التوصيف المظهري لالضامة من الكلى الجرذ بواسطة التدفق الخلوي

Summary

توضح هذه المخطوطة بروتوكول مفصلة عن المظهرية والتحليل الكمي الضامة المقيمين من الكلى الفئران عن طريق التدفق الخلوي. الخلايا الملون الناتجة يمكن أن تستخدم أيضا لتطبيقات أخرى، بما في ذلك فرز الخلايا، تحليل التعبير الجيني أو الدراسات الوظيفية، وبالتالي زيادة المعلومات التي تم الحصول عليها في النموذج التجريبي.

Abstract

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

Introduction

Renal disease is a global health problem, with increased prevalence, and associated with elevated morbidity and mortality¹. One of the most important mechanisms involved in the progression and development of renal injury is inflammation, mainly triggered by macrophages. Macrophages play a pivotal role in many inflammatory diseases, including renal disorders². Thus, an elevated presence of infiltrating macrophages has been reported in biopsies from patients with acute kidney injury (AKI) or chronic kidney disease (CKD)^3,4. Recent studies suggest that the long-term outcome of renal disease could be controlled by macrophages^5,6. In response to the local microenvironment, macrophages may differentiate into different phenotypes that play diverse biological functions⁷. Two well differentiated macrophage phenotypes have been established: classically activated macrophages (M1 macrophages) and alternatively activated macrophages (M2)⁸. M1 macrophages promote inflammation, whereas M2 macrophages have an anti-inflammatory role and are involved in tissue repair⁹. Therefore, a better knowledge of macrophage heterogeneity is necessary to understand their regulation and contribution to renal pathology and develop novel therapeutic approaches.

Both, murine and rats models have been widely used to understand the molecular and cellular mechanism involved in renal injury¹⁰. However, there are substantial differences in the diverse markers used to identify macrophages phenotypes between these rodents. Hence, several murine markers, such as F4/80 or Ly6C are not used in rats, thus limiting the extrapolation of findings between these species. Moreover, there is a limited number of markers describing macrophage phenotypes in rats, explaining the scarce studies analyzing macrophage heterogeneity in these animals as compared with mice. Therefore, new strategies for macrophage subset characterization are necessary to understand the role of macrophages in renal disease models in rats.

This manuscript describes a protocol for the phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. This technique can be further followed by several assays, including cell sorting and mRNA or protein expression studies to allow in-depth characterization of the role of macrophages in renal disease.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل المحلية المؤسسي رعاية الحيوان واللجان استخدم التالية التوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي الصادر عن البرلمان الأوروبي والإرشاد القومي 53/2013.

1. إعداد الكواشف وحلول

1. إعداد جميع الكواشف والحلول تحت ظروف معقمة وتستخدم تحت غطاء تدفق الصفحي. حافظ على الحلول في 4 درجات مئوية.
2. إعداد عازلة تلطيخ (2٪ مصل بقري جنيني (FBS) في برنامج تلفزيوني 1X Dulbecco و).
3. يعد حل كولاجيناز بإضافة 0.5 ملغ من كولاجيناز لكل مل من المياه المالحة.
4. يعد حل التخدير الكيتامين / زيلازين (2: 1 ت / ت).

2. الكلى الإرواء واستخراج

1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين / زيلازين (75 ملغ / 12 ملغم / كغم من وزن). بعناية قرصة أضعاف صغيرة من الجلد، للتأكد من أن هذا الحيوان هو تخدير بما فيه الكفاية. ثم، وتغطية العينين مع مرهم بيطري لمنع جفاف بينما تحت التخدير. ملاحظة: 4-مونوتستخدم الفئران ويستار عشر من العمر في هذا الاختبار.
2. مرة واحدة يتم تخدير الفئران تماما، ووضعه على طاولة العمليات الجراحية في موقف ضعيف.
3. تطبيق 70٪ من الإيثانول في البطن.
4. جعل شق المركزي من خلال الجلد في منطقة البطن والصفاق، من العانة إلى القفص الصدري، لفضح تجاويف الجنبي والبطن.
5. حقن محلول ملحي (0.9٪) في الشريان الأورطي البطني ليروي الكلى باستخدام نظام نضح حتى تتم إزالة كل الدم من الكليتين. قطع الشريان الأورطي على مستوى البطن للمساعدة في الافراج الدم.
6. إزالة كل من الكليتين من الفئران عن طريق قطع من نقير كلوي (الوريد الكلوي، الشريان والحالب). لdecapsulate الكلى، اضغط على حافة الكلى باستخدام الأصابع، التي تفصل بعناية كبسولة ^11.
7. وضع الكلى في محلول ملحي متوازن هانكس ".

