תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized

Summary

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

Abstract

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

Introduction

מחקר ביולוגי לעתים קרובות דורש phenotyping ביותר, אשר מזוהה לעתים קרובות עם איזשהו ניתוח היסטולוגית ^1-3. צורך זה בולט עוד יותר עם ​​פרויקטים שאפתניים לשבש כל גן של העכבר הגנום ^4. ניתוחים היסטולוגית אלו יכולים לנוע בין הערכת מורפולוגיה תאים ו / או תכונות אנטומיות לביטוי מיפוי של גנים ספציפיים או חלבונים בתאים בודדים. למעשה, אחת תרומות יסוד של היסטולוגיה לתחום הגנומיקה היא היכולת לקשר בין אות מולקולרית ספציפית לסוג באזור או תאים ספציפי.

שיטות מסורתיות של היסטולוגיה, במיוחד עבור רקמות שריר-שלד, הם בדרך כלל זמן רב ומייגע, מחייב לפעמים שבועות כדי לתקן, decalcify, סעיף, כתם, ותמונת הדגימה מכן לנתח את התמונות באמצעות פרשנות אנושית. ניתוח אותות מולקולריים מרובים, אם באמצעות אימונוהיסטוכימיה, באתרו hybridizatיון, או כתמים מיוחדים, דורשים סעיפים רבים, ואפילו דגימות מרובות לביצוע כראוי. בנוסף, מספר תגובות האפשריות אלה לא יכולים להיות שותף מקומי לאותו תא ולפעמים לא יכול להיות שותף מקומי לאזור מסוים בתוך דגימה נתונה. ככל שתחום גנומיקה epigenomics נע לתוך העידן הדיגיטלי, בתחום היסטולוגית חייב גם בעקבותיהם לספק תפוקה גבוהה ביותר, וניתוח אוטומטי של מגוון של אותות מולקולריים בתוך קטע היסטולוגית יחיד.

אכן, יש ביקוש עבור טכניקות היסטולוגית משופרות שיכול לשייך אותות מולקולריים מרובים תאים ספציפיים בתוך דגימה נתונה. לאחרונה, פרסמנו שיטת cryohistological תפוקה הגבוהה חדשה להערכת אמצעי מענה כמה בתוך קטע נתון מרקמות mineralized ^5-14. התהליך כרוך לייצוב cryosection עם cryotape הקפוא, דבקות בסעיף המודבק נוקשה לשקופית מיקרוסקופ, וניצוח מספר סבבי מכתים והדמיה על כל מקטע. הסיבובים האלה של תמונות אז מיושרים באופן ידני או באמצעות אוטומציה המחשב לפני ניתוח התמונה (איור 1). כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים של תהליך זה ולספק דוגמאות בהן טכניקות אלה שיפרו את הבנתנו של תהליכים ביולוגיים שונים.

Protocol

האוניברסיטה של ​​ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים מרכז בריאות קונטיקט ושימוש אישר את כל הנהלים בעלי חיים.

