De alto rendimiento, de múltiples imágenes Cryohistology de tejidos mineralizados

Resumen

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

Resumen

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

Introducción

La investigación biológica requiere a menudo fenotipificación eficiente, lo que con frecuencia se asocia con algún tipo de análisis histológico ^1-3. Esta necesidad es aún más evidente con los ambiciosos proyectos para interrumpir cada gen en el genoma del ratón ^4. Estos análisis histológicos pueden variar desde la evaluación de la morfología celular y / o características anatómicas a la expresión de mapeo de genes específicos o proteínas a las células individuales. De hecho, una de las contribuciones fundamentales de la histología en el campo de la genómica es la posibilidad de asociar una señal molecular específica a una región o célula tipo específico.

Los métodos tradicionales de la histología, especialmente para los tejidos musculoesqueléticos, son a menudo mucho tiempo y laborioso, que requiere a veces semanas para arreglar, descalcificación, sección, mancha, e imagen de la muestra a continuación, analizar las imágenes a través de la interpretación humana. El análisis de señales moleculares múltiples, ya sea a través de inmunohistoquímica, en hybridizat situiones, o tinciones especiales, requiere múltiples secciones e incluso múltiples muestras para llevar a cabo adecuadamente. Además, estas respuestas múltiples no pueden ser co-localizan en la misma célula y a veces puede no ser co-localizada a una región específica dentro de una determinada muestra. Como el campo de la genómica y la epigenomics mueve a la era digital, el campo histológico también debe seguir el juego para proporcionar eficiente, de alto rendimiento, y el análisis automatizado de una variedad de señales moleculares dentro de una sola sección histológica.

De hecho, existe una demanda de mejora de las técnicas histológicas que se pueden asociar múltiples señales moleculares a células específicas dentro de una determinada muestra. Recientemente, se ha publicado un nuevo método cryohistological de alto rendimiento para la evaluación de varias medidas de respuesta dentro de una sección dada de tejido mineralizado ^5-14. El proceso consiste en la estabilización de la sección criogénica con cryotape congelado, adherir la sección de cinta adhesiva de forma rígida a un portaobjetos de microscopio, yla realización de varias rondas de tinción y de imagen en cada sección. Estas rondas de imágenes son entonces alineados manualmente o por medio de la automatización de equipo antes de análisis de imagen (Figura 1). A continuación, presentamos los protocolos detallados de este proceso y proporcionar ejemplos en los que estas técnicas han mejorado nuestra comprensión de los diferentes procesos biológicos.

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Protocolo

La Universidad de Cuidado de Animales institucional y el uso Connecticut Health Center aprobó todos los procedimientos con animales.

1. fijación e inclusión

1. La eutanasia a los animales a través de asfixia con _CO2 u otros métodos aprobados.
2. Cosechar el tejido de interés (por ejemplo, las extremidades, vértebras, etc.) y el lugar en el 10% de formalina tamponada neutra a 4 ° C hasta que estén sujetas correctamente. Tenga especial cuidado de mantener la ubicación anatómica consistente antes de la fijación. Por ejemplo, fijar las extremidades con articulaciones en flexión constante, rotación interna, rotación externa y ángulos de ^11. Por lo general, fijar las extremidades completas de ratón por 1 - 3 días.
   Precaución: La formalina es tóxico y debe ser manejado en una campana de humos, mientras que use el equipo de protección personal adecuado.
   Nota: El marco de tiempo de la fijación depende del tamaño de la muestra. Si el experimento permite, cortar y abrir el hueso va a mejorar la fijación del compartimiento ósea.Algunos especímenes pueden requerir la fijación de perfusión ¹⁵ para minimizar el fondo fluorescente (por ejemplo, señales fluorescentes débiles dentro de la médula ósea).
3. Transferencia de especímenes de formalina al 30% de sacarosa hecho en 1x PBS y se incuba durante 12-24 horas a 4 ° C.
   Nota: Una vez se incubaron durante 12-24 horas, las muestras se pueden colocar a -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo. Se recomienda este método de almacenamiento para los experimentos en los que los investigadores tienen la intención de integrar múltiples muestras en el mismo bloque, pero no pueden cosechar todas estas muestras al mismo tiempo (por ejemplo, los experimentos con múltiples puntos de tiempo).
4. Retire las muestras de la sacarosa y diseccionar el exceso de tejido.
5. Llenar un criomolde (tamaño del molde depende del tamaño de la muestra) una parte del camino con la crio medio de inclusión. Coloque la muestra en el molde de tal manera que el plano de corte de la región de interés es paralelo con la parte inferior del molde.
   Nota: Un ejemplo de la colocación de un tejido específico y la orientaciónse pueden encontrar en la Figura 2A - B.
6. Coloque el criomolde en un pedazo de hielo seco hasta que una fina capa de crio incrustación se congela a medio y posteriormente se fija la pieza en su lugar. Llenar el volumen restante de la criomolde con crio medio de inclusión, mientras que el mantenimiento de la criomolde en la de gránulos de hielo seco.
7. Coloque el criomolde en un recipiente que contiene 2-metil-butano previamente enfriado por hielo seco. Una vez que las muestras se congelaron por completo, retire criomoldes y sacuda el exceso de 2-metil-butano. Envolver criomoldes en celofán y colocar en un -20 ° C o -80 ° C congelador para su almacenamiento.
   Nota: Las muestras se pueden secar con el tiempo cuando se almacena en un medio de crio incrustación, especialmente a -20 ° C. Recomendamos el almacenamiento de las muestras durante más de 1 - 2 meses en medio de inclusión crio a -80 ° C o en sacarosa al 30% a -80 ° C (véase el paso 1.3).

