À haut débit, multi-images Cryohistology de minéralisés Tissues

Résumé

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

Résumé

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

Introduction

La recherche biologique nécessite souvent phénotypage efficace, qui est souvent associée à une sorte d'analyse histologique ^1-3. Ce besoin est encore plus évident avec les projets ambitieux de perturber chaque gène dans le génome de la souris ^4. Ces analyses histologiques peuvent varier d'évaluer la morphologie des cellules et / ou des caractéristiques anatomiques de l'expression de la cartographie de gènes ou de protéines spécifiques aux cellules individuelles. En fait, l'un des apports fondamentaux de l'histologie au domaine de la génomique est la possibilité d'associer un signal moléculaire spécifique à une région ou d'une cellule de type spécifique.

Les méthodes traditionnelles de l'histologie, en particulier pour les tissus musculo-squelettiques, sont souvent longue et laborieuse, nécessitant parfois des semaines pour fixer, détartrer, section, tache, et l'image de l'échantillon, puis d'analyser les images via l'interprétation humaine. L' analyse des signaux moléculaires multiples, que ce soit par immunohistochimie, hybridizat in situion, ou des colorations spéciales, nécessite de multiples sections et même des échantillons multiples pour effectuer de manière appropriée. En outre, ces réponses multiples ne peuvent pas être co-localisés à la même cellule et parfois ne peuvent pas être co-localisée à une région spécifique dans un échantillon donné. Comme le domaine de la génomique et épigénomique se déplace dans l'ère numérique, le champ histologique doit également suivre pour fournir efficace, à haut débit, et l'analyse automatisée d'une variété de signaux moléculaires dans une coupe histologique unique.

En effet, il existe une demande pour une amélioration des techniques histologiques qui peuvent associer des signaux moléculaires multiples à des cellules spécifiques dans un échantillon donné. Récemment, nous avons publié un nouveau haut-débit méthode cryohistological pour évaluer plusieurs mesures d'intervention au sein d' une section donnée de tissu minéralisé ^5-14. Le procédé consiste à stabiliser la cryosection avec cryotape congelé, faire adhérer l'article collé de façon rigide sur une lame de microscope, etla réalisation de plusieurs cycles de coloration et de l'imagerie sur chaque section. Ces séries d'images sont ensuite alignées manuellement ou grâce à l' automatisation de l' ordinateur avant l'analyse de l' image (figure 1). Ici, nous présentons des protocoles détaillés de ce processus et de fournir des exemples où ces techniques ont amélioré notre compréhension des différents processus biologiques.

Protocole

L'Université du Connecticut Health Center protection des animaux et l'utilisation comité a approuvé toutes les procédures animales.

1. Fixation and Embedding

1. Euthanasier l'animal via CO ₂ asphyxie ou d' autres méthodes approuvées.
2. Récolter le tissu d'intérêt (par exemple, des membres, des vertèbres, etc.) et dans 10% du formol tamponné neutre à 4 ° C jusqu'à ce que fixé correctement. Faites attention à maintenir le placement anatomique cohérente avant la fixation. Par exemple, fixer des membres avec des joints à la flexion constante, la rotation interne et rotation externe des angles ^11. En règle générale, fixer des membres entiers de souris pour 1 - 3 jours.
   Attention: Formol est toxique et doit être manipulé dans une hotte, tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.
   Remarque: Le délai de la fixation dépend de la taille de l'échantillon. Si l'expérience permet, coupe ouverte l'os permettra d'améliorer la fixation du compartiment de la moelle.Certains échantillons peuvent nécessiter une perfusion de fixation ¹⁵ afin de minimiser fond fluorescent (par exemple, des signaux de fluorescence faibles à l'intérieur de la moelle osseuse).
3. Transfert des spécimens de formaline à 30% de saccharose made in 1x PBS et incuber pendant 12-24 heures à 4 ° C.
   Note: Une fois mis à incuber pendant 12-24 heures, les échantillons peuvent alors être placés à -80 ° C pour le stockage à long terme. Cette méthode de stockage est recommandé pour des expériences dans lesquelles les chercheurs ont l' intention d'intégrer plusieurs échantillons dans le même bloc , mais ne peuvent pas récolter tous ces échantillons en même temps (par exemple, des expériences avec de multiples points de temps).
4. Retirer les échantillons du saccharose et disséquer les tissus en excès.
5. Remplir un cryomoule (taille du moule dépend de la taille de l'échantillon) une partie du chemin avec cryo milieu d'inclusion. Placer l'échantillon dans le moule de telle sorte que plan de coupe de la région d'intérêt est parallèle au fond du moule.
   Note: Un exemple de placement de tissu spécifique et de l'orientationpeut être trouvé dans la figure 2A - B.
6. Placez le cryomoule sur un morceau de glace sèche jusqu'à ce qu'une mince couche de cryo enrobage gèle moyennes et fixe ensuite l'échantillon en place. Remplissez le reste du volume du cryomoule avec cryo milieu d'inclusion tout en maintenant la cryomoule sur le culot de glace carbonique.
7. Placez le cryomoule dans un récipient contenant du 2-méthyl-butane pré-refroidi par de la glace sèche. Une fois que les échantillons sont complètement gelés, enlever cryomoules et secouer l'excédent de 2-méthyl-butane. Enveloppez cryomoules en cellophane et placer dans un -20 ° C ou -80 ° C congélateur pour le stockage.
   Note: Les échantillons peuvent sécher au fil du temps lorsqu'ils sont stockés dans cryo milieu d'inclusion, en particulier à -20 ° C. Nous vous recommandons le stockage des échantillons pendant plus de 1 - 2 mois en cryo milieu d'inclusion à -80 ° C ou à 30% de saccharose à -80 ° C (voir l'étape 1.3).

