Hochdurchsatz, Multi-Bild Cryohistology von mineralisiertem Gewebe

Zusammenfassung

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

Zusammenfassung

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

Einleitung

Biologische Forschung erfordert oft effizienter Phänotypisierung, die häufig mit irgendeiner Art von histologischen Analyse ^1-3 zugeordnet ist. Dieser Bedarf wird noch deutlicher , mit den ehrgeizigen Projekten jedes Gen im Mausgenom ⁴ zu stören. Diese histologischen Analysen können von der Beurteilung der Zellmorphologie und / oder anatomischen Merkmale zu Abbildungs ​​Expression spezifischer Gene oder Proteine ​​auf einzelne Zellen liegen. In der Tat ist einer der grundlegenden Beiträge der Histologie auf das Gebiet der Genomik ist die Fähigkeit, ein spezifisches molekulares Signal auf einen bestimmten Bereich oder Zelltyp zu assoziieren.

Traditionelle Methoden der Histologie, vor allem für Muskel-Skelett-Gewebe, sind oft zeitaufwendig und mühsam und erfordert manchmal Wochen zu beheben, entkalken, Abschnitt, Fleck, und Bild die Probe dann analysieren die Bilder über die menschliche Interpretation. Analysieren von mehreren molekularen Signale, ob über Immunhistochemie, in situ hybridizatIon oder spezielle Flecken, erfordert mehrere Abschnitte und sogar mehrere Proben in geeigneter Weise durchzuführen. Darüber hinaus können diese mehreren Reaktionen auf dieselbe Zelle nicht zusammen lokalisiert und manchmal nicht auf einen bestimmten Bereich innerhalb einer gegebenen Probe co-lokalisiert werden kann. Wie die Genomik und epigenomics Feld in das digitale Zeitalter bewegt, muss die histologische Feld auch nachziehen effizient mit hohem Durchsatz und automatisierte Analyse einer Vielzahl von molekularen Signalen innerhalb eines einzigen histologischen Schnitt zu liefern.

Tatsächlich gibt es eine Nachfrage nach verbesserten histologische Techniken, die mehrfache molekulare Signale zu spezifischen Zellen innerhalb eines gegebenen Probe zuordnen können. Vor kurzem haben wir einen neuen Hochdurchsatz - cryohistological Methode zur Beurteilung mehrerer Reaktionsmaßnahmen in einem bestimmten Abschnitt von mineralisiertem Gewebe ^14.05 veröffentlicht. Das Verfahren beinhaltet die Kryoschnitt mit gefrorenen cryotape Stabilisierung der verschweißte Abschnitt anhaftenden starr an einem Mikroskop-Objektträger, undDurchführung von mehreren Runden der Färbung und Bildgebung auf jedem Abschnitt. Diese Runden der Bilder werden dann manuell oder über Computerautomatisierung vor der Bildanalyse (Figur 1) ausgerichtet ist . Hier stellen wir ausführliche Protokolle dieses Verfahrens und Beispiele geben, wo diese Techniken unser Verständnis von verschiedenen biologischen Prozessen verbessert.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Die University of Connecticut Health Center institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschuss genehmigt alle Tierverfahren.

