Высокая пропускная способность, Multi-Image Cryohistology минерализованных ТКАНЕЙ

Резюме

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

Аннотация

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

Введение

Биологические исследования часто требует эффективного фенотипирования, который часто ассоциируется с какой - то гистологического анализа ^1-3. Эта потребность становится еще более очевидным с амбициозными проектами , чтобы сорвать каждого гена в геноме мыши ^4. Эти гистологические анализы могут варьироваться от оценки морфологии клеток и / или анатомических особенностей для отображения экспрессии специфических генов или белков на отдельные клетки. На самом деле, одним из основных вкладов гистологии в области геномики является способность ассоциировать определенный молекулярный сигнал к определенной области или клеточного типа.

Традиционные методы гистологии, особенно для костно-мышечной ткани, часто отнимает много времени и трудоемкий, требующий иногда несколько недель, чтобы исправить, ДЕКАЛЬЦ, раздел, пятен и изображения образец затем анализируют изображения через человеческой интерпретации. Анализ нескольких молекулярных сигналов, будь то с помощью иммуногистохимии, на месте hybridizat виона, или специальных красителей, требует нескольких разделов и даже несколько образцов для выполнения надлежащим образом. Кроме того, эти множественные ответы могут не быть совместно локализованы в той же самой клетке, а иногда может не быть совместно локализованы в определенной области в пределах данного образца. В поле геномика и Epigenomics переходит в цифровую эпоху, гистологическое поле должно также последовать этому примеру, чтобы обеспечить эффективную, высокой пропускной способностью, а также автоматизированный анализ различных молекулярных сигналов в пределах одного гистологического среза.

Действительно, существует потребность в улучшенных гистологических методов, которые можно связать несколько молекулярных сигналов к специфическим клеткам в пределах данного образца. Недавно мы опубликовали новый высокой пропускной способностью cryohistological метод оценки нескольких ответных мер в рамках данного раздела из минерализованной ткани ^5-14. Процесс включает в себя стабилизацию cryosection с замороженными cryotape, приклеивания приклеенный участок жестко предметное стекло микроскопа, ипроведение нескольких раундов окрашивания и обработки изображений на каждой секции. Эти раунды изображения затем выравнивается вручную или с помощью компьютерной автоматизации для предварительного анализа изображений (рисунок 1). Здесь мы приводим подробные протоколы этого процесса и привести примеры, когда эти методы улучшили наше понимание различных биологических процессов.

протокол

Университет штата Коннектикут медицинского центра институционального и использованию животных комитета одобрил все процедуры животных.

1. Закрепление и встраивание

1. Усыпить животное с помощью СО ₂ удушья или других утвержденных методов.
2. Заготавливают интересующую ткань (например, конечностей, позвонки и т.д.) и место в 10% нейтральном забуференном формалине при 4 ° С , пока должным образом не фиксирована. Соблюдайте особую осторожность, чтобы поддерживать последовательную анатомическое размещение до фиксации. Например, исправить конечности с суставами на последовательное сгибание, внутреннее вращение, и углы поворота внешнего ^11. Как правило, исправить целые конечности мыши в течение 1 - 3 дней.
   Внимание: формалин является токсичным и должны быть обработаны в вытяжном шкафу при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты.
   Примечание: Временной интервал фиксации зависит от размера образца. Если эксперимент позволяет, разрезав кость улучшит фиксацию отсека мозга.Некоторые образцы могут потребовать перфузионной фиксации ¹⁵ , чтобы минимизировать флюоресцентный фон (например, слабые флуоресцентные сигналы в пределах костного мозга).
3. Передача образцов из формалин до 30% сахарозы, сделанные в 1х PBS и инкубировать в течение 12 - 24 ч при температуре 4 ° С.
   Примечание: После того, инкубируют в течение 12 - 24 ч, образцы могут быть помещены при температуре -80 ° С в течение длительного хранения. Этот метод хранения рекомендуется для экспериментов , в которых исследователи намерены встроить несколько образцов в том же блоке , но не можно собирать из этих образцов , в то же время (например, эксперименты с несколькими точками времени).
4. Удалить образцы из сахарозы и отсечь любую лишнюю ткань.
5. Заполните cryomold (размер формы зависит от размера образца) часть пути с крио вложение среды. Поместите образец в форму таким образом, что плоскость вырезания для интересующей нас области параллельно с нижней частью литейной формы.
   Примечание: пример конкретного размещения ткани и ориентацииможно найти на рисунке 2А - B.
6. не Поместите cryomold на кусок сухого льда, пока тонкий слой крио вложение среды замерзает, а затем фиксирует образец на месте. Заполните оставшийся объем cryomold с крио вложение среды при сохранении cryomold на сухой лед гранулы.
7. Поместите cryomold в контейнере, содержащем 2-метил-бутан, предварительно охлажденное сухим льдом. После того, как образцы полностью заморожен, удалите cryomolds и стряхните 2-метил-бутан. Оберните cryomolds в целлофан и поместить в -20 ° C или -80 ° C морозильника для хранения.
   Примечание: Образцы могут высыхать в течение долгого времени при хранении в крио вложение среды, особенно при -20 ° С. Мы рекомендуем хранить образцы дольше, чем 1 - 2 месяца в крио вложение среды при -80 ° С или в 30% сахарозы при -80 ° С (см шаг 1.3).