2. Sectionnement Tissue Tape-stabilisé

1. Retirer les blocs d'échantillons du congélateur et placer dans cryostat avec la température réglée entre -20 et -25 ° C.
2. Retirez le bloc de la cryomoule et couper l'excès de cryo intégration moyenne avec une lame de rasoir.
3. Placer un certain milieu cryogène enrobage sur le disque de spécimen, puis aligner le bloc de telle sorte que la surface du disque d'échantillon est parallèle à la surface inférieure du bloc établissant ainsi le plan de coupe approprié pour la région d'intérêt.
4. Placez le disque de l'échantillon dans le cryostat et permettre la cryo enrobage moyen de geler.
5. Placez le disque de l'échantillon sur la tête de l'objet et d'ajuster la tête de telle sorte que la lame coupe parallèles à la surface du bloc de l'échantillon.
6. Coupez le bloc vers le bas à un niveau dans la région d'intérêt et de brosser les copeaux de la surface du bloc.
7. Coupez un morceau de l'cryotape assez grand pour couvrir la région d'intérêt et de pré-refroidissement dans le cryostat.
   Remarque: Plusieurs pièces peuvent être coupées de tailles cohérentes et stockées dans le cryostau cours de la coupe.
8. Retirer support non-adhérente du cryotape en saisissant la bande par les onglets non-collante argent / or en utilisant une pince, puis placer le ruban sur le bloc collant vers le bas.
9. Appliquer une pression sur la cryotape l' aide du rouleau (figure 2C).
10. Faire une section (5-8 pm) en utilisant soit le moteur automatique ou roue de coupe manuelle du cryostat.
    Note: Il est recommandé de maintenir le bord de la cryotape comme il vient sur ​​la scène de telle sorte que la section ne tombe pas hors de la scène pendant la coupe (figure 2D).
11. Placer le côté section de tissu sur une lame de microscope en plastique à l'intérieur du cryostat.
12. Retirer la lame plastique du cryostat et laisser le milieu cryogène enrobage à l'état fondu de telle sorte que la partie adhère à la surface de la lame.
13. Répétez la coupe pour les sections de série ou d'autres régions d'intérêt.
14. Une fois terminé, stocker les sections dans une boîte de diapositives at 4, -20 ou -80 ° C en fonction de la durée de stockage nécessaire et que les mesures d'intervention en aval. Par exemple, utiliser des diapositives qui vont être colorées pour l'activité enzymatique (voir 05/02 à 05/03) dans un mois si elle est conservée à 4 ° C.