الهضم 3. الكلى وتعليق خلية

1. قطع نصف الكلى مع مقص الى قطع صغيرة وضعتقطع في أنبوب 1.5 مل.
   ملاحظة: يتم احتساب جميع التركيزات التالية ل1 عينة (الكلى 1/2 فأر).
2. إضافة 1 مل من محلول كولاجيناز واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. مزيج من قبل انعكاس كل 5 دقائق للتأكد من أن الحل كولاجيناز بالوصول إلى الأنسجة بأكملها.
3. جمع الحل وتمريرها من خلال مصفاة (40 ميكرون) بمساعدة الغواص، و resuspend في 10 مل من العازلة تلطيخ.
4. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 15 دقيقة.
5. إعادة تعليق بيليه في 1 مل ACK (الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم) الناشر العازلة. بعد 1 دقيقة و 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة، إضافة 10 مل من العازلة تلطيخ لوقف التفاعل.
6. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
7. إعادة تعليق بيليه في حجم كاف من تلطيخ عازلة (1 مل) وتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة (30 ميكرون).
8. حساب عدد الخلايا باستخدام استبعاد التريبان الأزرق على عدادة الكريات وإضافة 2 مليون خلية إلى أنبوب 1.5 مل لستاining.

4. خلية تحليل تلطيخ والتدفق الخلوي

1. خلايا الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
2. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من مصل الفئران (المخفف 1: 100) لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لمنع مستقبلات لكرة القدم.
3. غسل بإضافة 1 مل من العازلة تلطيخ وأجهزة الطرد المركزي 100 x ج لمدة 5 دقائق.
4. مزيج الأجسام المضادة لتلطيخ سطح الخلية في 100 ميكرولتر من العازلة تلطيخ لكل حالة: CD45 APC-Cy7 (1: 100)، CD163 A647 (4: 100)، والحل للكشف عن الخلايا الحية (3: 1000).
5. إعادة تعليق بيليه خلية في مزيج الأجسام المضادة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
6. غسل بإضافة 1 مل من العازلة تلطيخ وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة.
7. إضافة 600 ميكرولتر من التثبيت حل / Permeabilization لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
8. اغسل 2 مرات مع 1 مل العازلة Permeabilization / غسيل وأجهزة الطرد المركزي في 170 x ج لمدة 5 دقائق.
9. إضافة الجسم المضاد CD68 FITC (35: 1000) لintracelتلطيخ lular إلى 100 ميكرولتر من العازلة Permeabilization / غسيل لكل حالة.
10. إعادة تعليق بيليه في حل CD68 الأجسام المضادة واحتضان 50 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
11. تغسل مع 1 مل العازلة Permeabilization / غسيل وأجهزة الطرد المركزي في 170 x ج لمدة 5 دقائق.
12. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من العازلة Permeabilization / غسيل، إضافة CD86PE الأجسام المضادة (35: 1000)، واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
13. غسل بإضافة 1 مل من Permeabilization / غسيل العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
14. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من العازلة Permeabilization / غسيل وتمريرها إلى التدفق الخلوي أنبوب.
15. تحليل العينات عن طريق التدفق الخلوي. تحديد تلطيخ CD45 في الخلايا الحية مسور في ضوء / الضوء المتناثرة إلى الأمام، متناثرة الجانبية (/ FSC SSC) نافذة. في الخطوة الثانية، وتحليل CD86 والتعبير CD163 في خلايا CD68 ^+.

النتائج

قمنا بتحليل بلعم عدم التجانس في نموذج تجريبي من التهاب الإصابة الكلوية يرتبط بزيادة جود تسلل الضامة في الكلى. في هذا النموذج، وكان المستحث تلف الكلى من قبل إدارة الألدوستيرون (1 ملغ ^-1 كغم ^-1 اليوم)، بالإضافة إلى الملح (كلوريد الصوديوم 1٪) ف?...

Discussion

الضامة هي خلايا غير المتجانسة التي تلعب دورا مهما في الأمراض الالتهابية المختلفة، بما في ذلك اضطرابات الكلى. وهناك اهتمام متزايد في توصيف الضامة فرعية في أمراض الكلى لأن كل حيوانية بلعم يساهم بطريقة مختلفة لتنمية إصابة الكلى، كما ورد في التهاب كبيبات الكلى، اعتلال ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminar flow hood	Faster		Or equivalent equipment
Centrifuge	Hettich		Or equivalent equipment
Flow cytometer (FACSAria)	BD Biosciences
Fetal bovine serum	BioWest	S1820-500
PBS 10x	LONZA	BE17-515Q
Collagenase	Sigma-Aldrich	12/1/9001
ACK Lysing Buffer	Thermo Fisher Scientific	A10492-01
Flow cytometry strainers	BD Biosciences	340626
Falcon cell strainers	Thermo Fisher Scientific	352340
Flow cytometry tubes	Falcon	352052	5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube
Centrifuge tubes	Corning centristar	430791
Water bath	Memmert GmbH + Co. KG	WNE 7	37 °C
Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer	BD Biosciences	554714
Rompum (Xylazine)	Bayer		Or equivalent
Ketalar (Ketamine)	Pfizer		Or equivalent
Hanks’ balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H8264-500ML
Saline solution	Braun	622415
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7	Biolegend	202216	Diluted 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITC	Bio-RAD	MCA341F	Diluted 35:1,000
anti-CD86 (clone: 24F) PE	Biolegend	200307	Diluted 35:1,000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647	Bio-RAD	MCA342R	Diluted 4:100
Live/dead stain	Molecular Probes	L34955	Diluted 3:1,000