קיבוע 1. והטבעה

1. להרדימו באמצעות מחנק CO ₂ או שיטות מאושרות אחרות.
2. קציר את הרקמה של עניין (למשל, איבר, חוליות, וכו ') ומניחים 10% פורמלין נייטרלי שנאגרו על 4 מעלות צלזיוס עד שיתוקן כראוי. קח טיפול מיוחד כדי לשמור על מיקום האנטומי עקבי לפני הקיבוע. למשל, לתקן גפיים עם מפרקים על כיפוף עקבי, וסיבוב פנימי, וסיבוב חיצוני זוויות ^11. בדרך כלל, לתקן גפי עכבר שלמים 1 - 3 ימים.
   זהירות: פורמלין רעיל יש לטפל במנדף כשהוא לבוש בציוד מגן אישי מתאים.
   הערה: מסגרת הזמן של קיבעון תלוי בגודל של הדגימה. אם הניסוי מאפשר, חיתוך ופתח את העצם ישפר קיבעון של תא המוח.דגימות מסוימות עשויות לדרוש קיבעון זלוף ¹⁵ למזער רקע ניאון (למשל, אותות ניאון קלושים בתוך מח עצם).
3. העברת דגימות מן פורמלין 30% סוכרוז שנעשה 1x PBS ו דגירה במשך 12 - 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: לאחר וטופח במשך 12 - 24 שעות, דגימות אז יכולות להיות ממוקמות ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. שיטת אחסון זו מומלצת ניסויים שבהם החוקרים מתכוונים להטביע דוגמאות רבות באותו גוש אבל לא יכול לקצור את כל הדוגמאות להלן בעת ובעונה אחת (למשל, ניסויים עם נקודות זמן מרובים).
4. הסר דגימות מן סוכרוז לנתח משם כל רקמה עודפת.
5. ממלאים cryomold (גודל של עובש הוא תלוי בגודל הדגימה) חלק מהדרך עם קריו הטבעה בינוני. מניח מדגם עובש כך חיתוך מטוס עבור האזור של עניין מקביל עם החלק התחתון של התבנית.
   הערה: דוגמה למיקום רקמות ספציפיות והכיווןניתן למצוא באיור 2A - B.
6. מניח את cryomold על פיסת קרח יבש עד שכבה דקה של קופא בינוני הטבעת קריו ובהמשך מתקן הדגימה במקום. מלא את נפח הנותרים של cryomold עם קריו הטבעה בינוני תוך שמירה על cryomold על גלולת הקרח היבשה.
7. מניחים את cryomold במיכל המכיל מקורר-מראש בוטאן 2-מתיל ידי קרח יבש. לאחר דגימות קפואות לחלוטין, להסיר cryomolds ולהתנער 2-מתיל-בוטאן עודף. עוטפים בצלופן cryomolds ומניחים -20 ° C או -80 ° C במקפיא לאחסון.
   הערה: דוגמאות ניתן לייבש לאורך זמן כאשר הם מאוחסנים בינוני הטבעת קריו, במיוחד ב -20 ° C. אנו ממליצים אחסון של דגימות עבור יותר 1 - 2 חודשים קריו הטבעה בינוני ב -80 ° C או סוכרוז 30% ב -80 ° C (ראה שלב 1.3).

2. חתך רקמות Tape מיוצב

1. הסר בלוקים הדגימה מהמקפיא ומכניסים cryostat עם הטמפרטורה להגדיר בין -20 ו -25 מעלות צלזיוס.
2. הסר את הבלוק מן cryomold לקצץ משם קריו עודף הטבעה בינוני עם סכין גילוח.
3. מקום קצת בינוני הטבעה קריו על גבי דיסק הדגימה ולאחר מכן יישרתי את הבלוק כך את פני השטח של דיסק הדגימה מקביל למשטח התחתון של הבלוק ובכך הקמת מטוס החיתוך הנכון עבור האזור של עניין.
4. מניחים את הדיסק הדגימה ב cryostat ולאפשר עבור קריו הטבעה בינוני להקפיא.
5. מניח את הדיסק הדגים על ראשו הדגימה ולהתאים את הראש כך קיצוצי להב מקבילים אל פני השטח של בלוק הדגימה.
6. חתוך את הבלוק לרמה בתוך האזור של עניין לנער אותם שבבי מפני השטח של הבלוק.
7. חותכים חתיכה של cryotape גדול מספיק כדי לכסות את האזור של עניין צמרמורת מראש ב cryostat.
   הערה: חתיכות מרובות ניתן לחתוך בגדלים עקביים מאוחסנות בתוך cryostב במהלך חתך.
8. סור גיבוי לא חסיד מן cryotape ידי אחיזת הקלטת ידי הכרטיסיות לא דביק כסף / זהב באמצעות מלקחיים מכן למקם את הקלטת על הצד-הדביק לחסום למטה.
9. הפעל לחץ קל על cryotape באמצעות הגלגלת (איור 2 ג).
10. הפוך קטע (5 - 8 מיקרומטר) או באמצעות המנוע האוטומטי או גלגל חיתוך ידני של cryostat.
    הערה: זהו תרגול טוב כדי להחזיק את קצה cryotape כפי שהיא באה לבמה כך הסעיף אינו נופל מהבמה במהלך חתך (איור 2 ד).
11. הנח את צד רקמות סעיף עד בשקופית מיקרוסקופ פלסטיק בתוך cryostat.
12. להסיר את שקופית הפלסטיק מן cryostat ולאפשר מדיום הטבעת קריו להתמוסס כך בסעיף שומר על פני השקופית.
13. חזור חתך עבור קטעי סדרה או אזורים אחרים בעלי עניין.
14. בסיום, לאחסן את החלקים בתוך קופסת שקופיותt 4, -20 או -80 ° C בהתאם לאורך של האחסון הנדרשים ואת אמצעי המענה במורד הזרם. למשל, להשתמש בשקופיות כי הם הולכים להיות מוכתם עבור הפעילות האנזימטית (ראה 5.2 - 5.3) בתוך חודש אם מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס.