3. Adhérence des articles à Microscope Slides

1. méthode adhésif à séchage UV.
   1. Étiquette de la lame de microscope.
      Remarque: Pour une automatisation accrue, des échantillons et des diapositives peuvent être étiquetés avec des codes-barres.
   2. Appliquer une goutte de colle optique activé par UV à deux lames de verre et en utilisant le bord d'une lame en matière plastique pour étaler une mince couche d'adhésif sur la surface des lames de verre.
   3. Couper l'onglet argent / or et de jeter le côté enregistré section de tissu sur l'adhésif de la première diapositive. Appliquer la section dans un mouvement de roulis d'un bord à l'autre afin de minimiser la formation de bulles piégées en dessous de la bande.
      NOTE: La première diapositive est utilisé pour pré-mouiller la face inférieure de til tape avant de le placer sur la deuxième diapositive (permanent) (étape 3.1.4).
   4. Retirer la section enregistrée depuis la première diapositive et placez - le sur la couche d'adhésif de la deuxième glissière (figure 3A). Encore une fois, prenez soin d'éviter d'emprisonner des bulles.
      REMARQUE: Cette étape prend la pratique à maîtriser.
   5. Une fois que le nombre approprié de sections pour l'expérience donnée est placée sur chaque diapositive, essuyez l'excédent de colle des zones environnantes.
   6. Inspectez chaque section près de bulles ou de fibres en dessous de la bande. Effectuez cette inspection sous un verre de microscope ou loupe. S'il y a des obstructions, retirez la section individuelle, enlever les obstacles, puis réappliquer à la lame de verre.
   7. Une fois qu'il est déterminé qu'il n'y a aucun obstacle dans les sections soudées, placer les lames de microscope sous la lumière noire UV pendant 5 - 10 min pour réticuler l'adhésif.
2. Procédé adhésif chitosan.
   1. Préparer ee 1% adhésive chitosane. Préparer une solution d'acide acétique en dissolvant 0,25 ml d'acide acétique concentré dans 100 ml d'eau déminéralisée (0,25% v / v). Dissoudre 1 g de poudre de chitosane dans 100 ml d'une solution d'acide acétique et on agite la solution O / N ou jusqu'à ce que toute la poudre de chitosan est dissous.
      NOTE: La solution est stable à la température ambiante.
   2. Déposer une goutte de solution de chitosane pour chaque section qui sera placé sur la diapositive.
   3. Couper l'onglet argent / or de la bande et placer chaque côté du tissu de la section enregistrée vers le haut sur ​​l'adhésif (figure 3A). Utilisez grand soin pour éviter d'emprisonner des bulles.
   4. Une fois que toutes les sections sont placées sur la diapositive, inclinez le glisser vers le haut sur un de ses bords longs et faites glisser chitosane excessive sur le bord inférieur en utilisant une pince.
   5. Placer les lames dans cette orientation, sur une serviette en papier dans une boîte coulissante. Gravity va alors provoquer l'excès de chitosane à tomber sur la serviette, ce qui donne une couche plate et uniforme de chitosane.
   6. PlaÇe la boîte de diapositives avec son couvercle maintenue ouverte dans le réfrigérateur O / N pour permettre le chitosane sécher.
      NOTE: Voir le tableau 1 pour une comparaison entre les deux méthodes adhésives.

4. Application des marqueurs de référence aux diapositives

1. Préparer une solution de marqueur de référence en dissolvant 50 ul de vert et de 50 ul de microsphères rouges dans 100 pl d'eau. Conserver la solution dans l'obscurité à 4 ° C.
2. Placez une pointe de pipette 10 pi ou 20 pi dans la solution de microsphère. Ajouter une petite goutte de la solution de la microsphère à chaque section adjacente à la région d'intérêt (figure 3C). Faites attention à ne pas obtenir les microsphères dans la région d'intérêt.
3. Sécher les lames à RT (abri de la lumière) pendant 30 min, si le traitement des diapositives sur ce jour-là. Sinon, placez les lames dans une boîte de glissement à 4 ° C.
   Nota: Tant que la solution de microsphère sèche avant l'hydratation des diapositives, le microspheres resteront adhéré aux diapositives pendant plusieurs cycles de coloration / imagerie.