2. Лента-стабилизированной ткани Секционирование

1. Удалить из блоков с образцами морозильника и поместить в cryostaт с температурой, установленной от -20 до -25 ° C.
2. Удалить блок из cryomold и обрежьте излишки крио вложение среды с лезвием бритвы.
3. Поместите некоторое крио вложение среды на образец диска, а затем выровнять блок таким образом, что поверхность образца диска параллельна нижней поверхности блока, таким образом, создания надлежащей секущей плоскости для интересующей области.
4. Поместите образец диска в криостат и позволяют крио вложение среды для замораживания.
5. Поместите образец диска на голову образца и отрегулировать головку таким образом, что срезает, параллельно поверхности блока образца.
6. Обрежьте блок вниз до уровня в пределах области, представляющей интерес и стряхните любые стружку с поверхности блока.
7. Вырезать кусок cryotape достаточно большой, чтобы покрыть область интереса и обработки перед холодом в криостате.
   Примечание: Несколько компонентов могут быть сокращены последовательных размеров и хранятся в cryostв течение секционирования.
8. Удалите неприлипающими защитную пленку с cryotape, взявшись за ленту, не-липкое серебро / золото вкладок с помощью щипцов затем поместите ленту на блок липкой стороной вниз.
9. Надавите на cryotape с помощью валика (рис 2С).
10. Сделать раздел (5 - 8 мкм), используя либо автоматический двигатель или ручной режущий диск криостата.
    Примечание: Это хорошая практика , чтобы удерживать край cryotape , как это происходит на стадии таким образом, что секция не падает со сцены во время секционирования (рис 2D).
11. Поместите боковую часть ткани на пластиковом стекле микроскопа внутри криостата.
12. Удалите пластиковую слайд из криостата и позволить крио вложение среды, чтобы расплавить таким образом, что секция прилипает к поверхности ползуна.
13. Повторите секционирования для последовательных секций или других регионах, представляющих интерес.
14. После завершения, сохраните секции в слайд-ящикт 4, -20 или -80 ° C в зависимости от длины хранения необходимой и ответных мер вниз по течению. Например, можно использовать слайды, которые собираются быть окрашены для ферментативной активности (см 5.2 - 5.3) в течение месяца при хранении при 4 ° С.