2. seccionar los tejidos de la cinta estabilizada

1. Eliminar los bloques de muestras del congelador y poner en cryostat con la temperatura ajustada entre -20 y -25 ° C.
2. Retire el bloque de la criomolde y recortar el exceso de crio medio de inclusión con una hoja de afeitar.
3. Coloque un poco de medio de crio incrustar en el disco de muestra y luego alinear el bloque de tal manera que la superficie de la platina es paralela a la superficie inferior del bloque de lo que se establece el plano de corte adecuada para la región de interés.
4. Coloque el disco de espécimen en el criostato y permitir la crio medio de congelación de la incrustación.
5. Coloque el disco de espécimen sobre la cabeza de muestra y ajuste la cabeza de tal manera que la hoja corte paralelos a la superficie del bloque de muestras.
6. Recortar el bloque a un nivel dentro de la región de interés y cepille cualquier virutas de la superficie del bloque.
7. Corte un pedazo de la cryotape lo suficientemente grande como para cubrir la región de interés y pre-enfriamiento en el criostato.
   Nota: Las piezas múltiples se pueden cortar de tamaños consistentes y se almacenan dentro de la cryosta durante el corte.
8. Retire la cubierta no adherente de la cryotape agarrando la cinta por las lengüetas no pegajoso plata / oro con unas pinzas a continuación, colocar la cinta en el lado pegajoso-manzana más abajo.
9. Aplicar presión a la cryotape usando el rodillo (Figura 2C).
10. Hacer una sección (5 - 8 micras) utilizando el control automático del motor o de la rueda de corte manual de la criostato.
    Nota: Es una buena práctica para mantener el borde de la cryotape, ya que viene en el escenario de tal manera que la sección no cae fuera del escenario durante el corte (Figura 2D).
11. Coloque el lado de la sección de tejido sobre un portaobjetos de microscopio de plástico dentro del criostato.
12. Retire la corredera de plástico de la criostato y permitir que el medio de crio incrustación para fundir de manera que la sección se adhiere a la superficie del portaobjetos.
13. Repetir el corte de secciones en serie o en otras regiones de interés.
14. Una vez terminado, almacenar las secciones en una caja de portaobjetos unat 4, -20 o -80 ° C dependiendo de la longitud de almacenamiento requerido y las medidas de respuesta de aguas abajo. Por ejemplo, utilizar las diapositivas que van a ser teñidas para la actividad enzimática (véase 5.2 a 5.3) dentro de un mes si se almacena a 4 ° C.

