-High Throughput, Multi-Image Cryohistology di mineralizzati tessuti

Riepilogo

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

Abstract

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

Introduzione

La ricerca biologica richiede spesso fenotipizzazione efficiente, che è frequentemente associata con una sorta di analisi istologica ^1-3. Questa necessità è ancora più evidente con progetti ambiziosi per interrompere ogni gene nel genoma murino ^4. Queste analisi istologiche possono variare da valutare la morfologia delle cellule e / o le caratteristiche anatomiche di espressione mappatura di specifici geni o proteine ​​alle singole celle. Infatti, uno dei contributi fondamentali istologia al campo della genomica è la possibilità di associare un segnale molecolare specifico per una regione o cella specifica tipologia.

I metodi tradizionali di istologia, in particolare per i tessuti muscolo-scheletrici, sono spesso in termini di tempo e laborioso, che richiede a volte settimane per riparare, Decalcificare, sezione, macchia, e l'immagine del campione poi analizzare le immagini tramite interpretazione umana. Analizzando i segnali molecolari multipli, sia tramite immunoistochimica, in situ hybridizatione, o colorazioni speciali, richiede più sezioni e anche campioni multipli per eseguire in modo appropriato. Inoltre, queste risposte multiple non possono essere co-localizzate alla stessa cella e talvolta non possono essere co-localizzato ad una regione specifica all'interno di un dato campione. Come il campo della genomica e epigenomics muove nell'era digitale, il campo istologico deve seguire l'esempio di fornire efficiente e di alta produttività, e l'analisi automatizzata di una varietà di segnali molecolari all'interno di una singola sezione istologica.

Infatti, vi è una domanda per il miglioramento delle tecniche istologiche che possono associare segnali molecolari multipli a cellule specifiche all'interno di un dato campione. Recentemente, abbiamo pubblicato un nuovo metodo cryohistological high-throughput per valutare diverse misure di risposta all'interno di una data sezione di tessuto mineralizzato ^5-14. Il processo prevede la stabilizzazione del cryosection con cryotape congelati, aderendo alla sezione registrata rigidamente ad un vetrino da microscopio, elo svolgimento di diversi cicli di colorazione e di imaging su ogni sezione. Questi cicli di immagini vengono quindi allineati manualmente o tramite computer automazione prima analisi di immagine (Figura 1). Qui, vi presentiamo protocolli dettagliati di questo processo e fornire esempi in cui queste tecniche hanno migliorato la nostra comprensione dei diversi processi biologici.

Protocollo

L'Università del Connecticut Health Center comitato cura degli animali istituzionale e l'uso approvato tutte le procedure animali.

1. Fissazione e Embedding

1. Eutanasia dell'animale tramite CO ₂ asfissia o altri metodi approvati.
2. Raccogliere il tessuto di interesse (ad esempio, degli arti, vertebre, etc.) e il luogo nel 10% formalina tamponata neutra a 4 ° C fino fissata correttamente. Fare particolare attenzione a mantenere la collocazione anatomica coerente prima della fissazione. Per esempio, fissare gli arti con giunti a flessione costante, rotazione interna e rotazione esterna angoli ^11. In genere, correggere gli arti interi del mouse per 1 - 3 giorni.
   Attenzione: formalina è tossico e deve essere manipolato in una cappa aspirante indossando opportuni dispositivi di protezione individuale.
   Nota: I tempi di fissaggio dipende dalle dimensioni del campione. Se l'esperimento permette, tagliare aperta l'osso migliorerà fissaggio del vano osseo.Alcuni esemplari possono richiedere la perfusione di fissaggio ¹⁵ per minimizzare sfondo fluorescente (ad esempio i segnali fluorescenti deboli all'interno del midollo osseo).
3. Trasferire i campioni da formalina al 30% di saccarosio made in 1x PBS e incubare per 12 - 24 ore a 4 ° C.
   Nota: una volta incubato per 12 - 24 ore, i campioni possono essere messi a -80 ° C per una conservazione a lungo termine. Questo metodo è consigliato di immagazzinaggio per esperimenti in cui i ricercatori intendono incorporare campioni multipli nello stesso blocco, ma non possono raccogliere tutti questi campioni allo stesso tempo (ad esempio, esperimenti con più punti di tempo).
4. Rimuovere i campioni dal saccarosio e sezionare via qualsiasi tessuto in eccesso.
5. Riempire una cryomold (dimensione di muffe dipende dalla dimensione del campione) un pezzo di strada con crio mezzo di inclusione. Posizionare campione in stampo tale piano di taglio per la regione di interesse è parallelo al fondo dello stampo.
   Nota: Un esempio di posizionamento tessuto specifico e l'orientamentopuò essere trovato in Figura 2A - B.
6. Posizionare il cryomold su un pezzo di ghiaccio secco fino a un sottile strato di crio embedding blocca medie e corregge successivamente il campione al suo posto. Riempire il volume rimanente del cryomold con crio mezzo di inclusione mantenendo la cryomold sul pellet di ghiaccio secco.
7. Posizionare il cryomold in un recipiente contenente 2-metil-butano pre-raffreddata mediante ghiaccio secco. Una volta che i campioni sono completamente congelati, rimuovere cryomolds e scrollarsi di dosso l'eccesso 2-metil-butano. Avvolgere cryomolds in cellophane e posto in una -20 ° C o -80 ° C per una conservazione.
   Nota: I campioni possono seccare nel tempo se conservato in crio mezzo di inclusione, soprattutto a -20 ° C. Si consiglia di conservazione dei campioni per più di 1 - 2 mesi di crio mezzo di inclusione a -80 ° C o nel 30% di saccarosio a -80 ° C (vedi punto 1.3).

