثال، والتجارب مع نقاط زمنية متعددة).
4. إزالة عينات من السكروز وتشريح بعيدا أي نوع من الأنسجة الزائدة.
5. ملء cryomold (حجم القالب يعتمد على حجم العينة) جزء من الطريق مع البرد تضمينها المتوسطة. وضع العينة في القالب بحيث قطع الطائرة لمنطقة الفائدة موازية مع الجزء السفلي من القالب.
   ملاحظة: مثال على وضع الأنسجة محددة والتوجهيمكن العثور عليها في الشكل 2A - B.
6. وضع cryomold على قطعة من الثلج الجاف حتى طبقة رقيقة من البرد تضمين تجميد المتوسطة، وبعد ذلك يحدد العينة في المكان. ملء حجم المتبقية من cryomold مع البرد تضمينها المتوسطة مع الحفاظ على cryomold على بيليه الثلج الجاف.
7. وضع cryomold في وعاء يحتوي على 2-ميثيل بيوتان قبل فتور من قبل الثلج الجاف. مرة واحدة يتم تجميد العينات تماما، وإزالة cryomolds والتخلص من فائض 2-ميثيل بيوتان. التفاف cryomolds في السيلوفان وضعها في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية الثلاجة لمدة التخزين.
   ملاحظة: يمكن أن عينات تجف مع مرور الوقت عند تخزينها في البرد تضمين المتوسطة، وخاصة في -20 درجة مئوية. نوصي تخزين العينات لمدة أطول من 1-2 أشهر في البرد تضمين المتوسطة في -80 درجة مئوية أو 30٪ سكروز في -80 درجة مئوية (راجع الخطوة 1.3).

2. استقرت الشريط الأنسجة باجتزاء

1. إزالة كتل عينة من الثلاجة ووضعها في cryostaر مع درجة حرارة يقع بين -20 و -25 درجة مئوية.
2. إزالة كتلة من cryomold وتقليم بعيدا البرد الزائد تضمين المتوسطة بشفرة حلاقة.
3. وضع بعض البرد تضمين المتوسطة على القرص العينة ثم محاذاة كتلة هذا أن سطح القرص عينة موازية للسطح السفلي من كتلة وبالتالي تأسيس الطائرة القطع المناسبة للمنطقة من الفائدة.
4. ضع القرص العينة في ناظم البرد والسماح للالبرد تضمين المتوسطة لتجميد.
5. ضع القرص عينة على رأس عينة وضبط الرأس مثل أن التخفيضات شفرة موازية لسطح كتلة العينة.
6. تقليم كتلة أسفل إلى مستوى داخل المنطقة من الفائدة وتهوين أي حلاقات من سطح الكتلة.
7. قطع قطعة من cryotape كبيرة بما يكفي لتغطية المنطقة من اهتمام وقبل البرد في ناظم البرد.
   ملاحظة: يمكن خفض قطع متعددة من أحجام متناسقة وتخزينها داخل cryostفي خلال باجتزاء.
8. إزالة الدعم غير ملتصقة من cryotape من خلال استيعاب الشريط بواسطة علامات التبويب غير لزجة الفضة / الذهب باستخدام ملقط ثم وضع الشريط على كتلة الجانب زجة باستمرار.
9. ممارسة الضغط على لcryotape باستخدام الأسطوانة (الشكل 2C).
10. جعل القسم (5-8 ميكرون) باستخدام المحرك التلقائي أو اليدوي قطع عجلة من ناظم البرد.
    ملاحظة: ومن الممارسات الجيدة لعقد حافة cryotape كما أنه يأتي على خشبة المسرح مثل أن القسم لا تسقط من على خشبة المسرح خلال باجتزاء (الشكل 2D).
11. وضع الجانب قسم الأنسجة حتى على شريحة المجهر بلاستيكية داخل ناظم البرد.
12. إزالة الشريحة البلاستيكية من ناظم البرد والسماح للالبرد تضمين المتوسط ​​وتذوب مثل أن القسم تتمسك سطح الشريحة.
13. كرر باجتزاء لمسلسل أقسام أو مناطق أخرى من الفائدة.
14. الانتهاء مرة واحدة، وتخزين المقاطع في مربع الشرائح لر 4 -20 أو -80 درجة مئوية تبعا لطول التخزين المطلوبة وتدابير الاستجابة المصب. على سبيل المثال، استخدام الشرائح التي سوف تكون ملطخة عن النشاط الأنزيمي (انظر 5،2-5،3) في غضون شهر إذا المخزنة في 4 درجات مئوية.