3. La adhesión de las secciones para los portaobjetos del microscopio

1. UV-curable método adhesivo.
   1. Etiquetar el portaobjetos de un microscopio.
      Nota: Para una mayor automatización, las muestras y las diapositivas se pueden marcar con códigos de barras.
   2. Aplicar una gota de adhesivo óptico activado UV-a dos portaobjetos de vidrio y utilizar el borde de un portaobjetos de plástico para extender una capa delgada de adhesivo sobre la superficie de los portaobjetos de vidrio.
   3. Cortar la pestaña plata / oro y sentar el lado sección de tejido fijado con cinta adhesiva en la de la primera diapositiva. Aplicar la sección en un movimiento de rodadura desde un borde al otro con el fin de minimizar la formación de burbujas atrapadas debajo de la cinta.
      NOTA: La primera diapositiva se utiliza para humedecer previamente la parte inferior de la camisetaque la cinta antes de colocarla en el segundo carro (permanente) (paso 3.1.4).
   4. Retirar la parte grabada desde la primera diapositiva y colocarla sobre la capa adhesiva de la segunda corredera (Figura 3A). Una vez más, tenga cuidado para evitar el atrapamiento de burbujas.
      NOTA: Este paso requiere práctica para dominar.
   5. Una vez que el número apropiado de secciones para el experimento dado se coloca en cada diapositiva, limpie el exceso de adhesivo de las áreas circundantes.
   6. Inspeccionar cada sección de cerca de burbujas o fibras por debajo de la cinta. Realizar esta inspección bajo un cristal de microscopio o lupa. Si hay obstrucciones, eliminar la sección individual, eliminar las obstrucciones y vuelva a aplicar a la lámina de vidrio.
   7. Una vez que se determina que no hay obstrucciones en las secciones grabadas, colocar los portaobjetos de microscopio bajo la luz UV negro durante 5 - 10 minutos a para reticular el adhesivo.
2. método adhesivo Chitosan.
   1. preparar THe 1% adhesivo quitosano. Preparar la solución de ácido acético mediante la disolución de 0,25 ml de ácido acético concentrado en 100 ml de agua DI (0,25% v / v). Disolver 1 g de polvo de quitosano en 100 ml de solución de ácido acético y se agita la solución de O / N o hasta que se disuelva todo el polvo de quitosano.
      NOTA: La solución es estable a RT.
   2. Depositar una gota de solución de quitosano para cada sección que se colocará en la diapositiva.
   3. Cortar la pestaña plata / oro de la cinta y colocar a cada lado del tejido sección cerradas con cinta adhesiva sobre el adhesivo (Figura 3A). Tenga mucho cuidado para evitar el atrapamiento de burbujas.
   4. Una vez que todas las secciones se colocan en la diapositiva, incline la corredera arriba en uno de sus bordes largos y arrastre quitosano excesiva al borde inferior con unas pinzas.
   5. Colocar los portaobjetos en esta orientación en la parte superior de una toalla de papel en una caja de portaobjetos. La gravedad hará entonces que el exceso de quitosano a caer hacia abajo sobre la toalla, produciendo una capa plana y uniforme de quitosano.
   6. Place la caja de diapositivas con su tapa un poco abierta en el refrigerador O / N para permitir que el quitosano se seque.
      NOTA: Véase la Tabla 1 para una comparación entre los dos métodos adhesivos.

4. Aplicación de las marcas de referencia a las diapositivas

1. Preparar la solución de marcador de referencia mediante la disolución de 50 l de verde y 50 l de microesferas rojas en 100 l de agua. Guardar la solución en la oscuridad a 4 ° C.
2. Coloque una punta de pipeta 10 l ó 20 l en la solución de microesferas. Añadir una pequeña gota de la solución de microesferas a cada sección adyacente a la región de interés (Figura 3C). Tenga cuidado de no obtener las microesferas dentro de la región de interés.
3. Se secan los portaobjetos a TA (protegido de la luz) durante 30 minutos, si el procesamiento de las diapositivas en ese día. Si no es así, colocar los portaobjetos en una caja de portaobjetos a 4 ° C.
   Nota: Mientras la solución de microesferas se seca antes de hidratar los portaobjetos, el microspheres permanecerá adherido a las diapositivas durante varias rondas de manchas / formación de imágenes.