5. Rounds multiples de Coloration

NOTE: En choisissant une séquence compatible avec l'imagerie, la coloration, et les étapes de réimagerie, il est possible de détecter et de co-localiser de nombreux signaux biologiques sur la même coupe de tissu. Chaque tour de l'imagerie / coloration / réimagerie doit être mis au point pour la question histologique particulier. La séquence d' imagerie / coloration / réimagerie implique généralement l' acquisition des signaux fluorescents endogènes (par exemple, la GFP cellulaire, des colorants de minéralisation, in vivo des sondes d'imagerie) sur le premier tour de l' imagerie suivie par immunocoloration multiplexé fluorescent et plusieurs cycles de taches d'activité enzymatique. Enfin, la section peut être teinté en utilisant des colorants chromogènes (par exemple, H & E, toluidine bleu, safranine O, etc.) pour mettre en évidence l'architecture tissulaire. Présenté dans cette section sont des méthodes personnalisées adaptées deles protocoles disponibles dans le commerce.

1. Calcéine coloration bleu pour minéraux accumulés
   NOTE: calcéine coloration au bleu donne une surface minérale cohérente qui se prête à l'analyse automatisée de l'image à la différence de contraste darkfield ou interférence différentiel (DIC) imagerie. Le problème avec coloration au bleu calcéine est que le spectre fluorescent chevauche la tétracycline et l' étiquetage demeclocycline. Par conséquent, si l'échantillon contient ces étiquettes minérales, image les étiquettes dans le premier tour de l' imagerie avant la coloration avec le bleu de calcéine.
   1. Si les signaux endogènes dans le tissu sont imagées avant cette étape de coloration, submerger les diapositives de la ronde d'imagerie précédente dans un bocal de Coplin remplie de 1xPBS jusqu'à ce que les lamelles tombent loin des diapositives. Retirer et sécher les lamelles.
   2. Préparer 30 mg / ml de solution de bleu de calcéine à 2% de NaHCO ₃ (préparée en dissolvant 2 g de _NaHCO3 dans 100 ml d' H ₂ O et s'adaptertion à un pH de 7,4 avec HCl). Aliquoter et stocker la solution à -20 ° C.
   3. Immerger les lames dans un bocal de Coplin contenant 1x PBS pendant 15 minutes pour hydrater les sections, sinon déjà hydraté du tour précédent.
   4. Retirez les diapositives et sécher le dos et les bords avec une serviette en papier.
   5. Appliquer 100 - 500 pi de solution de bleu de calcéine par lame et incuber pendant 10 min dans une chambre humide à température ambiante.
   6. Rincer les lames dans 1x PBS pendant 10 min avec 3 changements.
   7. Appliquer ~ 200 pi de 50% de glycérol dans du PBS 1X à chaque diapositive et monter la lamelle.
   8. Enlever l'excès de glycérol et sécher le fond des diapositives.
2. Phosphatase acide tartrate-résistante (TRAP) enzymatique de coloration de l' activité
   NOTE: TRAP est exprimée par plusieurs types de cellules dans la lignée hématopoïétique, y compris les ostéoclastes. La coloration TRAP présentée ici utilise un substrat de la phosphatase acide jaune fluorescent. Certains signaux fluorescents seront ovERLAP avec le jeu de filtre jaune personnalisé y compris les étiquettes de tétracycline / demeclocycline de minéralisation, calcéine bleuissement et DAPI de contraste.
   1. Immerger les lames de la ronde d'imagerie précédente dans un bocal de Coplin remplie 1x PBS jusqu'à ce que les lamelles tombent loin des diapositives. Retirer et sécher les lamelles.
   2. Préparer le tampon 1, en dissolvant 9,2 g d'acétate de sodium anhydre et 11,4 g de tartrate de sodium dibasique dihydraté dans de l'eau et en portant le volume final à 1000 ml. Ajuster le pH à 4,2 avec de l'acide concentré acétique glacial (environ 1,5 - 2 ml). Conserver la solution à 4 ° C pendant jusqu'à 12 mois.
   3. Préparer le tampon 2 en dissolvant 40 mg de nitrite de sodium dans l'eau et en portant le volume final à 1 ml. Conserver la solution à 4 ° C pendant 1 semaine.
   4. Le jour de la coloration, préparer le tampon de réaction en mélangeant 7,5 ml de tampon 1 et 150 ul de tampon 2.
   5. Appliquer le tampon de réaction sans le substrat à la glissières pendant 10 - 15 minutes pour équilibrer le tissu au pH inférieur.
      NOTE: Le volume typique est ~ 200 pi, mais doit être suffisamment large pour couvrir toutes les sections.
   6. On dilue le substrat fluorescent de la phosphatase acide jaune entre 1:50 et 1: 100 dans le tampon de réaction.
      REMARQUE: La dilution sera dictée par l'activité de TRAP dans l'échantillon.
   7. Verser le tampon de réaction hors des glissières et d'appliquer le tampon de réaction avec le substrat fluorescent jaune sur les lames.
   8. Placer les lames sous la lumière noire UV pour ~ 5 min pour activer le substrat.
      NOTE: Le temps d'incubation peut varier en fonction de l'activité de TRAP dans l'échantillon.