3. التصاق أقسام لمجهر الشرائح

1. الأشعة فوق البنفسجية يمكن علاجها طريقة اللصق.
   1. تسمية شريحة المجهر.
      ملاحظة: للحصول على زيادة التشغيل الآلي، والعينات والشرائح يمكن أن توصف مع الباركود.
   2. تطبيق قطرة من مادة لاصقة البصرية تنشيط للأشعة فوق البنفسجية لمدة الشرائح الزجاجية واستخدام حافة شريحة بلاستيكية لانتشار طبقة رقيقة من مادة لاصقة على سطح الشرائح الزجاجية.
   3. قطع التبويب الفضة / الذهب ووضع الجانب قسم الأنسجة مسجلة حتى على لاصق من الشريحة الأولى. تطبيق القسم في حركة متجددة من حافة واحدة إلى أخرى من أجل التقليل من تشكيل فقاعات شرك تحت الشريط.
      ملاحظة: يتم استخدام الشريحة الأولى إلى ما قبل الرطب السفلي من ركان الشريط قبل وضعه على الثانية شريحة (دائمة) (الخطوة 3.1.4).
   4. إزالة المقطع مسجلة من الشريحة الأولى ووضعه على طبقة لاصقة من الشريحة الثانية (الشكل 3A). مرة أخرى، واتخاذ الحذر لتجنب الوقوع في الشرك من الفقاعات.
      ملاحظة: هذه الخطوة يأخذ الممارسة لإتقان.
   5. مرة واحدة يتم وضع عدد مناسب من المقاطع لتجربة معينة على كل شريحة، تمحو لاصقة الزائد من المناطق المحيطة بها.
   6. تفقد كل قسم عن كثب بحثا عن فقاعات أو الألياف تحت الشريط. تنفيذ هذا التفتيش تحت المجهر أو العدسة المكبرة. إذا كانت هناك عوائق، وإزالة القسم الفردي، وإزالة العوائق، ومن ثم تطبيق ذلك على شريحة زجاجية.
   7. مرة واحدة يتم تحديد أن عدم وجود عوائق في إطار الأبواب مسجلة، وضع شرائح المجهر تحت ضوء أسود للأشعة فوق البنفسجية ل5-10 دقيقة لتشعبي لاصقة.
2. طريقة اللصق الشيتوزان.
   1. إعداد عشره 1٪ لاصقة الشيتوزان. تحضير محلول حمض الخليك عن طريق إذابة 0.25 مل من حمض الخليك المركز في 100 مل من الماء DI (0.25٪ ت / ت). حل 1 غرام من مسحوق الشيتوزان في 100 مل من محلول حمض الخليك وتحريك يا حل / N أو حتى يذوب كل مسحوق الشيتوزان.
      ملاحظة: الحل هو مستقر في RT.
   2. إيداع قطرة من حل الشيتوزان لكل قسم التي سيتم وضعها على الشريحة.
   3. قطع التبويب الفضة / الذهب من الشريط ووضع كل جانب الأنسجة قسم مسجلة حتى على لاصق (الشكل 3A). استخدام عناية كبيرة لتجنب الوقوع في الشرك من الفقاعات.
   4. متى وضعت كل أقسام على الشريحة، إمالة الشريحة أعلى على أحد أطرافها طويلة وسحب الشيتوزان المفرط إلى الحافة السفلية باستخدام ملقط.
   5. وضع الشرائح في هذا التوجه على رأس منشفة ورقية في صندوق الشرائح. والجاذبية تسبب ثم الشيتوزان الزائد لتسقط على منشفة، مما أسفر عن طبقة مسطحة وموحدة من الشيتوزان.
   6. جيش التحرير الشعبى الصينىم مربع الشرائح مع غطائه مسنود مفتوحة في الثلاجة يا / N للسماح للالشيتوزان لتجف.
      ملاحظة: انظر الجدول 1 للاطلاع على مقارنة بين طريقتين لاصقة.