5. múltiples rondas de tinción

NOTA: Al elegir una secuencia de imágenes compatibles de, tinción y medidas de creación de imágenes, es posible detectar y co-localizar muchas señales biológicas en la misma sección de tejido. Cada ronda de imágenes / tinción / creación de las imágenes tiene que ser desarrollada por la pregunta histológico particular. La secuencia de imágenes / tinción / reimaging implica típicamente la adquisición de las señales fluorescentes endógenos (por ejemplo, GFP celular, colorantes de mineralización, in vivo sondas de imagen) en la primera ronda de imagen seguido de inmunotinción multiplexada fluorescente y múltiples rondas de manchas de la actividad enzimática. Por último, la sección se puede teñir con tintes cromogénicos (por ejemplo, H & E, azul de toluidina, safranina O, etc.) para resaltar la arquitectura del tejido. Que se presentan en esta sección son métodos personalizados adaptados deprotocolos disponibles comercialmente.

1. Calceína tinción con azul de mineral acumulado
   NOTA: La calceína tinción con azul produce una superficie mineral consistente que es susceptible de análisis automatizado de imágenes a diferencia de las imágenes de campo oscuro o de contraste de interferencia diferencial (DIC). El problema con tinción de azul de calceína es que el espectro de fluorescencia se solapa con tetraciclina y etiquetado demeclociclina. Por lo tanto, si la muestra contiene estos minerales, las etiquetas de imagen en las etiquetas de la primera ronda de las imágenes antes de la tinción con azul de calceína.
   1. Si las señales endógenas dentro del tejido se crean imágenes de antes de esta etapa de tinción, sumergir las diapositivas de la ronda previa de la imagen en una jarra Coplin llena de 1 x PBS hasta que la cubierta se desliza caen fuera de las diapositivas. Retirar y secar las hojas de la cubierta.
   2. Prepare 30 mg / ml de solución de azul de calceína en 2% de _NaHCO3 (hecha por disolución de 2 g de NaHCO ₃ en 100 ml de _H2O y ajustaring a pH de 7,4 con HCl). Alícuota y almacenar la solución a -20 ° C.
   3. Sumergir los portaobjetos en una jarra Coplin con 1x PBS durante 15 minutos para hidratar las secciones, si no se ha hidratado de la ronda anterior.
   4. Retire los portaobjetos y secar la parte posterior y los bordes con una toalla de papel.
   5. Aplicar 100 - 500 l de solución de azul de calceína por portaobjetos y se incuba durante 10 min en una cámara de humedad a temperatura ambiente.
   6. Lavar los portaobjetos en 1x PBS durante 10 min con 3 cambios.
   7. Aplicar ~ 200 l de glicerol al 50% en 1x PBS a cada diapositiva y montar la hoja de la cubierta.
   8. Eliminar el exceso de glicerol y secar el fondo de las diapositivas.
2. Tartrato resistente a la fosfatasa ácida (TRAP) tinción actividad enzimática
   NOTA: TRAP se expresa por múltiples tipos de células en el linaje hematopoyético, incluyendo los osteoclastos. La tinción TRAP presentado aquí utiliza un sustrato de la fosfatasa ácida de color amarillo fluorescente. Ciertas señales fluorescentes se OVERLAP con el conjunto de filtro personalizado amarilla incluyendo etiquetas de tetraciclina / demeclociclina mineralización, calceína tinte azul, y el contraste DAPI.
   1. Sumergir los portaobjetos de la ronda previa de la imagen en una jarra Coplin llena de 1x PBS hasta que la cubierta se desliza caen fuera de las diapositivas. Retirar y secar las hojas de la cubierta.
   2. Preparar Buffer 1 mediante la disolución de 9,2 g de acetato de sodio anhidro y 11,4 g de tartrato de sodio dibásico dihidratado en agua y llevando el volumen final a 1.000 ml. Ajustar el pH a 4,2 con ácido concentrado acético glacial (~ 1,5 - 2 ml). Almacenar la solución a 4 ° C durante un máximo de 12 meses.
   3. Preparar tampón 2 disolviendo 40 mg de nitrito de sodio en agua y llevando el volumen final a 1 ml. Almacenar la solución a 4 ° C hasta por 1 semana.
   4. En el día de la tinción, preparar el tampón de reacción mediante la mezcla de 7,5 ml de tampón de 1 y 150 l de tampón de 2.
   5. Aplicar el tampón de reacción sin el sustrato a la diapositivas durante 10 - 15 min para equilibrar el tejido en el pH más bajo.
      Nota: El volumen típico es de ~ 200 l pero debe ser lo suficientemente grande como para cubrir todas las secciones.
   6. Diluir el sustrato de la fosfatasa ácida de color amarillo fluorescente entre 1:50 y 1: 100 en el tampón de reacción.
      NOTA: La dilución será dictada por la actividad de TRAP en la muestra.
   7. Verter el tampón de reacción fuera de las diapositivas y aplicar el tampón de reacción con el sustrato fluorescente de color amarillo a las diapositivas.
   8. Colocar los portaobjetos bajo la luz UV negro de ~ 5 min para activar el sustrato.