   9. Rincer les lames dans 1x PBS pendant 10 min avec 3 changements.
   10. Appliquer ~ 200 pi de 50% de glycérol dans du PBS 1X à chaque diapositive et monter la lamelle.
   11. Enlever l'excès de glycérol et sécher le fond des diapositives.
       REMARQUE: Le tampon de TRAP acide sera détartrer les sections. L'avantage supplémentaire de l'decalcification est que certaines couleurs seront à nouveau disponibles pour la coloration aval (par exemple, des étiquettes de minéralisation). Par exemple, la coloration au bleu de calcéine sera supprimé lors de la coloration TRAP. Par conséquent, DAPI de contraste peut être imagée dans ce canal pendant un tour ultérieur.
3. La phosphatase alcaline (AP) activité enzymatique coloration
   REMARQUE: plusieurs types de cellules impliquées dans la minéralisation, y compris les ostéoblastes et chondrocytes minéralisateurs exprimer AP. Le substrat Fast Red utilisé dans ce protocole suscite à la fois un signal fluorescent rouge et chromogène rouge. De ce fait, le substrat chromogène sera étancher des signaux fluorescents dans les régions où le substrat précipite. Par conséquent, il est préférable de faire cette tache après l'imagerie des signaux fluorescents qui peuvent être trempés par le substrat AP.
   1. Immerger les lames de la ronde d'imagerie précédente dans un bocal de Coplin remplie 1x PBS jusqu'à ce que les lamelles tombent loin des diapositives. Remove et sécher les lamelles.
   2. Préparer Tris 1 M en dissolvant 12,1 g de Tris dans 100 ml d'eau. Ajuster le pH à 9,5 avec 1 M de NaOH.
   3. Préparer 1 M MgCl ₂ hexahydraté en dissolvant 20,33 g de MgCl ₂ dans 100 ml d'eau déminéralisée.
   4. Préparer NaCl 2 M en dissolvant 11,68 g de NaCl dans 100 ml d'eau déminéralisée.
   5. Préparer 100x (20 mg / ml) solution mère de Fast Red TR sel en dissolvant 1 g de poudre dans 50 ml d'eau déminéralisée. Faire 100 aliquotes ul et conserver à -20 ° C.
   6. Préparer 100x (10 mg / ml) de solution de naphtol AS-MX phosphate en dissolvant 500 mg de poudre dans 50 ml de N, N diméthylformamide. Faire 100 aliquotes ul et conserver à -20 ° C.
   7. Le jour de la coloration, la préparation du tampon AP en ajoutant 1 ml de Tris 1 M, 0,5 ml de 1 M de _MgCl2, 0,5 ml de NaCl 2 M et amener le volume final à 10 ml avec de l' eau déminéralisée (concentration finale: 100 mM tris, 50 mM de _MgCl2, 100 mM de NaCl).
   8. Placez AP buffer sur chaque lame et incuber dans une chambre humide pendant 10 min à température ambiante.
   9. Préparer un tampon de substrat AP en diluant 100x stocks de Fast Red TR Sel et naphtol AS-MX à 1x dans le tampon AP.
   10. Verser le tampon AP off de diapositives et remplacer avec un tampon de substrat de AP. Incuber les lames pendant 5 - 10 minutes dans une chambre humide à la température ambiante.
       NOTE: Le temps d'incubation sera dictée par l'activité AP de l'échantillon.
   11. Laver les lames 3x 1x PBS pendant 5 minutes chacun.
   12. Monter le couvercle glisse avec une solution DAPI de contre-coloration (1: 1000 dilution de DAPI dans 50% de glycérol dans 1x PBS).
4. O bleu Toluidine (TB) coloration chromogène
   NOTE: Parce que toutes les étapes précédentes sont imagés dans le montage aqueux temporaire dans 50% de glycérol / solution PBS, l'étape chromogène est également reproduite dans des conditions aqueuses. Cependant, la solution de coloration peut avoir tendance à lixivier au fil du temps. Par conséquent, il est suggéré à l'image du bleu de toluidine le plus tôt possible après coloration.
   1. Immerger diapositives de tour précédent d'imagerie dans un bocal de Coplin remplie d'eau déminéralisée jusqu'à ce que les lamelles tombent loin des diapositives. Retirer et sécher les lamelles.
   2. Après avoir enlevé les lamelles, remplacer l'eau douce et incuber les lames pendant au moins 10 minutes afin que les sels de PBS sont suffisamment éliminés du tissu.
   3. Préparer la solution de TB 0,025% dans l'eau déminéralisée.
   4. Placer les lames dans la solution de TB pendant 1 - 5 min.
      NOTE: Le temps d'incubation dépend de la préférence de l'utilisateur, mais doit rester cohérente dans tous les échantillons.
   5. Placer les lames dans le récipient du Coplin avec toboggans et de lavage désionisée 3x pendant 5 minutes chacun.
   6. Mont lamelle avec 30% de glycérol dissous dans de l' eau déminéralisée (PAS 1x PBS car cela provoquerait la tache de lessivage à partir du tissu). REMARQUE: Glycérine moyen de montage peut être substitué par un sirop de fructose, ce qui contribue à empêcher la diffusion du colorant à partir du tissu. Àpréparer le sirop de fructose, on dissout 30 g de fructose dans 10 ml d'eau déminéralisée et on chauffe à 60 ° C jusqu'à dissolution.