3. הדבקה של סעיפים כדי שקופיות מיקרוסקופ

1. UV- לריפוי שיטת דבק.
   1. לייבל שקופית מיקרוסקופ.
      הערה: ואוטומציה מוגברת, דוגמיות שקופיות יכולות להיות מתויגות עם ברקודים.
   2. החל ירידה של דבק אופטי מופעל UV לשתי שקופיות זכוכית ולהשתמש בקץ שקופית פלסטיק כדי להפיץ שכבה דקה של דבק על פני השטח של שקופיות הזכוכית.
   3. חותכים את הכרטיסייה כסף / זהב ולהניח בצד רקמות סעיף מודבק על הדבק של השקופית הראשונה. החל את הסעיף על תנועה סיבובית מקצה אחד לקצה השני כדי למזער את ההיווצרות של בועות בפח מתחת הקלטת.
      הערה: השקופית הראשונה משמשת טרום להרטיב את התחתון של tהוא הסרט לפני הצבתו בשקופית השנייה (הקבועה) (שלב 3.1.4).
   4. הסר את הקטע מוקלט מתוך השקופית הראשונה ולמקם אותו על שכבת הדבק של השקופית השנייה (איור 3 א). שוב, לטפל כדי למנוע הילכדות של בועות.
      הערה: שלב זה לוקח בפועל אמן.
   5. לאחר המספר המתאים של קטעים לניסוי הנתון מושם על כל שקופית, לקנח הדבק העודף מן האזורים הסמוכים.
   6. בדוק כל מקטע מקרוב על בועות או סיבים מתחת הקלטת. בצע בדיקה זו תחת זכוכית מיקרוסקופ או מגדלת. אם יש חסימות, להסיר את החלק הפרט, להסיר את החסימות, ולאחר מכן החל מחדש אותו לשקופית זכוכית.
   7. ברגע זה נקבע כי אין מכשולים על פי הסעיפים המודבקים, במקום שקופיות מיקרוסקופ תחת אור UV השחור עבור 5 - 10 דקות כדי crosslink הדבק.
2. שיטת דבק Chitosan.
   1. כן הe 1% דבק chitosan. כן פתרון חומצה אצטית על ידי המסת 0.25 מיליליטר של חומצה אצטית מרוכזת במי DI 100 מיליליטר (0.25% v / v). ממיסים 1 גרם של אבקת chitosan ב 100 מ"ל של תמיסת חומצה אצטית ומערבבים הפתרון O / N או עד שכל האבקה chitosan נמס.
      הערה: הפתרון הוא יציב ב RT.
   2. להפקיד ירידה של פתרון chitosan עבור כל מקטע שיונח בשקופית.
   3. חותך את כרטיסיית כסף / זהב של הקלטת ומניח בכל צד רקמות סעיף מודבק לעלות על (איור 3 א) הדבק. השתמש בזהירות רבה כדי למנוע מלכודת של בועות.
   4. לאחר שכל המקטעים ממוקמים בשקופית, להטות את השקף על אחד הקצוות הארוכים שלו ולגרור chitosan המוגזם לקצה התחתון באמצעות מלקחיים.
   5. מניחים שקופיות בכיוון הזה על גבי מגבת נייר בתוך קופסת שקופיות. כוח המשיכה לגרום chitosan עודף ליפול על מגבת, מניב שכבה שטוחה ואחידה של chitosan.
   6. PlaCe בתיבת שקופיות עם המכסה שלה שנפתח במקרר O / N לאפשר chitosan להתייבש.
      הערה: ראה טבלת 1 עבור השוואה בין שתי השיטות דבקות.