      NOTA: El tiempo de incubación puede variar dependiendo de la actividad TRAP en la muestra.
   9. Lavar los portaobjetos en 1x PBS durante 10 min con 3 cambios.
   10. Aplicar ~ 200 l de glicerol al 50% en 1x PBS a cada diapositiva y montar la hoja de la cubierta.
   11. Eliminar el exceso de glicerol y secar el fondo de las diapositivas.
       NOTA: El tampón TRAP ácida se decalcify las secciones. El beneficio añadido de la decalcificación es que ciertos colores estarán disponibles de nuevo para la tinción de aguas abajo (por ejemplo, etiquetas de mineralización). Por ejemplo, la tinción con azul de calceína se eliminará durante la tinción TRAP. Por lo tanto, DAPI de contraste se pueden obtener imágenes en este canal durante una ronda subsiguiente.
3. La fosfatasa alcalina (AP) tinción actividad enzimática
   NOTA: Múltiples tipos de células que participan en la mineralización incluyendo los osteoblastos y condrocitos mineralizantes expresar AP. El sustrato Fast Red utilizada en este protocolo provoca tanto una señal roja y roja cromogénico fluorescente. Debido a esto, el sustrato cromogénico apagará señales fluorescentes en las regiones donde el sustrato precipita. Por lo tanto, lo mejor es hacer esta mancha tras explorar las señales fluorescentes que pueden ser apagado por el sustrato AP.
   1. Sumergir los portaobjetos de la ronda previa de la imagen en una jarra Coplin llena de 1x PBS hasta que la cubierta se desliza caen fuera de las diapositivas. Remove y secar las hojas de la cubierta.
   2. Preparar 1 M Tris disolviendo 12,1 g de Tris en 100 ml de agua. Ajustar el pH a 9,5 con NaOH 1 M.
   3. Preparar 1 M MgCl ₂ hexahidrato disolviendo 20,33 g de MgCl ₂ en 100 ml de agua desionizada.
   4. Preparar 2 M NaCl disolviendo 11,68 g de NaCl en 100 ml de agua desionizada.
   5. Preparar 100x (20 mg / ml) solución madre de Fast Red TR sal por disolución de 1 g de polvo en 50 ml de agua desionizada. Hacer 100 ml de alícuotas y almacenar a -20 ° C.
   6. Preparar 100x (10 mg / ml) de solución de naftol AS-MX stock de fosfato disolviendo 500 mg de polvo en 50 ml de N, N dimetilformamida. Hacer 100 ml de alícuotas y almacenar a -20 ° C.
   7. En el día de la tinción, preparar el tampón de AP mediante la adición de 1 ml de 1 M Tris, 0,5 ml de 1 M MgCl _2, 0,5 ml de 2 M NaCl y llevar el volumen final a 10 ml con agua desionizada (concentraciones finales: 100 mM Tris, 50 mM MgCl _2, NaCl 100 mM).
   8. Coloque AP bUffer en cada portaobjetos y se incuba en una cámara húmeda durante 10 minutos a RT.
   9. Preparar tampón de sustrato AP diluyendo 100x existencias de Fast Red TR Sal y naftol AS-MX a 1x en el tampón de AP.
   10. Verter tampón AP fuera de diapositivas y reemplazar con tampón sustrato AP. Incubar los portaobjetos durante 5 - 10 min en una cámara de humedad a temperatura ambiente.
       NOTA: El tiempo de incubación será dictada por la actividad de AP de la muestra.
   11. Lavar los portaobjetos 3x en PBS 1x durante 5 minutos cada uno.
   12. cubierta de montaje se desliza con una solución de DAPI contratinción (dilución 1: 1000 de DAPI en 50% de glicerol en 1x PBS).
4. Azul de toluidina O (TB) tinción cromogénica
   NOTA: Debido a que todos los pasos anteriores se crean imágenes de bajo montaje acuosa temporal en glicerol al 50% / solución de PBS, el paso cromogénico también se forma la imagen en condiciones acuosas. Sin embargo, la solución de tinción puede tender a filtrarse con el tiempo. Por lo tanto, se sugiere a la imagen del azul de toluidina tan pronto como sea posible después de la tinción.
   1. Sumergir los portaobjetos de ronda previa de imágenes en una jarra Coplin llena de agua desionizada hasta que la cubierta se desliza caen fuera de las diapositivas. Retirar y secar las hojas de la cubierta.
   2. Después de retirar la cubierta se desliza, reemplazar con agua fresca y se incuban los portaobjetos durante al menos 10 minutos para que las sales de PBS están suficientemente separados de los tejidos.
   3. Preparar la solución TB 0,025% en agua desionizada.
   4. Colocar los portaobjetos en la solución TB durante 1 - 5 min.
      NOTA: El tiempo de incubación depende de las preferencias del usuario, pero debe mantenerse constante en todas las muestras.
   5. Colocar los portaobjetos en la jarra de Coplin con toboganes de agua y lavado desionizada 3 veces durante 5 minutos cada uno.
   6. Hoja de la cubierta del montaje con un 30% de glicerol disuelto en agua desionizada (NO PBS 1X ya que esto hará que la mancha que se filtre hacia fuera del tejido). NOTA: Glicerol medio de montaje puede ser sustituido con jarabe de fructosa, que ayuda a prevenir la difusión de la mancha del tejido. Apreparar el jarabe de fructosa, se disuelven 30 g de fructosa en 10 ml de agua desionizada y se calienta a 60 ° C hasta que se disuelva.