1. Fixation and Embedding

1. Euthanize das Tier über CO ₂ Ersticken oder einem anderen zugelassenen Verfahren.
2. Ernten Sie das Gewebe von Interesse (zB, des Körpers, Wirbel, etc.) und in 10% neutral gepuffertem Formalin bei 4 ° C bis richtig befestigt. Besondere Vorsicht konsistente anatomische Platzierung zu halten vor der Fixierung. Zum Beispiel fixieren Gliedmaßen mit Gelenken bei gleichbleibender Flexion, Innenrotation und Außenrotation Winkel ^11. Typischerweise fixieren ganze Maus Gliedmaßen für 1 - 3 Tage.
   Achtung: Formalin ist giftig und sollte in einem Abzug gehandhabt werden, während geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen.
   Hinweis: Der Zeitrahmen der Fixierung auf die Größe der Probe abhängt. Wenn das Experiment ermöglicht es, den Knochen Aufschneiden wird die Fixierung des Markraums zu verbessern.Einige Proben können ¹⁵ Perfusionsfixierung erfordern fluoreszierenden Hintergrund (zB schwache Fluoreszenzsignale innerhalb des Knochenmarks) zu minimieren.
3. Transfer Proben aus Formalin und 30% Sucrose in 1x PBS hergestellt und für 12 inkubieren - 24 h bei 4 ° C.
   Hinweis: Sobald inkubiert 12-24 h Proben können dann für die Langzeitlagerung bei -80 ° C platziert werden. Diese Art der Lagerung ist für Experimente empfohlen , bei denen Forscher mehrere Proben in dem gleichen Block , aber nicht ernten all dieser Proben in der gleichen Zeit (beispielsweise Versuche mit mehreren Zeitpunkten) einzubetten beabsichtigen.
4. Entfernen Proben aus der Saccharose und sezieren, um überschüssiges Gewebe entfernt.
5. Füllen Sie eine cryomold (Größe der Form ist abhängig von Probengröße) einen Teil des Weges mit Kryo Medium eingebettet wird. Legen Probe in Form, so dass die Schnittebene für die Region von Interesse ist parallel mit dem Boden der Form.
   Hinweis: Ein Beispiel für spezifische Gewebe Anordnung und AusrichtungB - kann in 2A zu finden.
6. Legen Sie die cryomold auf ein Stück Trockeneis, bis eine dünne Schicht aus Kryo Medium gefriert Einbettung und anschließend fixiert die Probe an Ort und Stelle. Füllen Sie das restliche Volumen des cryomold mit Kryo Einbettungsmittel, während die cryomold auf dem Trockeneis-Pellet erhalten.
7. Platzieren Sie die cryomold in einem Container mit 2-methyl-butan vorgekühltem von Trockeneis. Sobald Proben vollständig gefroren sind, cryomolds entfernen und überschüssiges 2-Methyl-Butan abzuschütteln. Wickeln Sie cryomolds in Zellophan und in einem -20 ° C oder -80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung.
   Hinweis: Proben im Laufe der Zeit austrocknen können, wenn in cryo Einbettmedium, insbesondere bei -20 ° C gelagert. Wir empfehlen die Lagerung von Proben für mehr als 1 - 2 Monate in cryo Einbettungsmedium bei -80 ° C oder in 30% Saccharose bei -80 ° C (siehe Schritt 1.3).

2. Band-stabilisiertes Gewebe Sectioning

1. Entfernen Probenblöcke aus dem Gefrierschrank und legen in cryostat, wobei die Temperatur zwischen -20 und -25 ° C eingestellt.
2. Überschuss Kryo Einbettmedium mit einer Rasierklinge Entfernen Sie den Block von der cryomold und wegschneiden.
3. Legen Sie einige Kryo Einbettmediums auf die Probe Scheibe und dann richten Sie den Block, so dass die Oberfläche der Objektplatte ist parallel zur Bodenfläche des Blocks, wodurch die richtige Schnittebene für die Region von Interesse zu etablieren.
4. Legen Sie die Objektplatte in den Kryostaten und ermöglichen die Kryo Einbettmediums einzufrieren.
5. Platzieren Sie den Probenteller auf den Objektkopf und stellen Sie den Kopf, so dass die Klinge schneidet auf der Oberfläche des Probenblocks parallel.
6. Schneiden Sie den Block nach unten auf ein Niveau im Bereich von Interesse und abbürsten alle Späne von der Oberfläche des Blocks.
7. Schneiden Sie ein Stück des cryotape groß genug, um die Region von Interesse und Pre-Chill in den Kryostaten zu decken.
   Hinweis: Mehrere Stücke können konsistente Größen und gespeichert innerhalb des cryost geschnitten werdenbei während des Schneidens.
8. Nicht ausreichend tragfähige Unterlage aus dem cryotape durch das Band Greifen durch den nicht-klebrigen Silber / Gold-Laschen nach unten Zange dann legen Sie das Band auf den Block klebrig-Seite verwenden.
9. Drücken Sie auf die cryotape mit der Rolle (2C).
10. Machen Sie einen Abschnitt (5 bis 8 & mgr; m) entweder die automatische Motor oder manuelle Schneidrad des Kryostaten verwendet wird.
    Hinweis: Es empfiehlt sich , den Rand des cryotape zu halten , wie es auf die Bühne kommt , so dass der Abschnitt nicht aus während des Schneidens (2D) der Bühne fällt.
11. Platzieren Sie den Abschnitt Gewebeseite nach oben auf einem Kunststoff - Objektträger innerhalb des Kryostaten.
12. Die Kunststofffolie aus dem Kryostaten und erlauben dem Kryo Einbettungsmedium, wie zu schmelzen, daß der Abschnitt an der Oberfläche des Schiebers haftet.
13. Wiederholen Sie dies für Serienschnitte oder andere Bereiche von Interesse sectioning.
14. Sobald Sie fertig sind, speichern Sie die Abschnitte in einer Dia-Box eint 4, -20 oder -80 ° C, abhängig von der Länge der Lagerung erforderlich, und die nachgeschaltete Reaktionsmaßnahmen. innerhalb von einem Monat bei 4 ° C gelagert - Zum Beispiel verwenden Folien, die für die enzymatische Aktivität gefärbt werden werden (5.3 5.2).