3. Адгезия секций к предметные стекла микроскопа

1. УФ-отверждаемый клей методом.
   1. Добавьте стекло микроскопа.
      Примечание: Для повышения автоматизации, образцы и слайды могут быть помечены штрих-коды.
   2. Нанесите каплю оптического клея УФ-активируемые для двух предметных стекол и использовать край пластиковой горкой, чтобы нанести тонкий слой клея по всей поверхности предметные стекла.
   3. Отрезанные / вкладку золото серебро и положите приклеенный боковую часть ткани на клей первого слайда. Применяют раздел в прокатном движения от одного края к другому, с тем чтобы свести к минимуму образование пузырьков, увлеченного расположенных под лентой.
      Примечание: Первый слайд используется для предварительного смачивания изнанка тон ленту перед размещением его на второй (постоянной) слайде (этап 3.1.4).
   4. Удалите приклеенный участок с первого слайда и поместить его на клеевой слой второго слайда (рис 3А). Опять же, позаботиться, чтобы избежать захвата пузырьков.
      Примечание: Этот шаг требует практики мастера.
   5. После того, как соответствующее количество секций для данного эксперимента помещается на каждом слайде, вытрите излишки клея из окружающих областей.
   6. Осмотрите каждую секцию близко для пузырьков или волокон, расположенных под лентой. Выполните эту проверку под микроскопом или лупой. Если есть препятствия, удалить отдельные секции, удалите препятствие, а затем повторно применить его к стеклу.
   7. После того, как определено, что не существует никаких препятствий под тесьмой секций, поместите предметные стекла микроскопа под УФ-черным светом в течение 5 - 10 мин сшивать клей.
2. Хитозан клеевой метод.
   1. Приготовьте тысе 1% хитозана клей. Готовят раствор уксусной кислоты путем растворения 0,25 мл концентрированной уксусной кислоты в 100 мл деионизированной воды (0,25% об / об). Растворить 1 г хитозана порошка в 100 мл раствора уксусной кислоты и перемешайте раствор O / N или пока весь порошок хитозан не растворяется.
      Примечание: Раствор стабилен при комнатной температуре.
   2. Депозит каплю раствора хитозана для каждого раздела, который будет размещен на слайде.
   3. Отрезанные вкладку серебро / золото ленты и поместить каждую приклеенный боковой секции ткани вверх на клей (рис 3А). Используйте большую осторожность, чтобы избежать захвата пузырьков.
   4. После того, как все секции размещены на слайде, наклоняя слайд вверх на одном из своих длинных кромок и перетащите чрезмерное хитозан к нижнему краю с помощью щипцов.
   5. Поместите слайды в этой ориентации на верхней части бумажного полотенца в коробке слайдов. Сила тяжести будет вызывать избыток хитозан падать вниз на полотенце, получая плоский и однородный слой хитозана.
   6. Пласе ящик слайд с крышкой расклиненной открытым в холодильнике O / N, чтобы позволить хитозан высохнуть.
      Примечание: смотри таблицу 1 для сравнения между двумя клейкими методами.

4. Применение опорных маркеров к слайдам

1. Готовят раствор сравнения маркера путем растворения 50 мкл зеленого и 50 мкл красных микросфер в 100 мкл воды. Храните раствор в темноте при 4 ° С.
2. Поместите 10 мкл или 20 мкл пипеткой наконечник в раствор микросферы. Добавить небольшую каплю микросферы раствора в каждую секцию , примыкающей к интересующей области (рис 3C). Будьте осторожны, чтобы не получить микросферы в пределах области, представляющей интерес.
3. Сухие слайды при комнатной температуре (защищенном от света месте) в течение 30 мин при обработке слайдов в этот день. Если нет, то поместите слайды в коробке слайдов при 4 ° С.
   Примечание: До тех пор пока раствор микросферы высыхает до увлажняющим между слайдами, милиcrospheres будет оставаться приклеены к слайдах во время многократных циклов окрашивания / визуализации.

5. Несколько раундов окрашивающего

Примечание: Выбирая согласованная последовательность изображений, окрашивания и этапы reimaging, можно обнаружить и совместно локализовать многие биологические сигналы на той же секции ткани. Каждый раунд визуализации / окрашивания / reimaging должен быть разработан для конкретного гистологического вопроса. Последовательность изображений / окрашивания / reimaging обычно включает в себя приобретение эндогенные флуоресцентные сигналы (например, сотовой связи, GFP минерализация красители, в естественных условиях зонды визуализации) на первом этапе обработки изображений с последующим флуоресцентным мультиплексной иммунным окрашиванием и несколько раундов ферментных пятен активности. И, наконец, раздел может быть окрашивали с использованием хромогенные красители (например, H & E, толуидиновым синим, Safranin O и т.д.) , чтобы выделить архитектуру ткани. Представленные в данном разделе, специальные методы, адаптированные изкоммерчески доступные протоколы.