4. تطبيق علامات الإشارة إلى الشرائح

1. إعداد مرجعية الحل علامة عن طريق تذويب 50 ميكرولتر من الأخضر و50 ميكرولتر من المجهرية الحمراء في 100 ميكرولتر من المياه. تخزين الحل في الظلام عند 4 درجات مئوية.
2. وضع 10 ميكرولتر أو 20 ميكرولتر طرف الماصة في حل microsphere. إضافة قطرة صغيرة من الحل microsphere إلى كل قسم المتاخمة لمنطقة الفائدة (الشكل 3C). كن حذرا حتى لا تحصل المجهرية داخل المنطقة من الفائدة.
3. تجفيف الشرائح في RT (محمية من الضوء) لمدة 30 دقيقة إذا تجهيز الشرائح في ذلك اليوم. إذا لم يكن كذلك، وضع الشرائح في مربع الشريحة في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: ما دام الحل microsphere يجف قبل ترطيب الشرائح، وميلستبقى crospheres الالتزام بها الشرائح خلال جولات متعددة من تلطيخ / التصوير.

5. جولات متعددة من تلطيخ

ملاحظة: عن طريق اختيار تسلسل متوافق من التصوير، والتلوين، والخطوات reimaging، فمن الممكن للكشف عن وشارك في توطين العديد من الإشارات البيولوجية على قسم الأنسجة نفسه. كل جولة من التصوير / تلطيخ / reimaging لابد من تطويرها لمسألة النسيجي معين. يتضمن تسلسل التصوير / تلطيخ / reimaging عادة الحصول على إشارات الفلورسنت الذاتية (على سبيل المثال، GFP الخلوي، والأصباغ تمعدن في الجسم الحي تحقيقات التصوير) في الجولة الأولى من التصوير تليها المناعية المضاعفة الفلورسنت وجولات متعددة من البقع النشاط الأنزيمية. وأخيرا، فإن القسم يمكن أن تكون ملطخة باستخدام الأصباغ اللونية (على سبيل المثال، H & E، طولويدين الأزرق، سفرانين O، الخ) لتسليط الضوء على بنية الأنسجة. عرض في هذا القسم هي طرق مخصصة مقتبس منالبروتوكولات المتاحة تجاريا.