2. tessuto sezionamento Tape-stabilizzato

1. Rimuovere i blocchi di campioni dal congelatore e mettere in cryostat con la temperatura impostata fra -20 e -25 ° C.
2. Rimuovere il blocco dal cryomold e tagliare l'eccesso di crio mezzo di inclusione con una lama di rasoio.
3. Porre un crio mezzo di inclusione sul disco dei campioni e quindi allineare il blocco in modo che la superficie del disco di preparato è parallela alla superficie inferiore del blocco stabilendo così il piano di taglio corretta per la regione di interesse.
4. Inserire il disco di preparato nel criostato e consentire la crio mezzo di inclusione di congelare.
5. Posizionare il disco di preparato sulla testa del preparato e regolare la testa in modo che la lama taglia paralleli alla superficie del blocco campione.
6. Tagliare il blocco fino ad un livello entro la regione di interesse e spazzolare i trucioli dalla superficie del blocco.
7. Tagliare un pezzo di cryotape abbastanza grande da coprire la regione di interesse e pre-raffreddamento nel criostato.
   Nota: pezzi multipli possono essere tagliati di misure coerenti e memorizzati all'interno del cryostin durante il sezionamento.
8. Rimuovere il sostegno non aderente dal cryotape afferrando il nastro dalle linguette non appiccicosa argento / oro con pinze quindi inserire il nastro sul blocco appiccicoso rivolto verso il basso.
9. Applicare pressione al cryotape con il rullo (Figura 2C).
10. Effettuare una sezione (5-8 micron) utilizzando il motore automatico o ruota di taglio manuale del criostato.
    Nota: E 'buona norma tenere il bordo del cryotape come viene sul palco in modo tale che la sezione non cade dal palco durante il sezionamento (Figura 2D).
11. Posizionare il lato sezione di tessuto su un vetrino da microscopio di plastica all'interno del criostato.
12. Rimuovere il vetrino plastica dal criostato e lasciare il mezzo crio incorporamento per fondere tale che la sezione aderisce alla superficie del vetrino.
13. Ripetere l'operazione di sezionamento per le sezioni di serie o in altre regioni di interesse.
14. Una volta terminato, memorizzare le sezioni in una scatola di presentazione di unt 4, -20 o -80 ° C a seconda della lunghezza di memoria richiesta e le misure di risposta a valle. Ad esempio, utilizzare le diapositive che stanno per essere macchiato per l'attività enzimatica (vedi 5,2-5,3) entro un mese se conservato a 4 ° C.