6. múltiples rondas de Imaging

1. Cargar las diapositivas en las bandejas de microscopio (Figura 3D).
   Nota: Las bandejas son resorte.
2. Introduzca las bandejas en la pila de la bandeja del microscopio de barrido deslizable (Figura 3E).
3. Haga clic en la lista de perfiles para cargar un perfil para cada diapositiva con tiempos de exposición apropiados para cada fluoróforo. Haga clic en el nombre de la diapositiva para nombrar cada diapositiva manualmente o dejar que el software lee el código de barras en la etiqueta de diapositivas. Haga clic en el botón de inicio de escaneado de vista previa para tomar una imagen de vista previa de la diapositiva.
4. Establecer las regiones de interés en el asistente de detección de tejidos y guardarlos para posteriores rondas de formación de imágenes. Una vez que cada diapositiva es de configuración, inicie el proceso de análisis haciendo clic en el botón de inicio de escaneado.
   Nota: El sistema puede almacenar hasta 100 SLIdes a la vez.
5. Una vez que la imagen ha terminado, exportar las imágenes de cada canal y la imagen redonda individuo como .tif o archivos .jpg para el montaje y análisis de imágenes.

7. Imagen de la Asamblea

1. Método manual usando Photoshop (o software de edición de imágenes similar capaz de producir imágenes con capas).
   1. Abrir cada imagen canal individual de cada ronda de imágenes.
   2. Montar las imágenes individuales como capas dentro de una imagen compuesta. Para ello, haga clic en la capa en la paleta de capas de una imagen. A continuación, arrastre la capa en otra imagen. Esta operación de arrastrar y soltar creará una nueva capa en la imagen. Hacer esto para todas las demás imágenes. Como alternativa, utilice una secuencia de comandos (Archivo> Secuencias de comandos> Archivos de carga en la pila ...) para automatizar este proceso mediante la carga de múltiples archivos de imágenes como capas en una pila de imágenes.
   3. Una vez que cada imagen aparece como una capa individual en la imagen compuesta, haga doble clic en el nombre de capa para cambiar el nombre de layers como sea necesario para discernir los diferentes canales.
   4. Con el fin de ver a través de cada capa y crear una imagen verdaderamente compuesto, cambiar el modo de mezcla para cada capa de "Normal" a "de la pantalla" en la paleta de capas.
      Nota: Para acelerar este paso, cambiar una sola capa a la pantalla, a continuación, haga clic derecho en la capa, seleccione "estilo de capa copia", a continuación, resalte todas las demás capas y seleccione "estilo capa de pasta" para aplicar el estilo pantalla a la otra capas.
   5. Si se desea, disminuir la opacidad (valor de cambio a 10-40%) de la capa de cromógeno (es decir, azul de toluidina) para visualizar mejor las señales fluorescentes a través de la capa de cromógeno.
      Nota: El microscopio de exploración de azulejos utilizado en este protocolo tiene los portaobjetos en 3 bordes, lo que minimiza la cantidad de rotación que puede ocurrir a la diapositiva durante cada ronda de formación de imágenes. Por lo tanto, es mucho más fácil para el usuario para alinear manualmente las imágenes sin tener que girar imágenes derivadasde diferentes rondas de formación de imágenes.