4. בקשה של סמני הפניה ל'מצגות

1. כן פתרון סמן הפניה ידי המסת 50 μl של ירוק 50 μl של microspheres האדום 100 μl של מים. אחסן את הפתרון בחושך על 4 מעלות צלזיוס.
2. מניחים 10 μl או 20 μl טיפ pipet לתוך התמיסה microsphere. הוסף טיפה קטנה של פתרון microsphere לכל קטע סמוך לאזור של עניין (איור 3 ג). היזהר שלא לקבל את microspheres בתוך האזור של עניין.
3. יבש את השקופיות ב RT (מוגן מפני אור) למשך 30 דקות אם עיבוד השקופיות באותו יום. אם לא, במקום שקופיות בתיבת שקופיות ב 4 ° C.
   הערה: כל עוד הפתרון microsphere מתייבש לפני לחות השקופיות, MIcrospheres יישאר דבקה השקופיות במהלך סבבים רבים של מכתים / הדמיה.

5. סבבים רבים של מכתים

הערה: על ידי בחירת רצף תואם של הדמיה, מכתים, וצעדי reimaging, אפשר לזהות ושיתוף בתרגום אותות ביולוגיים רבים על אותו קטע הרקמה. כל סיבוב של reimaging הדמיה / מכתים / יש שיפותח עבור השאלה היסטולוגית בפרט. הדמיה / מכתים / רצף reimaging כרוך בדרך כלל רכישת אותות ניאון אנדוגני (למשל, ה- GFP הסלולר, צבעי מינרליזציה, in vivo בדיקות הדמיה) על הסיבוב הראשון של הדמיה ואחריו immunostaining מרובב פלורסנט סבבים רבים של כתמים הפעילות האנזימטית. לבסוף, בחלק ניתן מוכתמים באמצעות צבעים chromogenic (למשל, H & E, toluidine כחול, safranin O, וכו ') כדי להדגיש את מבנה רקמה. המוצגות בסעיף זה הם שיטות מותאמות אישית מותאמותפרוטוקולים זמינים מסחרי.