3. Adesione delle sezioni di vetrini da microscopio

1. Metodo di adesivi a polimerizzazione UV.
   1. Etichettare il vetrino da microscopio.
      Nota: Per maggiore automazione, i campioni e le diapositive possono essere etichettati con codici a barre.
   2. Applicare una goccia di adesivo ottico UV-attivato per due vetrini e usare il bordo di una slitta di plastica per diffondere un sottile strato di adesivo sulla superficie dei vetrini.
   3. Tagliare la scheda d'argento / oro e gettare il lato registrato sezione di tessuto sul collante della prima diapositiva. Applicare la sezione in un moto di rollio da un bordo all'altro per minimizzare la formazione di bolle intrappolate sotto il nastro.
      NOTA: La prima diapositiva viene utilizzato per pre-bagnare la parte inferiore di tegli nastro prima della sua immissione sul secondo vetrino (permanente) (fase 3.1.4).
   4. Rimuovere la sezione registrata dalla prima slitta e posizionarlo sullo strato adesivo della seconda slitta (Figura 3A). Anche in questo caso, fare attenzione ad evitare l'intrappolamento di bolle.
      NOTA: Questo passaggio richiede pratica per padroneggiare.
   5. Una volta che il numero appropriato di sezioni per il dato esperimento è posto su ogni diapositiva, pulire l'eccesso di adesivo dalle zone circostanti.
   6. Controllare ogni sezione attentamente per bolle o fibre sotto il nastro. Eseguire questa ispezione sotto una lente d'ingrandimento microscopio o. Se ci sono ostruzioni, rimuovere la sezione individuale, rimuovere le ostruzioni, e quindi nuovamente alla vetrino.
   7. Una volta che si è determinato che non ci siano ostacoli sotto le sezioni registrate, collocare i vetrini da microscopio sotto la luce nera UV per 5 - 10 minuti per reticolare l'adesivo.
2. metodo adesivo chitosano.
   1. preparare °e 1% adesivo chitosano. Preparare la soluzione di acido acetico sciogliendo 0,25 ml di acido acetico concentrato in 100 ml di acqua deionizzata (0,25% v / v). Sciogliere 1 g di polvere di chitosano in 100 ml di soluzione di acido acetico e agitare la soluzione O / N o fino a che la polvere chitosano è disciolto.
      NOTA: La soluzione è stabile a temperatura ambiente.
   2. Depositare una goccia di soluzione di chitosano per ogni sezione che verranno messi sul vetrino.
   3. Tagliare la scheda d'argento / oro del nastro e posizionare ogni lato nastro tessuto sezione su sopra l'adesivo (Figura 3A). Usare la massima cura per evitare l'intrappolamento di bolle.
   4. Una volta che tutte le sezioni sono poste sul vetrino, inclinare il vetrino su uno dei suoi bordi lunghi e trascinare chitosano eccessiva al bordo inferiore con pinze.
   5. Posizionare i vetrini in questo orientamento sopra un tovagliolo di carta in una scatola diapositiva. La gravità sarà quindi causare l'eccesso di chitosano a cadere verso il basso sulla asciugamano, ottenendo uno strato piatto e uniforme di chitosano.
   6. PlaCe la casella di scorrimento con il coperchio appoggiato aperta in frigorifero O / N per consentire il chitosano si asciughi.
      NOTA: Vedi Tabella 1 per un confronto tra i due metodi adesive.

4. Applicazione di riferimento marcatori di diapositive

1. Preparare la soluzione di riferimento marcatore sciogliendo 50 ml di verde e 50 ml di microsfere rossi in 100 ml di acqua. Conservare la soluzione al buio a 4 ° C.
2. Posizionare un 10 ml o 20 ml punta della pipetta nella soluzione di microsfere. Aggiungere una piccola goccia della soluzione microsfere a ciascuna sezione adiacente alla regione di interesse (Figura 3C). Fare attenzione a non ottenere le microsfere all'interno della regione di interesse.
3. Asciugare le diapositive a temperatura ambiente (al riparo dalla luce) per 30 minuti se l'elaborazione delle diapositive in quel giorno. In caso contrario, inserire le diapositive in una scatola di scorrimento a 4 ° C.
   Nota: Finché la soluzione microsfere asciuga prima idratare i vetrini, la microspheres rimarranno aderito alle diapositive durante vari cicli di colorazione / imaging.