3. Die Haftung der Abschnitte auf Objektträger

1. UV-härtbare Klebstoff-Methode.
   1. Beschriften Sie die Mikroskop-Objektträger.
      Hinweis: Für eine verstärkte Automatisierung, Muster und Dias können mit Barcodes versehen werden.
   2. Einen Tropfen von UV-aktivierten optischen Klebstoff auf zwei Glasträgern und verwenden den Rand einer Kunststoffschieber eine dünne Klebstoffschicht über die Oberfläche der Glasobjektträger zu verteilen.
   3. Schneiden Sie die Silber / Gold-Registerkarte aus und legen Sie die verschweißte Abschnitt Gewebeseite auf dem Klebstoff der ersten Folie nach oben. Anwenden den Abschnitt in einer Rollbewegung von einer Kante zur anderen, um die Bildung von eingeschlossenen Blasen unterhalb des Bandes zu minimieren.
      HINWEIS: Die erste Folie verwendet, um die Unterseite von t vorbefeuchtendener Band vor ihm auf dem zweiten (permanent) Schieber (Schritt 3.1.4) zu platzieren.
   4. Entfernen Sie den verklebten Abschnitt von der ersten Folie und legen Sie es auf der Klebeschicht des zweiten Schlittens (3A). Auch hier ist darauf zu achten Einschluss von Blasen zu vermeiden.
      HINWEIS: Dieser Schritt Übung den Meister nimmt.
   5. Sobald die entsprechende Anzahl von Abschnitten für die gegebene Experiment auf jedem Objektträger platziert wird, wischen den überschüssigen Klebstoff von der Umgebung ab.
   6. Überprüfen Sie jeden Abschnitt eng für Blasen oder Fasern unter dem Band. Führen Sie diese Inspektion unter dem Mikroskop oder Lupe. Wenn es Hindernisse sind, entfernen Sie die einzelnen Kapitel, die Hindernisse zu entfernen, und dann an den Glasobjektträger erneut anwenden.
   7. Sobald festgestellt wird, dass es keine Hindernisse unter den verklebten Abschnitte sind, legen Sie die Objektträger unter der UV-Schwarzlicht 5 - 10 min den Klebstoff zu vernetzen.
2. Chitosan Klebeverfahren.
   1. bereiten Sie the 1% Chitosan Klebstoff. Bereiten Essigsäurelösung durch Lösen von 0,25 ml konzentrierter Essigsäure in 100 ml DI Wasser (0,25% v / v). Man löst 1 g Chitosanpulver in 100 ml Essigsäure-Lösung und rühre die Lösung O / N oder bis das gesamte Chitosanpulver gelöst.
      HINWEIS: Die Lösung wird bei RT stabil.
   2. Abzuscheiden einen Tropfen Chitosanlösung für jeden Abschnitt, der auf dem Objektträger platziert wird.
   3. Schneiden Sie die Silber / Gold - Reiter des Bandes ab und legen jedes Seitenteil Gewebe abgeklebt auf den Klebstoff (3A). Verwenden Sie große Sorgfalt Einschluss von Blasen zu vermeiden.
   4. Sobald alle Abschnitte auf der Folie platziert werden, kippen Sie die Folie nach oben auf einer seiner langen Kanten und übermäßige Chitosan an den unteren Rand ziehen Pinzette.
   5. Die Objektträger in dieser Ausrichtung auf einem Papiertuch in einer Dia-Box. Gravity wird dann bewirken, dass das überschüssige Chitosan nach unten auf das Handtuch fallen, eine flache und gleichmäßige Schicht aus Chitosan ergibt.
   6. Place den Schieber Box mit Deckel aufgestützt geöffnet im Kühlschrank O / N das Chitosan trocknen zu lassen.
      HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für einen Vergleich zwischen den beiden Klebeverfahren.