1. Calcein כתמים כחולים על מינרלים שנצבר
   הערה: כתמי כחולי Calcein מניב משטח מינרליים עקבי כי ניתן ניתוח תמונה אוטומטית בניגוד בניגוד התערבות darkfield או הפרש הדמיה (DIC). הבעיה עם כתמים כחולים calcein הוא שהספקטרום פלורסנט חופפת טטרציקלין וסימון demeclocycline. לכן, אם המדגם מכיל תוויות מינרלים אלה, תמונה תוויות בסיבוב הראשון של הדמיה לפני צביעה עם כחול calcein.
   1. אם האותות אנדוגני בתוך הרקמה הם צילמו לפני צעד מכתים זה, להטביע את שקופיות מסבב הדמיה הקודם בצנצנת coplin מלא 1xPBS עד תלושי לכסות ליפול הרחק השקופיות. הסר ולייבש את תלושי לכסות.
   2. הכן 30 מ"ג / מ"ל של תמיסת כחול calcein ב 2% ₃ NaHCO (מיוצר על ידי המסת 2 גרם NaHCO ₃ ב 100 מ"ל H ₂ O ולהתאיםing ל- pH של 7.4 עם HCl). Aliquot ולאחסן את הפתרון ב -20 ° C.
   3. לטבול את השקופיות בצנצנת coplin המכילות 1X PBS במשך 15 דקות כדי ללחלח את הסעיפים, אם לא כבר hydrated מן הסיבוב הקודם.
   4. הסר את השקופיות ולייבש אחורי וקצוות עם מגבת נייר.
   5. להחיל 100 - 500 μl של פתרון כחול calcein לכל שקופית דגירה במשך 10 דקות בתא לחות ב RT.
   6. יש לשטוף את השקופיות ב 1x PBS במשך 10 דקות עם 3 שינויים.
   7. החל ~ 200 μl של גליצרול 50% ב 1x PBS על כל שקופית הר להחליק את המכסה.
   8. הסר גליצרול עודף ולייבש התחתון של השקופיות.
2. Tartrate עמיד phosphatase חומצה (TRAP) מכתים הפעילות האנזימטית
   הערה: TRAP מתבטאת סוגי תאים מרובים בשושלת hematopoietic כולל osteoclasts. מכתים TRAP המוצג כאן משתמש מצע phosphatase צהוב ניאון החומצה. אותות ניאון מסוימים יהיו overlap עם סט מסנן צהוב מותאם אישית כולל תוויות מינרליזציה טטרציקלין / demeclocycline, calcein כתם כחול, counterstain DAPI.
   1. לצלול שקופיות מסבב הדמיה הקודם בצנצנת coplin מלא PBS 1x עד תלושי לכסות ליפול הרחק השקופיות. הסר ולייבש את תלושי לכסות.
   2. הכן הצפת 1 על ידי המסת 9.2 גרם של נטול מים אצטט נתרן 11.4 גרם של מימית dibasic tartrate נתרן במים והבאת נפח סופי 1,000 מ"ל. התאם את ה- pH ל -4.2 עם חומצה אצטית קרחונית מרוכזת (~ 1.5 - 2 מיליליטר). אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד 12 חודשים.
   3. כן ההצפה 2 על ידי המסת 40 מ"ג של סודיום ניטריט במים והבאת הנפח הסופי עד 1 מיליליטר. אחסן את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס עד 1 בשבוע.
   4. ביום מכתים, להכין את החיץ התגובה על ידי ערבוב 7.5 מ"ל של חיץ 1 ו 150 μl של חיץ 2.
   5. החל למאגר התגובה בלי המצע לשקופיתים במשך 10 - 15 דקות כדי לאזן את הרקמה על pH הנמוך.
      הערה: ההיקף הטיפוסי הוא ~ 200 μl אבל צריך להיות גדול מספיק כדי לכסות את כל החלקים.
   6. לדלל את מצע phosphatase חומצת ניאון הצהוב בין 01:50 ו -1: 100 במאגר התגובה.
      הערה: דילול יהיה מוכתב על ידי פעילות TRAP בתוך המדגם.
   7. יוצקים את מאגר התגובה הנחה של שקופיות ולהחיל למאגר התגובה עם המצע ניאון צהוב על השקופיות.
   8. מניחים את השקופיות תחת אור שחור UV עבור ~ 5 דקות כדי להפעיל את המצע.
      הערה: זמן דגירה עשוי להשתנות בהתאם לפעילות TRAP בתוך המדגם.
   9. יש לשטוף את השקופיות ב 1x PBS במשך 10 דקות עם 3 שינויים.
   10. החל ~ 200 μl של גליצרול 50% ב 1x PBS על כל שקופית הר להחליק את המכסה.
   11. הסר גליצרול עודף ולייבש התחתון של השקופיות.
       הערה: מאגר TRAP חומצי יהיה decalcify הסעיפים. היתרון הנוסף של decalcification הוא כי צבעים מסוימים יהיו זמינים שוב מכתימים במורד זרם (למשל, תוויות מינרליזציה). לדוגמה, כתמים כחולים calcein יוסרו במהלך מכתים TRAP. לכן, DAPI counterstain ניתן הדמיה באפיק זה במהלך סבב שלאחר מכן.