5. vari cicli di colorazione

NOTA: Scegliendo una sequenza compatibile dell'imaging, colorazione, e gradini di re-imaging, è possibile rilevare e co-localizzare molti segnali biologici sulla stessa sezione di tessuto. Ogni round di immagini / colorazione / reimaging deve essere sviluppato per la particolare domanda istologico. La sequenza di immagini / colorazione / re-imaging in genere comporta l'acquisizione dei segnali fluorescenti endogeni (ad esempio, GFP cellulare, coloranti mineralizzazione, in vivo sonde di imaging) sul primo turno delle immagini a fluorescenza seguita da immunoistochimica multiplex e vari cicli di macchie di attività enzimatica. Infine, la sezione può essere colorato con coloranti cromogenici (ad esempio, H & E, blu di toluidina, safranina O, ecc) per evidenziare l'architettura dei tessuti. Presentati in questa sezione sono metodi personalizzati adattati daprotocolli disponibili commercialmente.

1. Calceina colorazione blu per minerale accumulato
   NOTA: Calceina blu colorazione produce una superficie minerale consistente che è suscettibile di analisi delle immagini automatizzata a differenza di contrasto campo scuro o interferenza differenziale (DIC) di imaging. Il problema con calceina colorazione blu è che lo spettro fluorescente sovrappone con tetraciclina ed etichettatura Demeclocycline. Pertanto, se il campione contiene queste etichette minerali, immagine delle etichette nel primo turno delle immagini prima della colorazione blu con calceina.
   1. Se i segnali endogeni all'interno del tessuto vengono esposte prima di questa fase di colorazione, immergere le diapositive dalla precedente turno di imaging in una vaschetta Coplin piena di 1XPBS fino a quando i coprioggetto cadono lontano dalle diapositive. Rimuovere e asciugare le coprioggetto.
   2. Preparare 30 mg / ml di soluzione di blu calceina in 2% NaHCO ₃ (preparata sciogliendo 2 g NaHCO ₃ in 100 ml di H ₂ O e regolarezione a pH di 7,4 con HCl). Aliquotare e conservare la soluzione a -20 ° C.
   3. Immergere i vetrini in una vaschetta Coplin contenente 1x PBS per 15 minuti per idratare le sezioni, se non è già idratato dal turno precedente.
   4. Rimuovere i vetrini e asciugare la parte posteriore ei bordi con un tovagliolo di carta.
   5. Applicare 100 - 500 ml di soluzione di blu calceina per vetrino e incubare per 10 minuti in una camera umida a temperatura ambiente.
   6. Sciacquare i vetrini in 1x PBS per 10 minuti con 3 cambi.
   7. Applicare ~ 200 ml di 50% glicerolo in PBS 1x per ogni diapositiva e montare il vetrino.
   8. Rimuovere l'eccesso di glicerolo e asciugare il fondo delle diapositive.
2. Tartrato-resistente all'acido fosfatasi (TRAP) enzimatica attività colorazione
   NOTA: TRAP è espresso da più tipi di cellule del lignaggio ematopoietico compreso osteoclasti. La colorazione TRAP qui presentata utilizza un substrato fluorescente fosfatasi acida di colore giallo. Alcuni segnali fluorescenti saranno OvERLAP con il set filtro giallo personalizzati tra cui tetracicline / etichette demeclociclina mineralizzazione, calceina macchia blu, e DAPI di contrasto.
   1. Immergere i vetrini dal precedente turno di imaging in una vaschetta Coplin piena di 1x PBS fino a quando i coprioggetto cadono lontano dalle diapositive. Rimuovere e asciugare le coprioggetto.
   2. Preparare Buffer 1 sciogliendo 9.2 g di sodio acetato anidro e 11,4 g di tartrato sodico bibasico diidrato in acqua e portando il volume finale a 1000 ml. Regolare il pH a 4,2 con acido acetico glaciale concentrato (~ 1,5 - 2 ml). Conservare la soluzione a 4 ° C per un massimo di 12 mesi.
   3. Preparare Buffer 2 sciogliendo 40 mg di nitrito di sodio in acqua e portando il volume finale a 1 ml. Conservare la soluzione a 4 ° C per 1 settimana.
   4. Il giorno della colorazione, preparare il tampone di reazione miscelando 7,5 ml di tampone 1 e 150 ml di tampone 2.
   5. Applicare il tampone di reazione senza il substrato alla slittas per 10 - 15 minuti per equilibrare il tessuto al pH inferiore.
      NOTA: Il volume tipico è ~ 200 microlitri, ma deve essere sufficientemente grande per coprire tutte le sezioni.
   6. Diluire fluorescente substrato fosfatasi acida giallo tra 1:50 e 1: 100 in tampone di reazione.
      NOTA: diluizione sarà dettata dalle attività TRAP all'interno del campione.
   7. Versare il tampone di reazione off delle diapositive e applicare il tampone di reazione con il substrato giallo fluorescente alle diapositive.
   8. Porre i vetrini sotto la luce nera UV per ~ 5 minuti per attivare il substrato.