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Resultados

Un flujo de trabajo general para el de alto rendimiento, de múltiples imágenes Cryohistology

La figura 1 representa el flujo de trabajo general usado para esta técnica. Incluye varios pasos de fijación a través de varias rondas de formación de imágenes y, finalmente, la imagen de alineación / análisis. El proceso puede tomar tan poco como una semana para ir de la fijación de la muest...

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Discusión

Aquí hemos presentado un protocolo detallado cryohistology co-localizar y cuantificar varias medidas biológicas mediante la alineación de imágenes de varias rondas de manchas / formación de imágenes en una sola sección. El método descrito mediante el cryotape es especialmente útil, ya que mantiene la morfología de difícil sección de tejido (por ejemplo, hueso mineralizado y el cartílago). Además, el tejido seccionado se adhiere firmemente a la lámina de vidrio, lo que permite múltiples rondas de...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128-4L	Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378	Multiple suppliers available.
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Multiple suppliers available.
Cryomolds	Fisher Scientific	Fisherbrand #22-363-554	Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix	Thermo Scientific	6769006	Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane	Sigma Aldrich	M32631	Multiple suppliers available.
Cryostat	Leica Biosystems	3050s	Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc	Leica Biosystems	14037008587	Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades	Thermo Scientific	3051835	Can be substituted with other brands/models.
Cryotape	Section Lab	Cryofilm 2C
Roller	Electron Microscopy Sciences	62800-46	Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides	Electron Microscopy Sciences	71890-01	Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides	Thermo Scientific	3051	Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61	Norland Optical	Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light	General Electric	F15T8-BLB
Glacial acetic acid	Sigma Aldrich	ARK2183	Multiple suppliers available.
Chitosan	Sigma Aldrich	C3646	Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres	ThermoFisher Scientific	I-14787
InSpeck green microspheres	ThermoFisher Scientific	I-14785
Calcein Blue	Sigma Aldrich	M1255	Multiple suppliers available.
Calcein	Sigma Aldrich	C0875	Multiple suppliers available.
Alizarin complexone	Sigma Aldrich	A3882	Multiple suppliers available.
Demeclocycline	Sigma Aldrich	D6140	Multiple suppliers available.
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761	Multiple suppliers available.
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate	ThermoFisher Scientific	E-6588
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain)	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	R37108	Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous	Sigma Aldrich	S2889	Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate	Sigma Aldrich	T6521	Multiple suppliers available.
Sodium nitrite	Sigma Aldrich	S2252	Multiple suppliers available.
Tris	Sigma Aldrich	15504	Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate	Sigma Aldrich	M9272	Multiple suppliers available.
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt	Sigma Aldrich	F8764	Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX	Sigma Aldrich	N4875	Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide	Sigma Aldrich	D158550	Multiple suppliers available.
Toluidine blue O	Sigma Aldrich	T3260	Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1	Carl Zeiss AG	Axio Scan.Z1	Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set	Chroma Technology Corp.	49000
CFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49001
GFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49020
YFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set	Chroma Technology Corp.	custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set	Chroma Technology Corp.	49004
Cy5 Filter Set	Chroma Technology Corp.	49009
CryoJane Tape Transfer System	Electron Microscopy Sciences	62800-10	Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows	Electron Microscopy Sciences	62800-72	Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides	Electron Microscopy Sciences	62800-4X	Multiple suppliers available.