אפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה עכברוש ידי cytometry זרימה

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט פנוטיפי ניתוח כמותי של מקרופאגים תושב מכליות עכברוש ידי cytometry זרימה. התאים המוכתמים וכתוצאה מכך ניתן להשתמש גם ליישומים אחרים, כוללים מיון תא, ניתוח ביטוי גנים או מחקרים פונקציונליים, ובכך מגדילים את המידע שהתקבל במודל הניסיון.

Abstract

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

Introduction

Renal disease is a global health problem, with increased prevalence, and associated with elevated morbidity and mortality¹. One of the most important mechanisms involved in the progression and development of renal injury is inflammation, mainly triggered by macrophages. Macrophages play a pivotal role in many inflammatory diseases, including renal disorders². Thus, an elevated presence of infiltrating macrophages has been reported in biopsies from patients with acute kidney injury (AKI) or chronic kidney disease (CKD)^3,4. Recent studies suggest that the long-term outcome of renal disease could be controlled by macrophages^5,6. In response to the local microenvironment, macrophages may differentiate into different phenotypes that play diverse biological functions⁷. Two well differentiated macrophage phenotypes have been established: classically activated macrophages (M1 macrophages) and alternatively activated macrophages (M2)⁸. M1 macrophages promote inflammation, whereas M2 macrophages have an anti-inflammatory role and are involved in tissue repair⁹. Therefore, a better knowledge of macrophage heterogeneity is necessary to understand their regulation and contribution to renal pathology and develop novel therapeutic approaches.

Both, murine and rats models have been widely used to understand the molecular and cellular mechanism involved in renal injury¹⁰. However, there are substantial differences in the diverse markers used to identify macrophages phenotypes between these rodents. Hence, several murine markers, such as F4/80 or Ly6C are not used in rats, thus limiting the extrapolation of findings between these species. Moreover, there is a limited number of markers describing macrophage phenotypes in rats, explaining the scarce studies analyzing macrophage heterogeneity in these animals as compared with mice. Therefore, new strategies for macrophage subset characterization are necessary to understand the role of macrophages in renal disease models in rats.

This manuscript describes a protocol for the phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. This technique can be further followed by several assays, including cell sorting and mRNA or protein expression studies to allow in-depth characterization of the role of macrophages in renal disease.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי טיפול מקומי מוסדיים בעלי חיים ועדות השתמש בעקבות ההוראה 2010/63 / האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי הלאומי מנחה 53/2013.

1. הכנת ריאגנטים ופתרונות

1. יש להכין את כל ריאגנטים ופתרונות בתנאים סטריליים ולהשתמש מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. שמור פתרונות על 4 מעלות צלזיוס.
2. הכן חיץ מכתים (2% עוברית שור סרום (FBS) ב- PBS של 1x Dulbecco).
3. כן פתרון collagenase ידי הוספת 0.5 מ"ג של collagenase לכל מיליליטר של תמיסת מלח.
4. כן פתרון הרדמה של קטמין / xylazine (2: 1 v / v).

כליות 2. זלוף הפקה

1. להרדים חולדות בזריקה intraperitoneal של קטמין / xylazine (75 מ"ג / 12 מ"ג / משקל ק"ג). בזהירות קמצוץ קפל קטן של העור, כדי לבדוק כי בעל החיים הוא הרדים מספיק. לאחר מכן, לכסות את העיניים עם משחת וטרינר כדי למנוע יובש לאחר הרדמה. הערה: 4-monה בן חולדות Wistar משמשות assay זה.
2. לאחר העכברוש הוא מורדם לחלוטין, והנח אותו על שולחן ניתוחים במצב שכיבה.
3. החל 70% אתנול אל הבטן.
4. ביצוע חתך מרכזי דרך העור הצפק בטן, מן החיק אל כלוב הצלעות, לחשוף את חללי פלאורלי ו בטן.
5. להזריק תמיסת מלח (0.9%) לתוך אבי העורקים בבטן כדי perfuse הכליות באמצעות מערכת טפטוף עד שכל הדם יוסר הכליות. חותכים את אבי העורקים ברמת הבטן כדי לעזור לשחרר את הדם.
6. הסר את שתי הכליות מן החולדה על ידי חיתוך מן hilum כליות (עורק הכליה, העורק שופכן). כדי decapsulate הכליה, לחץ על הקצה של הכליה באמצעות אצבעות, בזהירות להפריד הקפסולה ^11.
7. מניחים את כליה לתוך תמיסת מלח מאוזנת "הנקס.