      NOTA: il tempo di incubazione può variare in base all'attività TRAP all'interno del campione.
   9. Sciacquare i vetrini in 1x PBS per 10 minuti con 3 cambi.
   10. Applicare ~ 200 ml di 50% glicerolo in PBS 1x per ogni diapositiva e montare il vetrino.
   11. Rimuovere l'eccesso di glicerolo e asciugare il fondo delle diapositive.
       NOTA: Il buffer TRAP acida sarà decalcificazione sezioni. Il vantaggio del decalcificazione è che alcuni colori saranno di nuovo disponibili per la colorazione a valle (ad esempio, etichette mineralizzazione). Per esempio, la colorazione blu calceina verrà rimosso durante la colorazione TRAP. Pertanto, DAPI di contrasto può essere ripreso in questo canale durante un round successivo.
3. La fosfatasi alcalina (AP) attività enzimatica colorazione
   NOTA: più tipi di cellule coinvolte con mineralizzazione compresi osteoblasti e condrociti mineralizzanti esprimere AP. Il substrato Red veloce utilizzato in questo protocollo suscita sia un segnale rosso rosso e cromogenico fluorescente. A causa di questo, il substrato cromogenico spegnerà segnali fluorescenti nelle regioni dove il substrato precipitati. Pertanto, è meglio farlo macchia dopo l'imaging i segnali fluorescenti che possono essere placata dal substrato AP.
   1. Immergere i vetrini dal precedente turno di imaging in una vaschetta Coplin piena di 1x PBS fino a quando i coprioggetto cadono lontano dalle diapositive. Remove e asciugare i coprioggetto.
   2. Preparare 1 M Tris sciogliendo 12,1 g di Tris in 100 ml di acqua. Regolare il pH a 9,5 con 1 M NaOH.
   3. Preparare 1 M MgCl ₂ esaidrato sciogliendo 20,33 g di MgCl ₂ in 100 ml di acqua deionizzata.
   4. Preparare 2 M NaCl sciogliendo 11,68 g di NaCl in 100 ml di acqua deionizzata.
   5. Preparare 100x (20 mg / ml) soluzione stock di Fast Red TR Salt sciogliendo 1 g di polvere in 50 ml di acqua deionizzata. Fai aliquote di 100 microlitri e conservare a -20 ° C.
   6. Preparare 100x (10 mg / ml) naftol AS-MX fosfato di soluzione sciogliendo 500 mg di polvere in 50 ml di N, N dimetilformamide. Fai aliquote di 100 microlitri e conservare a -20 ° C.
   7. Il giorno della colorazione, preparare il tampone AP aggiungendo 1 ml di 1 M Tris, 0,5 ml di 1 M MgCl _2, 0,5 ml di 2 M NaCl e portare il volume finale a 10 ml con acqua deionizzata (concentrazioni finali: 100 mM Tris, 50 mM MgCl _2, 100 mM NaCl).
   8. Posizionare AP BUffer su ciascun vetrino e incubare in una camera umida per 10 minuti a RT.
   9. Preparare tampone substrato AP diluendo 100x scorte di Fast Red TR Sale e naftolo AS-MX a 1x nel buffer di AP.
   10. Versare tampone AP off di diapositive e sostituire con il tampone del substrato AP. Incubare i vetrini per 5 - 10 minuti in una camera umida a temperatura ambiente.
       NOTA: Il tempo di incubazione sarà dettata dall'attività AP del campione.
   11. Lavare i vetrini 3x in 1x PBS per 5 minuti ciascuna.
   12. Montare il coperchio scivola con la soluzione DAPI di contrasto (1: 1000 diluizione DAPI nel 50% glicerolo in PBS 1x).
4. Blu di toluidina O (TB) colorazione cromogenico
   NOTA: poiché tutti i passi precedenti vengono esposte sotto il montaggio acquosa temporanea in soluzione PBS 50% glicerolo /, il passo cromogenico viene anche ripreso in ambiente acquoso. Tuttavia, la soluzione colorante può tendere a percolare nel tempo. Pertanto, si consiglia di immagine blu toluidina appena possibile dopo la colorazione.
   1. Immergere i vetrini dalla precedente turno di imaging in una vaschetta Coplin riempita con acqua deionizzata fino a che le scivola copertura cadono lontano dalle diapositive. Rimuovere e asciugare le coprioggetto.
   2. Dopo aver rimosso i vetrini, sostituire con acqua fresca e incubare i vetrini per almeno 10 minuti in modo che i sali da PBS sono sufficientemente rimossi dal tessuto.
   3. Preparare 0,025% soluzione TB in acqua deionizzata.
   4. Porre i vetrini nella soluzione TB per 1-5 min.
      NOTA: il tempo di incubazione dipende dalle preferenze dell'utente, ma deve essere tenuto coerente in tutti i campioni.
   5. Riporre i vetrini in vaschetta Coplin con acqua e lavare i vetrini deionizzata 3x per 5 minuti ciascuna.
   6. Monte vetrino con il 30% glicerolo disciolto in acqua deionizzata (NON PBS 1X come questo farà sì che la macchia di percolare dal tessuto). NOTA: glicerolo montante può essere sostituito con sciroppo di fruttosio, che aiuta a prevenire la diffusione della macchia dal tessuto. Apreparare lo sciroppo di fruttosio, sciogliere 30 g di fruttosio in 10 ml di acqua deionizzata e si riscalda a 60 ° C fino a dissoluzione.