4. Anwendung der Referenzmarken auf Folien

1. Bereiten Referenzmarker Lösung von 50 ul grün gelöst und 50 ul roten Mikrokügelchen in 100 ul Wasser. Die Lösung im Dunkeln bei 4 ° C.
2. Legen Sie eine 10 ul oder 20 ul Pipettenspitze in die Mikrokügelchen Lösung. Fügen Sie einen kleinen Tropfen der Mikrokugel - Lösung zu jeder Abschnitt angrenzend an die Region von Interesse (3C). Achten Sie darauf, nicht die Mikrokugeln innerhalb der Region von Interesse zu bekommen.
3. Trocknen Sie die Objektträger bei RT (lichtgeschützt) für 30 Minuten, wenn die Verarbeitung der Folien an diesem Tag. Wenn nicht, legen Sie die Folien in einer Dia-Box bei 4 ° C.
   Hinweis: Solange die Mikrokügelchen-Lösung vor trocknet die Folien feuchtigkeitsspendend, die miSphären bleiben auf den Folien, die während mehrerer Runden der Färbung / Imaging geklebt.

5. Mehrere Runden von Anfärben

HINWEIS: Viele biologische Signale auf dem gleichen Gewebeabschnitt durch eine kompatible Sequenz von Abbildungs, Färbung und Wiederabbildungs ​​Schritte der Auswahl ist es möglich, zu erkennen und zu co-lokalisieren. Jede Runde der Bildgebung / Färbung / Re-Imaging hat für die jeweilige histologische Frage entwickelt werden. Die Abbildungs ​​/ Färbungs / Wiederabbildungssequenz beinhaltet typischerweise die endogenen Fluoreszenzsignale Erfassen (zB zellulare GFP, Mineralisation Farbstoffe, in vivo Bildgebungssonden) auf der ersten Runde der Bildgebung durch Fluoreszenz gemultiplexten Immunofärbung und mehrere Runden von enzymatischer Aktivität Flecken gefolgt. Schließlich kann der Abschnitt mit chromogenen Farbstoffen gefärbt werden (zB H & E, Toluidinblau, Safranin O, etc.) , um die Gewebearchitektur hervorzuheben. Präsentiert in diesem Abschnitt sind benutzerdefinierte Methoden angepasst vonkommerziell verfügbaren Protokolle.