6. Rounds multiples d'imagerie

1. Charger les lames dans les plateaux de microscope (Figure 3D).
   Remarque: Les plateaux sont à ressort.
2. Insérer les plateaux dans la pile de plateaux du microscope à balayage à glissière (figure 3E).
3. Cliquez sur la liste des profils pour charger un profil pour chaque diapositive avec des temps d'exposition appropriés pour chaque fluorophore. Cliquez sur le nom de la diapositive pour nommer chaque diapositive manuellement ou le logiciel lire le code-barres sur l'étiquette de la diapositive. Cliquez sur le bouton de démarrage aperçu de balayage pour prendre une image d'aperçu de la diapositive.
4. Définissez les régions d'intérêt dans l'assistant de détection des tissus et les enregistrer pour les cycles suivants de l'imagerie. Une fois que chaque diapositive est configuré, démarrer le processus d'analyse en cliquant sur le bouton de balayage de départ.
   Remarque: Le système peut contenir jusqu'à 100 slides à la fois.
5. Une fois que l'imagerie est terminée, exporter les images de chaque canal et de l'imagerie ronde individuelle comme .tif ou .jpg pour l'assemblage et l'analyse d'images.

7. Photo Assemblée

1. Méthode manuelle en utilisant Photoshop (ou un logiciel de retouche d'image similaire capable de produire des images en couches).
   1. Ouvrez chaque image individuelle de canal de chaque tour d'imagerie.
   2. Assembler les images individuelles en tant que couches au sein d'une image composite. Pour ce faire, cliquez sur le calque dans la palette de couches d'une image. Ensuite, faites glisser la couche sur une autre image. Cette opération de glisser-déposer va créer une nouvelle couche dans l'image. Pour ce faire, pour toutes les autres images. Vous pouvez également utiliser un script (Fichier> Scripts> Fichiers de charge dans la pile ...) pour automatiser ce processus en chargeant plusieurs fichiers image sous forme de couches dans une pile d'images.
   3. Une fois que chaque image est répertorié comme une couche individuelle dans l'image composite, double-cliquez sur le nom du calque pour renommer le layers que nécessaire pour discerner les différents canaux.
   4. Afin de voir à travers chaque couche et créer une image vraiment composite, changer le mode de fusion pour chaque couche de "Normal" à "Screen" dans la palette des calques.
      Remarque: Pour accélérer cette étape, changer une seule couche à l'écran, puis cliquez-droit sur la couche, sélectionnez "style de calque de copie", puis mettez en surbrillance toutes les autres couches et sélectionnez "pâte style de calque" pour appliquer le style de l'écran à l'autre couches.
   5. Si vous le souhaitez, diminuer l'opacité (changement de la valeur à 10-40%) de la couche chromogène (c. -à- bleu de toluidine) pour mieux visualiser les signaux fluorescents à travers la couche chromogène.
      Remarque: le microscope à balayage en mosaïque utilisé dans ce protocole contient les diapositives sur 3 bords, ce qui réduit la quantité de rotation qui peut se produire à la lame au cours de chaque cycle de formation d'image. Par conséquent, il est beaucoup plus facile pour l'utilisateur d'aligner manuellement les images sans avoir à faire pivoter les images dérivéesà partir de différents cycles de formation d'image.