6. Giri multipli di Imaging

1. Caricare i vetrini in vassoi microscopio (Figura 3D).
   Nota: I vassoi sono caricati a molla.
2. Inserire i vassoi nella pila cassetto del microscopio slide-scansione (Figura 3E).
3. Visualizza l'elenco profilo per caricare un profilo per ogni diapositiva con adeguati tempi di esposizione per ogni fluoroforo. Clicca sul nome della diapositiva di nominare ogni diapositiva manualmente o avere il software legge il codice a barre sull'etichetta diapositiva. Fare clic sul pulsante di anteprima di scansione inizio per prendere un'immagine di anteprima della diapositiva.
4. Impostare le regioni di interesse nella procedura guidata di rilevamento dei tessuti e salvarli per successive serie di immagini. Una volta che ogni diapositiva è l'installazione, avviare il processo di scansione facendo clic sul pulsante di scansione di avvio.
   Nota: Il sistema può contenere fino a 100 SLIdes alla volta.
5. Una volta che l'imaging è finito, esportare le immagini da ogni singolo giro di canale e di imaging come .tif o file .jpg per il montaggio e l'analisi delle immagini.

7. Immagine Assembly

1. Metodo manuale utilizzando Photoshop (o simili software di editing delle immagini in grado di produrre immagini a più livelli).
   1. Aprire ogni immagine singolo canale da ogni round di imaging.
   2. Assemblare le singole immagini come livelli all'interno di una immagine composita. Per fare ciò, fare clic sul livello nella palette dei livelli da un'immagine. Quindi trascinare lo strato su un'altra immagine. Questa operazione drag and drop creerà un nuovo livello nell'immagine. Fate questo per tutte le altre immagini. In alternativa, utilizzare uno script (File> Script> File di carico in Pila ...) per automatizzare questo processo caricando più file di immagine come strati in una serie di immagini.
   3. Una volta che ogni immagine è elencato come un singolo livello nell'immagine composita, fare doppio clic sul nome del livello per rinominare il layers come necessario per discernere i diversi canali.
   4. Per vedere attraverso ogni livello e creare un'immagine veramente composito, cambiare il metodo di fusione per ogni strato da "normale" a "schermo" all'interno della palette dei livelli.
      Nota: Per accelerare questo passaggio, cambiare un singolo strato di schermo, quindi fare clic destro sul layer, selezionare "Copia stile livello", quindi evidenziare tutti gli altri livelli e selezionate "incolla stile di livello" per applicare lo stile schermo all'altro strati.
   5. Se desiderato, diminuire l'opacità (valore di variazione a 10 - 40%) dello strato cromogenico (cioè, blu di toluidina) per visualizzare meglio i segnali fluorescenti attraverso lo strato cromogenico.
      Nota: Il microscopio a scansione piastrelle utilizzato in questo protocollo contiene i vetrini su 3 bordi, minimizzando la quantità di rotazione che può verificarsi alla slitta durante ogni turno di imaging. Pertanto, è molto più facile per l'utente di allineare manualmente le immagini senza dover ruotare le immagini derivateda diversi giri di imaging.