1. Calcein - Blau - Färbung für akkumulierte Mineral
   HINWEIS: Calcein-Blau-Färbung ergibt eine konsistente Mineraloberfläche, die automatisierte Bildanalyse im Gegensatz zu Dunkelfeld- oder differentiellen Interferenzkontrast (DIC) Bildgebung zugänglich ist. Das Problem mit Calcein - Blau - Färbung ist , dass das Fluoreszenzspektrum überlappt mit Tetracyclin und Demeclozyklin Kennzeichnung. Deshalb, wenn die Probe auf diese Mineral Etiketten enthält, Bild die Etiketten in der ersten Runde der Bildgebung vor mit Calcein blau Färbung.
   1. Wenn die endogene Signale innerhalb des Gewebes vor diesem Färbeschritt abgebildet werden, tauchen die Folien von der vorherigen Bildgebung Runde in einem Coplin Glas mit 1xPBS gefüllt, bis die Deckgläser aus den Folien fallen weg. Entfernen Sie und trocknen Sie die Deckgläser.
   2. Herstellung von 30 mg / ml Calcein - Blau - Lösung in 2% NaHCO ₃ (hergestellt durch Auflösen von 2 g NaHCO ₃ in 100 ml H ₂ O und justierening auf pH-Wert von 7,4 mit HCl). Aliquot und speichern die Lösung bei -20 ° C.
   3. Tauchen Sie die Folien in einer Coplin Gefäß mit 1x PBS für 15 Minuten in den Abschnitten zu Hydrat, wenn nicht bereits aus der vorherigen Runde mit Feuchtigkeit versorgt.
   4. Entfernen Sie die Folien und trocknen Sie die Rückseite und die Kanten mit einem Papiertuch.
   5. Bewerben 100-500 ul von Calcein-Blau-Lösung pro Folie und Inkubation für 10 min in einer feuchten Kammer bei RT.
   6. Spülen Sie die Folien in 1x PBS für 10 Minuten mit 3 Änderungen.
   7. Bewerben ~ 200 ul 50% Glycerin in 1x PBS zu jeder Folie und montieren Sie die Deckglas.
   8. Entfernen Sie das überschüssige Glycerin und trocknen Sie die Unterseite der Folien.
2. Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) enzymatische Aktivität Färbung
   HINWEIS: TRAP wird von mehreren Zelltypen in der hämatopoetischen Abstammungslinie einschließlich Osteoklasten exprimiert wird. Die TRAP - Färbung hier vorgestellten verwendet ein gelb fluoreszierendes saure Phosphatase Substrat. Bestimmte Fluoreszenzsignale werden ovERLAP mit dem benutzerdefinierten Gelbfilter-Set Tetracyclin / Demeclozyklin Mineralisierung Etiketten einschließlich, Calcein Bläue und DAPI Gegenfärbung.
   1. Versenken Folien aus der vorhergehenden Bildgebungs Runde in einem Coplin Glas mit 1x PBS gefüllt, bis die Deckgläser aus den Folien fallen weg. Entfernen Sie und trocknen Sie die Deckgläser.
   2. Bereiten Puffer 1 durch Lösen von 9,2 g Natriumacetat wasserfrei und 11,4 g Natriumtartrat zweibasigen Dihydrat in Wasser und bringt das Endvolumen auf 1000 ml. Einstellung des pH auf 4,2 mit konzentriertem Eisessig (~ 1,5-2 ml). Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 12 Monate.
   3. Bereiten Buffer 2 um 40 mg Natriumnitrit in Wasser gelöst und das Endvolumen auf 1 ml zu bringen. Lagern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Woche.
   4. Am Tag der Färbung, bereiten die Puffer Reaktion durch 7,5 ml Puffer 1 und 150 & mgr; l Puffer 2 vermischt wird.
   5. Übernehmen der Reaktionspuffer ohne das Substrat zu der Folies für 10 bis 15 min in das Gewebe an der unteren pH äquilibrieren.
      HINWEIS: Das typische Volumen von ~ 200 & mgr; l, aber muss groß genug sein, um alle Bereiche abzudecken.
   6. Verdünne die gelb fluoreszierendes saure Phosphatase Substrat zwischen 1:50 und 1: 100 in Reaktionspuffer.
      HINWEIS: Die Verdünnung wird durch TRAP-Aktivität in der Probe bestimmt werden.
   7. Gießen Sie die Reaktionspuffer aus der Dias und Anwendung der Reaktionspuffer mit dem gelben Fluoreszenzsubstrat auf den Folien.
   8. Legen Sie die Folien unter der UV-Schwarzlicht für ~ 5 min das Substrat zu aktivieren.
      Hinweis: Die Inkubationszeit kann je nach TRAP-Aktivität in der Probe variieren.
   9. Spülen Sie die Folien in 1x PBS für 10 Minuten mit 3 Änderungen.
   10. Bewerben ~ 200 ul 50% Glycerin in 1x PBS zu jeder Folie und montieren Sie die Deckglas.
   11. Entfernen Sie das überschüssige Glycerin und trocknen Sie die Unterseite der Folien.