Résultats

Un flux de travail général pour le haut-débit, multi-images Cryohistology

La figure 1 représente le processus général utilisé pour cette technique. Il comprend plusieurs étapes de fixation à travers plusieurs cycles de l'imagerie et enfin l'image d'alignement / analyse. Le processus peut prendre aussi peu que d'une semaine pour aller de l'échantil...

Discussion

Ici, nous avons présenté un protocole de cryohistology détaillé pour co-localiser et quantifier plusieurs mesures biologiques en alignant les images provenant de plusieurs cycles de coloration / imagerie sur une seule section. La méthode décrite à l' aide de la cryotape est particulièrement utile car il conserve la morphologie des tissus difficiles à la section (par exemple, os minéralisé et le cartilage). En outre, le tissu sectionné adhère fermement à la lame de verre, ce qui permet plusieur...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128-4L	Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378	Multiple suppliers available.
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Multiple suppliers available.
Cryomolds	Fisher Scientific	Fisherbrand #22-363-554	Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix	Thermo Scientific	6769006	Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane	Sigma Aldrich	M32631	Multiple suppliers available.
Cryostat	Leica Biosystems	3050s	Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc	Leica Biosystems	14037008587	Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades	Thermo Scientific	3051835	Can be substituted with other brands/models.
Cryotape	Section Lab	Cryofilm 2C
Roller	Electron Microscopy Sciences	62800-46	Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides	Electron Microscopy Sciences	71890-01	Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides	Thermo Scientific	3051	Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61	Norland Optical	Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light	General Electric	F15T8-BLB
Glacial acetic acid	Sigma Aldrich	ARK2183	Multiple suppliers available.
Chitosan	Sigma Aldrich	C3646	Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres	ThermoFisher Scientific	I-14787
InSpeck green microspheres	ThermoFisher Scientific	I-14785
Calcein Blue	Sigma Aldrich	M1255	Multiple suppliers available.
Calcein	Sigma Aldrich	C0875	Multiple suppliers available.
Alizarin complexone	Sigma Aldrich	A3882	Multiple suppliers available.
Demeclocycline	Sigma Aldrich	D6140	Multiple suppliers available.
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761	Multiple suppliers available.
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate	ThermoFisher Scientific	E-6588
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain)	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	R37108	Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous	Sigma Aldrich	S2889	Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate	Sigma Aldrich	T6521	Multiple suppliers available.
Sodium nitrite	Sigma Aldrich	S2252	Multiple suppliers available.
Tris	Sigma Aldrich	15504	Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate	Sigma Aldrich	M9272	Multiple suppliers available.
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt	Sigma Aldrich	F8764	Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX	Sigma Aldrich	N4875	Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide	Sigma Aldrich	D158550	Multiple suppliers available.
Toluidine blue O	Sigma Aldrich	T3260	Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1	Carl Zeiss AG	Axio Scan.Z1	Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set	Chroma Technology Corp.	49000
CFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49001
GFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49020
YFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set	Chroma Technology Corp.	custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set	Chroma Technology Corp.	49004
Cy5 Filter Set	Chroma Technology Corp.	49009
CryoJane Tape Transfer System	Electron Microscopy Sciences	62800-10	Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows	Electron Microscopy Sciences	62800-72	Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides	Electron Microscopy Sciences	62800-4X	Multiple suppliers available.