3. Phosphatase אלקליין (AP) פעילות אנזימטית מכתים
   הערה: סוגי תאים מרובים מעורב עם מינרליזציה כולל osteoblasts ו chondrocytes mineralizing להביע AP. המצע האדום המהיר בשימוש בפרוטוקול זה מעורר אות אדומה אדומה chromogenic פלורסנט שניהם. בגלל זה, המצע chromogenic יהיה להרוות אותות ניאון באזורים בהם המצע משקעים. לכן, עדיף לעשות את הכתם הזה לאחר הדמית אותות הניאון כי ניתן רווה ידי מצע AP.
   1. לצלול שקופיות מסבב הדמיה הקודם בצנצנת coplin מלא PBS 1x עד תלושי לכסות ליפול הרחק השקופיות. רמתיve ולייבש את התלושים לכסות.
   2. כן 1 M טריס ידי המסת 12.1 גרם של טריס ב 100 מ"ל מים. התאם ל- pH 9.5 עם 1 M NaOH.
   3. כן 1 M MgCl ₂ hexahydrate ידי המסת 20.33 גרם של MgCl ₂ ב 100 מ"ל מים ללא יונים.
   4. הכן 2 M NaCl ידי המסת 11.68 גרם NaCl ב 100 מ"ל מים ללא יונים.
   5. הכן 100x (20 מ"ג / מ"ל) פתרון המניות של מלח TR האדום מהיר על ידי המסת אבקת 1 גרם ב 50 מ"ל של מים ללא יונים. הפוך 100 aliquots ולאחסן μl ב -20 ° C.
   6. הכן 100x (10 מ"ג / מ"ל) Naphthol פתרון מניות פוספט AS-MX ידי המסת אבקת 500 מ"ג ב 50 מ"ל של N, dimethylformamide N. הפוך 100 aliquots ולאחסן μl ב -20 ° C.
   7. ביום מכתים, להכין את החיץ AP על ידי הוספת 1 ​​מ"ל של 1 M טריס, 0.5 מ"ל של 1 M ₂ MgCl, 0.5 מ"ל של 2 M NaCl ולהביא את נפח סופי 10 מ"ל באמצעות מים ללא יונים (ריכוזים הסופי: 100 מ"מ טריס, 50 מ"מ MgCl _2, 100 מ"מ NaCl).
   8. מניחים ב APuffer על כל שקופית הדגירה בתא לחות במשך 10 דקות ב RT.
   9. הכן חיץ המצע AP ידי דילול 100x מניות של מלח TR האדום מהיר Naphthol AS-MX כדי 1x במאגר AP.
   10. יוצקים AP חיץ הנחה של שקופיות ולהחליף עם חיץ המצע AP. דגירה שקופיות עבור 5 - 10 דקות בתא לחות ב RT.
       הערה: זמן דגירה יהיה מוכתב על ידי פעילות AP של המדגם.
   11. לשטוף מחליק 3x ב 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד.
   12. כיסוי הר מחליק עם פתרון counterstaining DAPI (1: 1,000 דילול DAPI ב 50% גליצרול ב PBS 1x).
4. O toluidine כחול (TB) מכתים chromogenic
   הערה: בגלל כל השלבים הקודמים הם צלמו תחת הרכבה מימית זמנית 50% גליצרול / פתרון PBS, צעד chromogenic גם צלם בתנאים מימיים. עם זאת, הפתרון המכתים עשוי נוטה לדלוף החוצה במשך זמן. לכן, הוא הציע כדי שזה יקלוט את toluidine הכחול בהקדם האפשרי לאחר צביעה.
   1. לצלול שקופיות מסבב הדמיה הקודם בצנצנת coplin מלא מים ללא יונים עד תלושי לכסות ליפול הרחק השקופיות. הסר ולייבש את תלושי לכסות.
   2. לאחר הסרת מכסה מחליק, להחליף עם מים מתוקים דגירה השקופיות במשך 10 דקות לפחות כך מלחים PBS מוסרים מספיק מן הרקמה.
   3. כן פתרון TB 0.025% במי deionized.
   4. מניח את שקופיות פתרון TB עבור 1 - 5 דקות.
      הערה: זמן הדגירה תלוי העדפת המשתמש אבל צריך להישמר עקבי לאורך כל הדגימות.
   5. מקום שקופית לתוך צנצנת coplin עם מגלשות מים לשטוף deionized 3x עבור 5 דקות כל אחד.
   6. להחליק את המכסה הר עם 30% גליצרול מומס במים ללא יונים (NOT 1X PBS כמו זה יגרום הכתם ליץ החוצה מן הרקמה). הערה: הרכבה בינונית גליצרול ניתן להחליף עם סירופ פרוקטוז, אשר מסייע למנוע דיפוזיה של הכתם מן הרקמה. למכינים את הסירופ פרוקטוז, לפזר 30 גרם של פרוקטוז ב 10 מ"ל של מים וחום deionized ל -60 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה.