       HINWEIS: Die saure TRAP Puffer, um die Abschnitte entkalken wird. Der zusätzliche Vorteil der decalcification ist , dass bestimmte Farben für Downstream - Färbung (zB Mineralisierung Etiketten) wieder zur Verfügung stehen wird. Zum Beispiel wird die Calcein-Blau-Färbung während der TRAP-Färbung entfernt werden. Daher kann DAPI counterstain während einer anschließenden Runde in diesem Kanal abgebildet werden.
3. Alkalische Phosphatase (AP) enzymatische Aktivitätsfärbung
   HINWEIS: Mehrere Zelltypen beteiligt mit Mineralisierung Osteoblasten und mineralisiert Chondrozyten exprimieren AP einschließlich. Die Fast Red Substrat in diesem Protokoll verwendet löst eine sowohl leuchtrot und chromogenen rotes Signal. Aus diesem Grund wird das chromogene Substrat Fluoreszenzsignale in den Bereichen, in denen das Substrat abzuschrecken ausfällt. Daher ist es am besten, diese Flecken zu tun, nachdem die Fluoreszenzsignale Abbilden, die von dem AP-Substrat gequencht werden kann.
   1. Versenken Folien aus der vorhergehenden Bildgebungs Runde in einem Coplin Glas mit 1x PBS gefüllt, bis die Deckgläser aus den Folien fallen weg. Remove und die Deckgläser trocknen.
   2. Vorbereitung 1 M Tris durch Lösen von 12,1 g Tris in 100 ml Wasser. PH-Wert auf 9,5 mit 1 M NaOH.
   3. Vorbereitung 1 M MgCl ₂ Hexahydrat von 20,33 g MgCl ₂ in 100 ml deionisiertem Wasser gelöst.
   4. Bereiten 2 M NaCl durch Auflösen von 11,68 g NaCl in 100 ml deionisiertem Wasser hergestellt.
   5. Bereiten 100x (20 mg / ml) Stammlösung von Fast Red TR-Salz durch Auflösen von 1 g Pulver in 50 ml deionisiertem Wasser hergestellt. Machen Sie 100 ul Aliquots und bei -20 ° C.
   6. Bereiten 100x (10 mg / ml) Naphthol AS-MX Phosphat-Stammlösung durch Lösen von 500 mg Pulver in 50 ml N, N Dimethylformamid. Machen Sie 100 ul Aliquots und bei -20 ° C.
   7. Am Tag der Färbung, bereiten den Puffer AP durch Zugabe von 1 ml 1 M Tris, 0,5 ml 1 M MgCl _2, 0,5 ml 2 M NaCl und das Endvolumen auf 10 ml zu bringen deionisiertem Wasser (Endkonzentrationen verwendet: 100 mM Tris, 50 mM MgCl _2, 100 mM NaCl).
   8. Platzieren Sie AP bUffer auf jedem Objektträger und für 10 min bei RT in einer feuchten Kammer inkubiert.
   9. Bereiten Sie AP-Substratpuffer von 100x Aktien von Fast Red TR Salz und Naphthol AS-MX Verdünnung in der AP-Puffer auf 1x.
   10. Gießen AP Puffer aus Folien und ersetzen mit AP-Substratpuffer. Inkubiere Objektträger 5 - 10 min in einer Feuchtekammer bei RT.
       Hinweis: Die Inkubationszeit wird durch AP-Aktivität der Probe bestimmt werden.
   11. Wash gleitet 3x in 1x PBS für jeweils 5 Minuten.
   12. Berg Deckgläser mit DAPI Gegenfärbelösung (1: 1000 Verdünnung von DAPI in 50% Glycerin in 1x PBS).
4. Toluidinblau O (TB) chromogene Färbung
   Hinweis: Da alle bisherigen Schritte im Rahmen eines temporären wässrigen Montage in 50% Glycerin / PBS-Lösung abgebildet werden, wird der chromogene Schritt auch unter wässrigen Bedingungen abgebildet. Jedoch kann die Färbelösung auszulaugen im Laufe der Zeit neigen. Daher ist es das Toluidinblau dem Bild so schnell wie möglich nach dem Färben vorgeschlagen.
   1. Versenken Dias aus früheren Bildgebungs Runde in einem Coplin - Gefäß mit entsalztem Wasser gefüllt , bis die Deckgläser aus den Folien fallen weg. Entfernen Sie und trocknen Sie die Deckgläser.
   2. Nachdem Sie die Deckgläser zu entfernen, ersetzen Sie mit frischem Wasser und brüten die Folien für mindestens 10 min, so dass Salze von PBS ausreichend aus dem Gewebe entfernt werden.
   3. Bereiten 0,025% TB Lösung in VE-Wasser.
   4. Legen Sie die Folien in der TB-Lösung für 1 - 5 min.
      Hinweis: Die Inkubationszeit nach Benutzereinstellung abhängig ist, sondern sollte in allen Proben konsistent gehalten werden.
   5. Die Objektträger in Glasküvette mit entsalztem Wasser und Wasch Dias 3x für jeweils 5 Minuten.
   6. Mount Abdecküberzug mit 30% Glycerin in deionisiertem Wasser gelöst (NOT PBS 1x , da dies der Fleck aus dem Gewebe auszulaugen verursachen). HINWEIS: Glycerol Eindeckmediums kann mit Fruktose-Sirup ersetzt werden, die die Diffusion des Farbstoffs aus dem Gewebe zu verhindern hilft. NachHerstellung der Fruktosesirup, lösen sich 30 g Fructose in 10 ml deionisiertem Wasser und Wärme auf 60 ° C bis gelöst.