1. Calcein تلطيخ الأزرق للالمعدنية المتراكمة
   ملاحظة: Calcein تلطيخ الأزرق ينتج سطح معدني ثابت وهذا هو قابلة للتحليل الصور الآلي خلافا الساحة المظلمة أو تفاضلي تدخل النقيض (DIC) التصوير. مشكلة مع تلطيخ الأزرق calcein هي أن الطيف الفلورسنت يتداخل مع التتراسيكلين ووضع العلامات الديميكلوسيكلين. ولذلك، إذا كانت العينة تحتوي هذه التسميات المعدنية، صورة التسميات في الجولة الأولى من التصوير قبل تلطيخ مع calcein الأزرق.
   1. إذا التقط إشارات الذاتية داخل أنسجة قبل هذه الخطوة تلطيخ، غمر الشرائح من الجولة التصوير سابقة في جرة coplin مليئة 1XPBS حتى تسقط زلات غطاء بعيدا عن الشرائح. إزالة وتجفيف زلات الغطاء.
   2. إعداد 30 ملغ / مل من calcein حل الأزرق في 2٪ NaHCO ₃ (الذي أدلى به حل ز 2 NaHCO ₃ في 100 H ₂ O مل وضبطجي لدرجة الحموضة 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك). قسامة وتخزين الحل في -20 درجة مئوية.
   3. تزج الشرائح في جرة coplin التي تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة على ترطيب أقسام، إن لم يكن رطب بالفعل من الجولة السابقة.
   4. إزالة الشرائح وتجفيف الظهر وحواف مع منشفة ورقية.
   5. تطبيق 100-500 ميكرولتر من محلول أزرق calcein لكل شريحة واحتضان لمدة 10 دقيقة في غرفة الرطوبة في RT.
   6. شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة مع 3 تغييرات.
   7. تطبيق ~ 200 ميكرولتر من 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني 1X إلى كل شريحة وجبل انزلاق الغطاء.
   8. إزالة الجلسرين الزائد وتجف أسفل الشرائح.
2. مقاومة للطرطرات حمض الفوسفاتيز (TRAP) تلطيخ النشاط الأنزيمي
   وأعرب عن TRAP من أنواع خلايا متعددة في النسب المكونة للدم بما في ذلك الخلايا الآكلة: ملاحظة. تلطيخ TRAP المعروضة هنا يستخدم الصفراء الفلورسنت الركيزة حمض الفوسفاتيز. وإشارات الفلورسنت بعض اوفerlap مع مجموعة فلتر الأصفر مخصصة بما في ذلك التتراسيكلين / تسميات ديميكلوسيكلين تمعدن، calcein وصمة عار الأزرق، ودابي مباين.
   1. غمر الشرائح من الجولة التصوير سابقة في جرة coplin مليئة برنامج تلفزيوني 1X حتى تسقط زلات غطاء بعيدا عن الشرائح. إزالة وتجفيف زلات الغطاء.
   2. إعداد العازلة 1 عن طريق إذابة 9.2 غرام من الصوديوم اللامائية خلات و 11.4 غرام من طرطرات الصوديوم ثنائي القاعدة ثنائي الهيدرات في الماء ويصل الحجم النهائي إلى 1000 مل. ضبط درجة الحموضة إلى 4.2 مع حمض الخليك الجليدية المركزة (~ 1،5-2 مل). تخزين الحل في 4 ° مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
   3. إعداد العازلة 2 عن طريق إذابة 40 ملغ من نتريت الصوديوم في المياه ويصل الحجم النهائي إلى 1 مل. تخزين الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
   4. في يوم تلطيخ، وإعداد رد فعل العازلة عن طريق خلط 7.5 مل من العازلة 1 و 150 ميكرولتر من العازلة 2.
   5. تطبيق عازلة رد فعل دون الركيزة إلى الشريحةالصورة عن 10-15 دقيقة للتوازن الأنسجة في الرقم الهيدروجيني أقل.
      ملاحظة: حجم النموذجي هو ~ 200 ميكرولتر ولكن يحتاج إلى أن تكون كبيرة بما يكفي لتغطية جميع الأقسام.
   6. تمييع الصفراء الفلورسنت الركيزة حمض الفوسفاتيز بين 01:50 و 1: 100 في المخزن المؤقت رد فعل.
      سيتم تمليها التخفيف من النشاط TRAP ضمن العينة: ملاحظة.
   7. صب رد فعل العازلة الخروج من الشرائح وتطبيق رد فعل العازلة مع الركيزة الفلورسنت الصفراء على الشرائح.
   8. ضع الشرائح تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية الأسود ل~ 5 دقائق لتنشيط الركيزة.
      قد تختلف فترة حضانة اعتمادا على النشاط TRAP ضمن العينة: ملاحظة.
   9. شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة مع 3 تغييرات.
   10. تطبيق ~ 200 ميكرولتر من 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني 1X إلى كل شريحة وجبل انزلاق الغطاء.
   11. إزالة الجلسرين الزائد وتجف أسفل الشرائح.
       ملاحظة: سوف المخزن المؤقت TRAP الحمضية يزيل الكلس الأقسام. فائدة إضافية من decalcificaنشوئها هو أن بعض الألوان سيكون متاحا مرة أخرى لتلطيخ المصب (على سبيل المثال، والعلامات تمعدن). على سبيل المثال، سيتم إزالة تلطيخ الأزرق calcein خلال تلطيخ TRAP. لذلك، دابي مباين يمكن تصوير في هذه القناة خلال جولة لاحقة.
3. الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) تلطيخ النشاط الأنزيمي
   ملاحظة: أنواع الخلايا متعددة تشارك مع تمعدن بما في ذلك الخلايا بانية العظم والتمعدن غضروفية تعبر عن AP. الركيزة الحمراء السريعة المستخدمة في هذا البروتوكول يثير على حد سواء الحمراء واللونية الإشارة الحمراء الفلورسنت. وبسبب هذا، فإن الركيزة اللونية إرواء إشارات الفلورسنت في المناطق التي ترسب الركيزة. ولذلك، فمن الأفضل أن تفعل هذا وصمة عار بعد تصوير إشارات الفلورسنت التي يمكن أن تطفئ من الركيزة AP.
   1. غمر الشرائح من الجولة التصوير سابقة في جرة coplin مليئة برنامج تلفزيوني 1X حتى تسقط زلات غطاء بعيدا عن الشرائح. ريمولقد وتجفيف زلات الغطاء.
   2. إعداد 1 M تريس عن طريق إذابة 12.1 غرام من تريس في 100 مل من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 9.5 مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
   3. إعداد 1 M MgCl ₂ هيدرات عن طريق إذابة 20.33 غرام من MgCl ₂ في 100 مل من الماء منزوع الأيونات.
   4. إعداد 2 M كلوريد الصوديوم عن طريق إذابة 11.68 جم كلوريد الصوديوم في 100 مل من الماء منزوع الأيونات.
   5. إعداد 100X (20 ملغ / مل) حل سهم سريع الأحمر TR الملح عن طريق إذابة مسحوق 1 غرام في 50 مل من الماء منزوع الأيونات. جعل 100 مكل ومخزن في -20 درجة مئوية.
   6. إعداد 100X (10 ملغ / مل) حل سهم الفوسفات نفثول AS-MX عن طريق إذابة مسحوق 500 ملغ في 50 مل من ن، ن ثنائي ميثيل الفورماميد. جعل 100 مكل ومخزن في -20 درجة مئوية.
   7. في يوم تلطيخ، وإعداد عازلة AP بإضافة 1 مل من 1 M تريس، 0.5 مل من 1 M MgCl _2، 0.5 مل من 2 M كلوريد الصوديوم وجلب الحجم النهائي إلى 10 مل باستخدام الماء منزوع الأيونات (تركيزات النهائي: 100 ملم تريس، 50 ملي MgCl _2، 100 مم كلوريد الصوديوم).
   8. وضع AP بuffer على كل شريحة واحتضان في غرفة الرطوبة لمدة 10 دقيقة في RT.
   9. إعداد عازلة الركيزة ا ف ب عن طريق تمييع 100X مخزونات سريع الأحمر TR الملح ونفثول AS-MX ل1x أخرى في المنطقة العازلة AP.
   10. صب عازلة AP الخروج من الشرائح واستبدالها مع عازلة AP الركيزة. احتضان الشرائح ل5-10 دقائق في غرفة الرطوبة في RT.
       سيتم تمليها فترة حضانة حسب النشاط AP العينة: ملاحظة.
   11. غسل الشرائح 3X في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   12. جبل غطاء ينزلق مع حل دابي counterstaining (1: 1000 تخفيف من دابي في 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني 1X).
4. طولويدين الأزرق O (السل) تلطيخ مولد اللون
   ملاحظة: لأن يتم تصوير جميع الخطوات السابقة في ظل تصاعد مائي مؤقت في 50٪ الجلسرين / حل برنامج تلفزيوني، وتصوير الخطوة اللونية أيضا في ظل ظروف المائية. ومع ذلك، فإن الحل تلطيخ قد تميل ليتش مع مرور الوقت. لذلك، يقترح لصورة الأزرق طولويدين في أقرب وقت ممكن بعد تلطيخ.
   1. غمر الشرائح من جولة التصوير سابقة في جرة coplin مملوءة بالماء منزوع الأيونات حتى تسقط زلات غطاء بعيدا عن الشرائح. إزالة وتجفيف زلات الغطاء.
   2. بعد إزالة زلات غطاء، مع استبدال الماء العذب واحتضان الشرائح لمدة 10 دقيقة على الأقل بحيث تتم إزالة الأملاح من برنامج تلفزيوني بشكل كاف من الأنسجة.
   3. يعد حل مرض السل 0.025٪ في الماء منزوع الأيونات.
   4. ضع الشرائح في حل السل عن 1-5 دقائق.
      ملاحظة: فترة حضانة يعتمد على تفضيل المستخدم ولكن يجب أن تبقى متناسقة عبر جميع العينات.
   5. مكان الشرائح في جرة coplin مع الشرائح المياه وغسل منزوع الأيونات 3X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   6. جبل تغطية زلة مع 30٪ الجلسرين المذاب في الماء منزوع الأيونات (وليس برنامج تلفزيوني 1X وهذا سوف يسبب وصمة عار ليتش الخروج من الأنسجة). ملاحظة: يمكن أن تكون بديلا الجلسرين المتوسطة المتزايدة مع شراب الفركتوز، مما يساعد على منع انتشار وصمة عار من الأنسجة. إلىتحضير شراب الفركتوز، حل 30 غراما من الفركتوز في 10 مل من الماء منزوع الأيونات والحرارة إلى 60 درجة مئوية حتى يذوب.