6. טיולי הדמיה מרובים

1. טען את השקופיות במגשי מיקרוסקופ (איור 3D).
   הערה: מגשי קפיץ.
2. הכנס את המגשים לתוך ערימה מגש של המיקרוסקופ סריקת שקופיות (איור 3E).
3. לחץ על רשימת הפרופיל לטעון פרופיל עבור כל שקופית עם זמני חשיפה מתאימים לכל fluorophore. הקש על שם שקופית לתת שם לכל שקופית באופן ידני או לקבל את התוכנה לקרוא את הברקוד הניתן על תווית השקופיות. לחץ על לחצן הסריקה מקדימה התחלה לקחת תמונת תצוגה מקדימה של השקופית.
4. הגדר את האזורים של עניין באשף זיהוי הרקמות ולשמור אותם לסיבובים הבאים של הדמיה. לאחר כל שקופית מוגדרת, להתחיל את תהליך הסריקה על ידי לחיצה על הכפתור התחל סריקה.
   הערה: המערכת יכולה להכיל עד 100 SLIdes בכל פעם.
5. לאחר ההדמיה סיימה, לייצא את התמונות כל סיבוב ערוץ והדמית פרט .tif או קבצי jpg להרכבת תמונה וניתוח.

7. תמונה האסיפה

1. שיטה ידנית באמצעות פוטושופ (או תוכנת עריכת תמונה דומה מסוגלת לייצר תמונות שכבתיות).
   1. פתח כל תמונת ערוץ פרט מפני כל סיבוב הדמיה.
   2. הרכב את התמונות הבודדות כאילו שכבות בתוך תמונה אחת מרוכבים. לשם כך, לחץ על השכבה בתוך לוח שכבה מתמונה אחת. לאחר מכן גרר את השכבה גבי תמונה אחרת. בפעולת גרור ושחרר זו תיצור שכבה חדשה בתמונה. בצע פעולה זו עבור כל תמונות אחרות. לחלופין, להשתמש בסקריפט (File> Scripts> קבצים טען לתוך ערימה ...) כדי להפוך את התהליך הזה על ידי טעינת קבצי תמונה מרובים כשכבות אותה במערך התמונה.
   3. לאחר כל תמונה מופיעה כנדבך בודד התמונה המורכבת, לחיצה כפולה על שם השכבה כדי לשנות את שם layers לפי הצורך להבחין הערוצים השונים.
   4. כדי לראות דרך כל שכבה וליצור תמונה מורכבת באמת, לשנות את מצב תערובת לכל שכבה מן "רגיל" ל "מסך" בתוך לוח השכבה.
      הערה: כדי להאיץ את הצעד הזה, לשנות בשכבה אחת להקרין, ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על השכבה, בחר "העתק סגנון שכבה", ואז לסמן את כל השכבות האחרות ובחר "דבק סגנון שכבה" כדי להחיל את סגנון המסך לצד השני שכבות.
   5. אם תרצה, להקטין את (ערך שינוי עד 10 - 40%) אטימות השכבה chromogenic (כלומר, toluidine כחול) כדי להמחיש טוב יותר את האותות פלורסנט דרך שכבת chromogenic.
      הערה: מיקרוסקופ סורק הרעפים בשימוש בפרוטוקול זה מחזיק את השקופיות על 3 קצוות, ובכך לצמצם את כמות הסיבוב שיכול להתרחש לשקופית במהלך כל סיבוב של הדמיה. לכן, זה הרבה יותר קל עבור המשתמש כדי ליישר את התמונות באופן ידני מבלי לסובב תמונות נגזרומ סיבובים שונים של הדמיה.