1. Кальцеин синего окрашивания накопленного минерала
   Примечание: Кальцеин синего окрашивания дает последовательную минеральную поверхность, которая поддается автоматическому анализу изображения в отличие от темнопольный или дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображений. Проблема с кальцеиновой синего окрашивания является то , что спектр флуоресценции перекрывается с тетрациклин и демеклоциклина маркировки. Поэтому, если образец содержит эти минеральные этикетки, изображение метки в первом раунде визуализации предварительного окрашиванию кальцеиновой синим.
   1. Если эндогенные сигналы в ткани изображаются до этой стадии окрашивания, погрузить слайды из предыдущего раунда визуализации в Коплин банку, заполненную 1xPBS, пока крышка проскальзывает не отпасть от слайдах. Удалите и высушите крышку слипы.
   2. Готовят 30 мг / мл кальцеиновой синий раствор в 2% раствором NaHCO ₃ (при растворении 2 г NaHCO ₃ в 100 мл H ₂ O и регулироватьИнг до рН 7,4 с помощью HCl). Алиготе и хранить раствор при -20 ° С.
   3. Погрузитесь слайдов в Коплин сосуд, содержащий 1X PBS в течение 15 мин, чтобы гидратировать секции, если они уже не гидратированных из предыдущего раунда.
   4. Удалить слайды и высушить заднюю часть и края с бумажным полотенцем.
   5. Применить 100 - 500 мкл кальцеиновой синий раствор на слайд и инкубировать в течение 10 мин в камере влажности при комнатной температуре.
   6. Промыть слайдов в 1x PBS в течение 10 мин с 3-х изменений.
   7. Применить ~ 200 мкл 50% глицерина в 1x PBS к каждому слайду и смонтировать покровное.
   8. Удалите излишки глицерина и высушить в нижней части слайдов.
2. Тартрат устойчивостью кислой фосфатазы (TRAP) ферментативную активность окрашивания
   Примечание: TRAP выражается несколькими типами клеток в гемопоэтической линии, включая остеокласты. TRAP окрашивание , представленные здесь использует желтый кислой фосфатазы субстрат флуоресцентный. Некоторые флуоресцентные сигналы будут OVerlap с настраиваемой желтый набор фильтров, включая тетрациклина / демеклоциклина минерализацией этикетки, кальцеиновыми синий краситель, и DAPI контрастирующая.
   1. Погрузите слайды из предыдущего раунда визуализации в Коплин банку, заполненную 1x PBS до тех пор, пока крышка слипы отпасть от слайдах. Удалите и высушите крышку слипы.
   2. Готовят буфер 1 путем растворения 9,2 г ацетата безводного натрия и 11,4 г дигидрата двухосновного тартрата натрия в воде и доведение до конечного объема 1000 мл. Доводят рН до 4,2 с концентрированной ледяной уксусной кислоты (~ 1,5 - 2 мл). Хранить раствор при температуре 4 ° C в течение до 12 месяцев.
   3. Подготовка буфера 2 путем растворения 40 мг нитрита натрия в воде и доведение до конечного объема 1 мл. Хранить раствор при 4 ° С в течение до 1 недели.
   4. В день окрашивания, готовят Реакционный буфер путем смешивания 7,5 мл буфера 1 и 150 мкл буфера 2.
   5. Нанести буфер реакции без субстрата на слайдес в течение 10 - 15 мин для уравновешивания ткани при более низком рН.
      Примечание: Типичный объем составляет ~ 200 мкл, но должен быть достаточно большим, чтобы охватить все разделы.
   6. Развести желтый флуоресцентный кислую фосфатазу субстрат между 1:50 и 1: 100 в буфере для реакции.
      Примечание: Разбавление будет диктоваться ТРАППОВОГО активности в образце.
   7. Налейте буфер реакции от слайдов и применять буфер реакции с желтым флуоресцентным субстратом к слайдам.
   8. Поместите слайды под черным светом УФ на ~ 5 мин, чтобы активировать субстрат.
      Примечание: Время инкубации может изменяться в зависимости от активности TRAP в образце.
   9. Промыть слайдов в 1x PBS в течение 10 мин с 3-х изменений.
   10. Применить ~ 200 мкл 50% глицерина в 1x PBS к каждому слайду и смонтировать покровное.
   11. Удалите излишки глицерина и высушить в нижней части слайдов.
       Примечание: Кислотный буфер TRAP будет декальцинировать секции. Дополнительным преимуществом decalcificaние в том , что некоторые цвета будут снова доступны для окрашивания вниз по течению (например, минерализация этикетки). Например, кальцеин синего окрашивания будут удалены в процессе Ловушку окрашивания. Поэтому DAPI контрастирующая могут быть отображены в данном канале в течение последующего раунда.