6. Mehrere Runden von Imaging

1. Legen Sie die Folien in das Mikroskop Tabletts (3D).
   Hinweis: Die Tabletts sind federbelastet.
2. Setzen Sie die Fächer in das Fach ein Stapel des Einschub - Scanning - Mikroskop (Abbildung 3E).
3. Klicken Sie auf die Profilliste ein Profil für jede Folie mit geeigneten Belichtungszeiten für jeden Fluorophor zu laden. Klicken Sie auf den Foliennamen jede Folie manuell zu benennen oder die Software haben den Barcode zu lesen auf der Folie Etikett versehen. Klicken Sie auf die Start-Vorschau-Scan-Taste ein Vorschaubild des Schlittens zu nehmen.
4. Stellen Sie die Bereiche von Interesse im Gewebe Assistent zur Erkennung und speichern Sie sie für nachfolgende Runden Bildgebung. Sobald jeder Schlitten-Setup ist, starten Sie den Scanvorgang mit der Start-Scan-Taste klicken.
   Hinweis: Das System kann halten bis zu 100 slides zu einer Zeit.
5. Sobald die Bildgebung beendet ist, exportieren Sie die Bilder von jedem einzelnen Kanal und Imaging-Runde als .tif oder .jpg-Dateien für Bildmontage und Analyse.

7. Bildmontage

1. Manuelle Verfahren mit Photoshop (oder einem ähnlichen Bildbearbeitungssoftware, die geschichteten Bilder zu erzeugen).
   1. Öffnen Sie jeden einzelnen Kanal Bild von jeder Abbildungs ​​Runde.
   2. Montieren Sie die einzelnen Bilder als Schichten innerhalb eines zusammengesetzten Bildes. Um dies zu tun, klicken Sie auf die Ebene in der Ebenenpalette von einem Bild. Ziehen Sie dann die Schicht auf ein anderes Bild. Diese Drag-and-Drop-Operation wird eine neue Ebene im Bild erstellen. Tun Sie dies für alle anderen Bilder. Alternativ können Sie ein Skript (Datei> Skripten> Laden von Dateien in Stapel ...) diesen Prozess zu automatisieren, indem Sie mehrere Bilddateien als Schichten in einem Bildstapel zu laden.
   3. Sobald jedes Bild als einzelne Schicht in dem zusammengesetzten Bild, klicken Sie doppelt auf den Layernamen den la umbenennen aufgeführt wirdyers wie erforderlich, um die verschiedenen Kanäle zu erkennen.
   4. Um durch jede Schicht zu sehen und eine wirklich zusammengesetztes Bild zu erstellen, den Mischmodus für jede Schicht von "Normal" auf "Screen" in der Ebenenpalette ändern.
      Hinweis: Um diesen Schritt zu beschleunigen, eine einzelne Schicht ändern zu screenen, dann mit der rechten Maustaste auf die Ebene, wählen Sie "Ebenenstil kopieren", dann alle anderen Ebenen markieren, und wählen Sie "Ebenenstil einfügen", um den Bildschirm Stil für die andere gelten Lagen.
   5. Falls gewünscht, kann eine Verringerung der Opazität (Änderungswert um 10 - 40%) der chromogenen Schicht (dh Toluidinblau) , um besser die Fluoreszenzsignale durch die chromogene Schicht zu visualisieren.
      Hinweis: Das geflieste Rastermikroskop in diesem Protokoll hält die Folien 3 Kanten verwendet, wodurch das Ausmaß der Drehung zu minimieren, die auf dem Objektträger während jeder Runde der Abbildungs ​​auftreten können. Daher ist es viel einfacher für den Benutzer manuell die Bilder auszurichten, ohne Bilder zu drehen, die abgeleitet sindaus verschiedenen Runden der Bildgebung.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Ein Allgemeiner Workflow für die Hochdurchsatz, Multi-Bild Cryohistology