תוצאות

עבודה כללית עבור התפוקה הגבוהה, רבה-תמונת Cryohistology

איור 1 מייצג את זרימת העבודה הכללית המשמשת עבור טכניקה זו. היא כוללת מספר צעדים מן הקיבעון דרך מספר סבבי ההדמיה ולבסוף יישור ?...

Discussion

כאן הצגנו פרוטוקול cryohistology מפורט לשתף למקם ולכמת כמה צעדים ביולוגיים על ידי יישור תמונות סבבים רבים של מכתים / הדמיה על קטע יחיד. השיטה התוותה באמצעות cryotape שימושית במיוחד כפי שהיא שומרת את המורפולוגיה של קשה רקמות סעיף (למשל, עצם וסחוס mineralized). בנוסף, רקמת מחולק הי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128-4L	Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378	Multiple suppliers available.
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Multiple suppliers available.
Cryomolds	Fisher Scientific	Fisherbrand #22-363-554	Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix	Thermo Scientific	6769006	Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane	Sigma Aldrich	M32631	Multiple suppliers available.
Cryostat	Leica Biosystems	3050s	Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc	Leica Biosystems	14037008587	Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades	Thermo Scientific	3051835	Can be substituted with other brands/models.
Cryotape	Section Lab	Cryofilm 2C
Roller	Electron Microscopy Sciences	62800-46	Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides	Electron Microscopy Sciences	71890-01	Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides	Thermo Scientific	3051	Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61	Norland Optical	Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light	General Electric	F15T8-BLB
Glacial acetic acid	Sigma Aldrich	ARK2183	Multiple suppliers available.
Chitosan	Sigma Aldrich	C3646	Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres	ThermoFisher Scientific	I-14787
InSpeck green microspheres	ThermoFisher Scientific	I-14785
Calcein Blue	Sigma Aldrich	M1255	Multiple suppliers available.
Calcein	Sigma Aldrich	C0875	Multiple suppliers available.
Alizarin complexone	Sigma Aldrich	A3882	Multiple suppliers available.
Demeclocycline	Sigma Aldrich	D6140	Multiple suppliers available.
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761	Multiple suppliers available.
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate	ThermoFisher Scientific	E-6588
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain)	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	R37108	Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous	Sigma Aldrich	S2889	Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate	Sigma Aldrich	T6521	Multiple suppliers available.
Sodium nitrite	Sigma Aldrich	S2252	Multiple suppliers available.
Tris	Sigma Aldrich	15504	Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate	Sigma Aldrich	M9272	Multiple suppliers available.
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt	Sigma Aldrich	F8764	Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX	Sigma Aldrich	N4875	Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide	Sigma Aldrich	D158550	Multiple suppliers available.
Toluidine blue O	Sigma Aldrich	T3260	Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1	Carl Zeiss AG	Axio Scan.Z1	Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set	Chroma Technology Corp.	49000
CFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49001
GFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49020
YFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set	Chroma Technology Corp.	custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set	Chroma Technology Corp.	49004
Cy5 Filter Set	Chroma Technology Corp.	49009
CryoJane Tape Transfer System	Electron Microscopy Sciences	62800-10	Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows	Electron Microscopy Sciences	62800-72	Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides	Electron Microscopy Sciences	62800-4X	Multiple suppliers available.