3. Щелочной фосфатазы (AP) ферментативную активность окрашивания
   Примечание: Несколько типов клеток, связанные с минерализацией включая остеобласты и Минерализующая хондроциты выразить AP. Быстрый Красный субстрат, используемый в этом протоколе вызывает как флуоресцентный красный и пигментной красный сигнал светофора. Из-за этого хромогенного субстрата утолит флуоресцентные сигналы в тех регионах, где подложка выпадает в осадок. Поэтому, лучше всего сделать это после того, как пятно визуализации флуоресцентных сигналов, которые могут быть закаленных субстратом AP.
   1. Погрузите слайды из предыдущего раунда визуализации в Коплин банку, заполненную 1x PBS до тех пор, пока крышка слипы отпасть от слайдах. Remoве и высушить покровных стеклах.
   2. Готовят 1 М Трис путем растворения 12,1 г Трис в 100 мл воды. Регулировка рН до 9,5 с помощью 1 М NaOH.
   3. Готовят 1 М MgCl ₂ гексагидрат растворением 20,33 г MgCl ₂ в 100 мл деионизированной воды.
   4. Приготовьте 2 М NaCl, растворяя 11,68 г NaCl в 100 мл деионизированной воды.
   5. Готовят 100x (20 мг / мл) раствор быстропротекающих Red TR соль путем растворения 1 г порошка в 50 мл деионизированной воды. Сделайте 100 мкл аликвоты и хранить при температуре -20 ° C.
   6. Готовят 100x (10 мг / мл) фосфатного запас нафтол AS-МХ раствор путем растворения 500 мг порошка в 50 мл N, N диметилформамида. Сделайте 100 мкл аликвоты и хранить при температуре -20 ° C.
   7. В день окрашивания, подготовить буфер AP путем добавления 1 мл 1 М Трис, 0,5 мл 1 М MgCl _2, 0,5 мл 2 М NaCl и довести до конечного объема 10 мл с использованием деионизированной воды (конечные концентрации: 100 мм Трис, 50 мМ MgCl _2, 100 мМ NaCl).
   8. Поместите AP бuffer на каждом слайде и инкубировать во влажной камере в течение 10 мин при комнатной температуре.
   9. Готовят буфер подложки AP путем разбавления 100X запасы Fast Red TR Соль и нафтол AS-MX до 1 раза в буфере AP.
   10. Налейте AP буфера от слайдов и заменить буфером AP подложки. Инкубируйте слайды в течение 5 - 10 мин в камере влажности при комнатной температуре.
       Примечание: Время инкубации будет диктоваться AP активности образца.
   11. Промыть 3 раза скользит в 1X PBS в течение 5 мин каждый.
   12. Установить крышку сползает с раствором DAPI counterstaining (1: 1000 разбавления DAPI в 50% глицерина в 1x PBS).
4. Толуидиновый синий O (TB) хромогенная окрашивание
   Примечание: Поскольку все предыдущие шаги изображаются под временной водной монтажа в 50% глицерина / раствора PBS, хромогенного стадия также изображается в водных условиях. Тем не менее, красящий раствор может иметь тенденцию к выщелачиванию в течение долгого времени. Таким образом, предлагается к изображению толуидиновым синим как можно скорее после окрашивания.
   1. Погрузите слайды из предыдущего раунда визуализации в Коплин банку , заполненную деионизированной водой до тех пор , пока крышка слипы отпасть от слайдах. Удалите и высушите крышку слипы.
   2. После снятия крышки слипы, заменить свежей водой и инкубировать слайды в течение не менее 10 мин, так что соли из РФБ, в достаточной степени удалены из ткани.
   3. Готовят 0,025% раствора ТБТ в деионизированной воде.
   4. Поместите слайды в растворе ТБ в течение 1 - 5 мин.
      Примечание: Время инкубации зависит от предпочтений пользователя, но следует держать одинаковым во всех образцах.
   5. Место слайды в Коплин банку с деионизированной водой и мыть слайдов 3x в течение 5 минут каждый.
   6. Установить крышку скольжения с 30% глицерина , растворенного в деионизированной воде (НЕ 1x PBS , поскольку это приведет к пятно вымываться из ткани). Примечание: Глицерин гистологическая среда может быть замещена фруктозный сироп, который помогает предотвратить диффузию пятна из ткани. кподготовить фруктозный сироп, растворить 30 г фруктозы в 10 мл деионизированной воды и нагревают до 60 ° С до растворения.