6. جولات متعددة من التصوير

1. تحميل الشرائح في الأدراج المجهر (الشكل 3D).
   ملاحظة: صواني هي الربيع المحملة.
2. إدراج الصواني في كومة علبة من المجهر مسح الشريحة (الشكل 3E).
3. انقر على صورة قائمة لتحميل الملف الشخصي لكل شريحة مع أوقات التعرض المناسبة لكل fluorophore. انقر على اسم الشريحة على سبيل المثال كل شريحة يدويا أو لديك برنامج قراءة الباركود المقدمة على التسمية الشريحة. انقر على زر بدء الفحص معاينة لالتقاط صورة معاينة الشريحة.
4. تعيين المناطق ذات الاهتمام في المعالج كشف الأنسجة وحفظها لجولات لاحقة من التصوير. مرة واحدة كل شريحة هي الإعداد، بدء عملية المسح الضوئي عن طريق النقر على زر البداية المسح الضوئي.
   ملاحظة: لا يمكن للنظام تعقد ما يصل إلى 100 سليدي في وقت واحد.
5. بمجرد الانتهاء من التصوير، وتصدير الصور من كل قناة والتصوير الجولة الفردية. TIF أو ملفات .JPG لتجميع الصور وتحليلها.

7. صورة الجمعية

1. الطريقة اليدوية باستخدام برنامج فوتوشوب (أو ما شابه ذلك برامج تحرير الصور قادرة على إنتاج صور الطبقات).
   1. فتح كل صورة قناة الفردية من كل جولة التصوير.
   2. تجميع الصور الفردية على هيئة طبقات في صورة واحدة مركبة. للقيام بذلك، انقر على طبقة في لوحة طبقة من صورة واحدة. ثم اسحب طبقة على صورة أخرى. وهذه عملية السحب والإسقاط خلق طبقة جديدة في الصورة. هل هذا لجميع الصور الأخرى. بدلا من ذلك، استخدام برنامج نصي (ملف> مخطوطات> تحميل الملفات إلى المكدس ...) لأتمتة هذه العملية عن طريق تحميل ملفات الصور متعددة على هيئة طبقات في كومة الصورة.
   3. مرة واحدة يتم سرد كل صورة كطبقة الفردية في صورة مركبة، انقر مرتين على اسم الطبقة لإعادة تسمية لاyers حسب الحاجة لتمييز قنوات مختلفة.
   4. من أجل أن نرى من خلال كل طبقة وخلق صورة مركبة حقا، تغيير وضع مزيج من أجل كل طبقة من "عادي" إلى "الشاشة" ضمن لوحة طبقة.
      ملاحظة: لتسريع هذه الخطوة، تغيير طبقة واحدة على الشاشة، ثم انقر بزر الماوس الأيمن على طبقة، حدد "نسخة نمط الطبقة"، ثم تسليط الضوء على جميع الطبقات الأخرى واختر "لصق نمط الطبقة" لتطبيق اسلوب شاشة إلى أخرى طبقات.
   5. إذا رغبت في ذلك، والحد من التعتيم (قيمة التغيير إلى 10-40٪) من الطبقة اللونية (أي طولويدين الأزرق) لتصور إشارات الفلورسنت أفضل من خلال طبقة اللونية.
      ملاحظة: مجهر المسح تجانب المستخدمة في هذا البروتوكول يحمل الشرائح في 3 الحواف، وبالتالي تقليل كمية الدوران التي يمكن أن تحدث إلى الشريحة خلال كل جولة من التصوير. وبالتالي، فمن الأسهل بكثير للمستخدم لمحاذاة الصور يدويا دون الحاجة إلى تدوير الصور المستمدةمن جولات مختلفة من التصوير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وسير العمل العام من أجل عالية الإنتاجية، متعدد صورة Cryohistology