Abbildung 1 stellt die allgemeine Arbeitsablauf für diese Technik verwendet. Es umfasst mehrere Schritte, von der Fixierung durch mehrere Runden von Bildgebung und schließlich Ausrichtung / Bildanalyse. Der Prozess kann so wenig nehmen, wie in der Woche von Probe Fixierung durch 4 Runden der Bildgebung zu gehen, die we...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Hier haben wir ein detailliertes cryohistology Protokoll vorgestellt zusammen lokalisieren und verschiedene biologische Maßnahmen quantifizieren durch Bilder von mehreren Runden der Färbung / Bildgebung auf einem einzigen Abschnitt auszurichten. Das Verfahren den cryotape umrissenen Verwendung ist besonders nützlich , da es die Morphologie schwierig Abschnitt Gewebe (zB mineralisiertem Knochen und Knorpel) beibehält. Zusätzlich wird das geschnittene Gewebe fest mit dem Glasträger, so dass für mehrere Run...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128-4L	Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378	Multiple suppliers available.
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Multiple suppliers available.
Cryomolds	Fisher Scientific	Fisherbrand #22-363-554	Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix	Thermo Scientific	6769006	Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane	Sigma Aldrich	M32631	Multiple suppliers available.
Cryostat	Leica Biosystems	3050s	Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc	Leica Biosystems	14037008587	Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades	Thermo Scientific	3051835	Can be substituted with other brands/models.
Cryotape	Section Lab	Cryofilm 2C
Roller	Electron Microscopy Sciences	62800-46	Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides	Electron Microscopy Sciences	71890-01	Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides	Thermo Scientific	3051	Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61	Norland Optical	Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light	General Electric	F15T8-BLB
Glacial acetic acid	Sigma Aldrich	ARK2183	Multiple suppliers available.
Chitosan	Sigma Aldrich	C3646	Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres	ThermoFisher Scientific	I-14787
InSpeck green microspheres	ThermoFisher Scientific	I-14785
Calcein Blue	Sigma Aldrich	M1255	Multiple suppliers available.
Calcein	Sigma Aldrich	C0875	Multiple suppliers available.
Alizarin complexone	Sigma Aldrich	A3882	Multiple suppliers available.
Demeclocycline	Sigma Aldrich	D6140	Multiple suppliers available.
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761	Multiple suppliers available.
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate	ThermoFisher Scientific	E-6588
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain)	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	R37108	Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous	Sigma Aldrich	S2889	Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate	Sigma Aldrich	T6521	Multiple suppliers available.
Sodium nitrite	Sigma Aldrich	S2252	Multiple suppliers available.
Tris	Sigma Aldrich	15504	Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate	Sigma Aldrich	M9272	Multiple suppliers available.
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt	Sigma Aldrich	F8764	Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX	Sigma Aldrich	N4875	Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide	Sigma Aldrich	D158550	Multiple suppliers available.
Toluidine blue O	Sigma Aldrich	T3260	Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1	Carl Zeiss AG	Axio Scan.Z1	Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set	Chroma Technology Corp.	49000
CFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49001
GFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49020
YFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set	Chroma Technology Corp.	custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set	Chroma Technology Corp.	49004
Cy5 Filter Set	Chroma Technology Corp.	49009
CryoJane Tape Transfer System	Electron Microscopy Sciences	62800-10	Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows	Electron Microscopy Sciences	62800-72	Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides	Electron Microscopy Sciences	62800-4X	Multiple suppliers available.