6. Несколько раундов визуализации

1. Загрузите слайды в микроскоп лотки (рис 3D).
   Примечание: Лотки подпружинены.
2. Вставьте лотки в стек лоток слайд - сканирования микроскопа (рис 3Е).
3. Нажмите на список профилей, чтобы загрузить профиль для каждого слайда с соответствующими экспозициями для каждого флуорофора. Нажмите на название слайд, чтобы назвать каждого слайда вручную или программное обеспечение чтения штрих-код, предусмотренный на этикетке слайд. Нажмите кнопку Предварительный просмотр сканирования начать принимать изображение для предварительного просмотра слайда.
4. Установить регионы, представляющие интерес в мастере обнаружения тканей и сохранить их для последующих раундов визуализации. После того, как каждый слайд установки, запустите процесс сканирования, нажав на кнопку запуска сканирования.
   Примечание: Система может содержать до 100 SLIдез одновременно.
5. После завершения формирования изображения, экспортировать изображения из каждого отдельного канала и формирования изображения круглыми, как .tif или .jpg файлы для сборки и анализа изображений.

7. Изображение Ассамблея

1. Ручной метод с использованием Photoshop (или подобное программное обеспечение для редактирования изображений, способных производить многослойные изображения).
   1. Открыть каждого отдельного канала изображения с каждого раунда визуализации.
   2. Собрать отдельные изображения в виде слоев в пределах одного составного изображения. Для этого щелкните на слое в палитре слоев из одного изображения. Затем перетащите слой на другое изображение. Это операция перетаскивания создаст новый слой в изображении. Сделайте это для всех других изображений. В качестве альтернативы, используйте скрипт (Файл> Сценарии> Загрузить файлы в стек ...), чтобы автоматизировать этот процесс путем загрузки нескольких файлов изображений в качестве слоев в стеке изображений.
   3. После того, как каждое изображение в списке в качестве отдельного слоя в комбинированном изображении, дважды щелкните по имени слоя, чтобы переименовать лаYers по мере необходимости различать разные каналы.
   4. Для того чтобы увидеть через каждый слой и создать действительно составного изображения, измените режим смешивания для каждого слоя из "Normal" на "Screen" в палитре слоев.
      Примечание: Чтобы ускорить этот шаг, изменить один слой на экране, а затем щелкните правой кнопкой мыши на слое, выберите "стиль слоя копия", а затем выделить все остальные слои и выберите "Вставить стиль слоя", чтобы применить стиль экрана к другому слои.
   5. При желании уменьшить непрозрачность (изменить значение на 10 - 40%) хромогенного слоя (то есть, толуидиновым синим) , чтобы лучше визуализировать флуоресцентные сигналы через хромогенного слой.
      Примечание: плиточный сканирующий микроскоп используется в данном протоколе держит слайды на 3-х ребер, тем самым сводя к минимуму количество вращения, которое может произойти на слайд во время каждого раунда визуализации. Таким образом, это намного проще для пользователя, чтобы вручную выравнивать изображения без необходимости поворачивать изображения, полученныеиз различных этапов обработки изображений.

Результаты

Общий рабочий процесс для высокой пропускной способности , Multi-Image Cryohistology

На рисунке 1 представлен общий рабочий процесс , используемый для этой техники. Она включает в себя несколько шагов от фиксации через ...