Risultati

Un flusso di lavoro generale per l'High-Throughput, Multi-Image Cryohistology

Figura 1 rappresenta lo schema generale utilizzato per questa tecnica. Esso comprende diversi passi dalla fissazione attraverso vari cicli di imaging e, infine, l'allineamento immagine / analisi. Il processo può richiedere un minimo di una settimana per andare dalla fissazione del campione attraverso 4 giri ...

Discussione

Qui abbiamo presentato una dettagliata protocollo cryohistology di co-localizzare e quantificare diverse misure biologiche allineando le immagini provenienti da vari cicli di colorazione / immagini su una singola sezione. Il metodo descritto usando l'cryotape è particolarmente utile in quanto mantiene la morfologia di difficile tessuti sezione (ad esempio, osso mineralizzato e della cartilagine). Inoltre, il tessuto sezionato viene fatto aderire saldamente al vetrino, consentendo più cicli di colorazione ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128-4L	Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378	Multiple suppliers available.
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Multiple suppliers available.
Cryomolds	Fisher Scientific	Fisherbrand #22-363-554	Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix	Thermo Scientific	6769006	Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane	Sigma Aldrich	M32631	Multiple suppliers available.
Cryostat	Leica Biosystems	3050s	Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc	Leica Biosystems	14037008587	Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades	Thermo Scientific	3051835	Can be substituted with other brands/models.
Cryotape	Section Lab	Cryofilm 2C
Roller	Electron Microscopy Sciences	62800-46	Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides	Electron Microscopy Sciences	71890-01	Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides	Thermo Scientific	3051	Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61	Norland Optical	Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light	General Electric	F15T8-BLB
Glacial acetic acid	Sigma Aldrich	ARK2183	Multiple suppliers available.
Chitosan	Sigma Aldrich	C3646	Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres	ThermoFisher Scientific	I-14787
InSpeck green microspheres	ThermoFisher Scientific	I-14785
Calcein Blue	Sigma Aldrich	M1255	Multiple suppliers available.
Calcein	Sigma Aldrich	C0875	Multiple suppliers available.
Alizarin complexone	Sigma Aldrich	A3882	Multiple suppliers available.
Demeclocycline	Sigma Aldrich	D6140	Multiple suppliers available.
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761	Multiple suppliers available.
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate	ThermoFisher Scientific	E-6588
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain)	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	R37108	Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous	Sigma Aldrich	S2889	Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate	Sigma Aldrich	T6521	Multiple suppliers available.
Sodium nitrite	Sigma Aldrich	S2252	Multiple suppliers available.
Tris	Sigma Aldrich	15504	Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate	Sigma Aldrich	M9272	Multiple suppliers available.
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt	Sigma Aldrich	F8764	Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX	Sigma Aldrich	N4875	Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide	Sigma Aldrich	D158550	Multiple suppliers available.
Toluidine blue O	Sigma Aldrich	T3260	Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1	Carl Zeiss AG	Axio Scan.Z1	Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set	Chroma Technology Corp.	49000
CFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49001
GFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49020
YFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set	Chroma Technology Corp.	custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set	Chroma Technology Corp.	49004
Cy5 Filter Set	Chroma Technology Corp.	49009
CryoJane Tape Transfer System	Electron Microscopy Sciences	62800-10	Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows	Electron Microscopy Sciences	62800-72	Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides	Electron Microscopy Sciences	62800-4X	Multiple suppliers available.