يمثل الشكل 1 سير العمل عام يستخدم لوصف هذه التقنية. وهو يتضمن العديد من الخطوات من التثبيت من خلال عدة جولات من الت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا قدمنا ​​بروتوكول cryohistology مفصل للمشاركة في توطين وتحديد العديد من الإجراءات البيولوجية عن طريق مواءمة الصور من جولات متعددة من تلطيخ / التصوير في مقطع واحد. الطريقة الموضحة باستخدام cryotape يكون مفيدا بشكل خاص لأنها تحافظ على التشكل من الصعب قسم الأنسجة (على سبيل ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128-4L	Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378	Multiple suppliers available.
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Multiple suppliers available.
Cryomolds	Fisher Scientific	Fisherbrand #22-363-554	Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix	Thermo Scientific	6769006	Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane	Sigma Aldrich	M32631	Multiple suppliers available.
Cryostat	Leica Biosystems	3050s	Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc	Leica Biosystems	14037008587	Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades	Thermo Scientific	3051835	Can be substituted with other brands/models.
Cryotape	Section Lab	Cryofilm 2C
Roller	Electron Microscopy Sciences	62800-46	Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides	Electron Microscopy Sciences	71890-01	Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides	Thermo Scientific	3051	Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61	Norland Optical	Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light	General Electric	F15T8-BLB
Glacial acetic acid	Sigma Aldrich	ARK2183	Multiple suppliers available.
Chitosan	Sigma Aldrich	C3646	Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres	ThermoFisher Scientific	I-14787
InSpeck green microspheres	ThermoFisher Scientific	I-14785
Calcein Blue	Sigma Aldrich	M1255	Multiple suppliers available.
Calcein	Sigma Aldrich	C0875	Multiple suppliers available.
Alizarin complexone	Sigma Aldrich	A3882	Multiple suppliers available.
Demeclocycline	Sigma Aldrich	D6140	Multiple suppliers available.
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761	Multiple suppliers available.
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate	ThermoFisher Scientific	E-6588
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain)	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	R37108	Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous	Sigma Aldrich	S2889	Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate	Sigma Aldrich	T6521	Multiple suppliers available.
Sodium nitrite	Sigma Aldrich	S2252	Multiple suppliers available.
Tris	Sigma Aldrich	15504	Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate	Sigma Aldrich	M9272	Multiple suppliers available.
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt	Sigma Aldrich	F8764	Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX	Sigma Aldrich	N4875	Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide	Sigma Aldrich	D158550	Multiple suppliers available.
Toluidine blue O	Sigma Aldrich	T3260	Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1	Carl Zeiss AG	Axio Scan.Z1	Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set	Chroma Technology Corp.	49000
CFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49001
GFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49020
YFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set	Chroma Technology Corp.	custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set	Chroma Technology Corp.	49004
Cy5 Filter Set	Chroma Technology Corp.	49009
CryoJane Tape Transfer System	Electron Microscopy Sciences	62800-10	Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows	Electron Microscopy Sciences	62800-72	Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides	Electron Microscopy Sciences	62800-4X	Multiple suppliers available.