Обсуждение

Здесь мы представили подробный протокол cryohistology к сотрудничеству локализовать и количественно оценить несколько биологических мер, совместив изображения с нескольких раундов окрашивания / визуализации на одном участке. Способ изложены с использованием cryotape особенно полезна , поскол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128-4L	Multiple suppliers available. Toxic. Can be substituted with 4% paraformaldehyde.
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378	Multiple suppliers available.
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Multiple suppliers available.
Cryomolds	Fisher Scientific	Fisherbrand #22-363-554	Different sizes can be used depending on tissue
Cryomatrix	Thermo Scientific	6769006	Can be substitituted with other cryomatrices. However, PVA/PEG-based resins have worked best in our hands.
2-methyl-butane	Sigma Aldrich	M32631	Multiple suppliers available.
Cryostat	Leica Biosystems	3050s	Can be substituted with other brands/models.
Specimen disc	Leica Biosystems	14037008587	Can be substituted with other brands/models.
Cryostat blades	Thermo Scientific	3051835	Can be substituted with other brands/models.
Cryotape	Section Lab	Cryofilm 2C
Roller	Electron Microscopy Sciences	62800-46	Can be substituted with other brands/models.
Plastic microscope slides	Electron Microscopy Sciences	71890-01	Can be substituted with other brands/models.
Glass microscope slides	Thermo Scientific	3051	Can be substituted with other brands/models.
Norland Optical Adhesive, 61	Norland Optical	Norland Optical Adhesive, 61
UV Black Light	General Electric	F15T8-BLB
Glacial acetic acid	Sigma Aldrich	ARK2183	Multiple suppliers available.
Chitosan	Sigma Aldrich	C3646	Multiple suppliers available.
InSpeck red microscopheres	ThermoFisher Scientific	I-14787
InSpeck green microspheres	ThermoFisher Scientific	I-14785
Calcein Blue	Sigma Aldrich	M1255	Multiple suppliers available.
Calcein	Sigma Aldrich	C0875	Multiple suppliers available.
Alizarin complexone	Sigma Aldrich	A3882	Multiple suppliers available.
Demeclocycline	Sigma Aldrich	D6140	Multiple suppliers available.
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761	Multiple suppliers available.
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Multiple suppliers available.
ELF 97 yellow fluorescent acid phosphatase substrate	ThermoFisher Scientific	E-6588
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Multiple suppliers available. Can be substituted with Hoechst 33342 or other nuclear dyes.
TO-PRO-3 (Cy5 nuclear counterstain)	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	R37108	Multiple suppliers available.
Sodium acetate anhydrous	Sigma Aldrich	S2889	Multiple suppliers available.
sodium tartrate dibasic dihydrate	Sigma Aldrich	T6521	Multiple suppliers available.
Sodium nitrite	Sigma Aldrich	S2252	Multiple suppliers available.
Tris	Sigma Aldrich	15504	Multiple suppliers available.
MgCl2 hexahydrate	Sigma Aldrich	M9272	Multiple suppliers available.
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Multiple suppliers available.
Fast Red TR Salt	Sigma Aldrich	F8764	Multiple suppliers available. Can also be substituted with other substrate kits such as Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX	Sigma Aldrich	N4875	Multiple suppliers available.
N,N dimethylformamide	Sigma Aldrich	D158550	Multiple suppliers available.
Toluidine blue O	Sigma Aldrich	T3260	Multiple suppliers available.
Axio Scan.Z1	Carl Zeiss AG	Axio Scan.Z1	Other linear or tiled scanners may also be used.
DAPI Filter Set	Chroma Technology Corp.	49000
CFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49001
GFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49020
YFP Filter Set	Chroma Technology Corp.	49003
Custom yellow (ELF 97) Filter Set	Chroma Technology Corp.	custom; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC Filter Set	Chroma Technology Corp.	49004
Cy5 Filter Set	Chroma Technology Corp.	49009
CryoJane Tape Transfer System	Electron Microscopy Sciences	62800-10	Multiple suppliers available.
CryoJane Tape Windows	Electron Microscopy Sciences	62800-72	Multiple suppliers available.
CryoJane Adhesive Slides	Electron Microscopy Sciences	62800-4X	Multiple suppliers available.