3. עיכול כליות תרחיף תא

1. חותכים חצי כליה במספריים לחתיכות קטנות ולשים אתחתיכות לתוך צינור 1.5 מ"ל.
   הערה: כל הריכוזים הבאים מחושבים 1 מדגם (כליות של עכברוש 1/2).
2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת collagenase לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מערבבים על ידי היפוך כל 5 דקות כדי לוודא כי פתרון collagenase ניגש הרקמה כולה.
3. לאסוף את הפתרון ולהעביר אותו דרך מסננת (40 מיקרומטר) בעזרת הבוכנה, ואת resuspend אותו 10 מ"ל של חיץ מכתים.
4. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 15 דקות.
5. Re- להשעות גלולה ב 1 מ"ל ACK (אמוניום-כלוריד-אשלגן) lysing הצפת. לאחר 1 דקות 30 שניות בטמפרטורת החדר, להוסיף 10 מ"ל של חיץ מכתים כדי לעצור את התגובה.
6. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות.
7. Re- להשעות הגלולה בנפח נאות מכתים חיץ (1 מיליליטר) ולסנן את השעית התא באמצעות מסננת (30 מיקרומטר).
8. ספירת התאים באמצעות הרחקה trypan כחול על hemocytometer ולהוסיף 2 מיליון תאים לצינור 1.5 מ"ל עבור staining.

4. Cell מכתים ניתוח תזרים Cytometry

1. תאי צנטריפוגה ב 100 XG במשך 5 דקות.
2. Re- להשעות גלולה ב 100 μl של סרום חולדה (מדולל 1: 100) במשך 10 דקות ב 4 ° C לחסום קולטני Fc.
3. לשטוף ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ מכתים XG צנטריפוגות 100 במשך 5 דקות.
4. מערבבים את נוגדנים מכתים פני התא ב 100 μl של חיץ מכתים עבור כל תנאי: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) פתרון כדי לזהות תאים חיים (3: 1,000).
5. Re- להשעות את התא גלולה בתמהיל נוגדן עבור 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
6. לשטוף ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ צנטריפוגות מכתים ב 100 XG במשך 5 דקות. חזור על שלב זה.
7. להוסיף 600 μl של פתרון קיבוע / Permeabilization במשך 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
8. לשטוף 2 פעמים עם 1 מ"ל חיץ צנטריפוגות Permeabilization / שטפי ב 170 XG במשך 5 דקות.
9. מוסיפים את הנוגדן CD68 FITC (35: 1000) עבור intracelמכתים lular 100 μl של חיץ Permeabilization / לשטוף עבור כל תנאי.
10. Re- להשעות גלולה בפתרון נוגדנים CD68 ו דגירה 50 דקות ב 4 ° C בחושך.
11. לשטוף עם 1 מ"ל חיץ צנטריפוגות Permeabilization / שטפי ב 170 XG במשך 5 דקות.
12. Re- להשעות גלולה ב 100 μl של חיץ Permeabilization / Wash, להוסיף נוגדן CD86PE (35: 1000) ו דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
13. לשטוף ידי הוספת 1 מ"ל של Permeabilization / לשטוף חיץ צנטריפוגות ב 100 XG במשך 5 דקות.
14. Re- להשעות גלולה ב 100 μl של חיץ Permeabilization / לשטוף ולהעביר אותו תזרים cytometry צינור.
15. ניתוח דגימות על ידי cytometry הזרימה. לקבוע מכתים CD45 ב תאי חיים מגודרים האור המפוזר-Side / אור-המפוזר קדימה חלון (SSC / FSC). במקום השני בשלב, לנתח CD86 וביטוי CD163 בתאים CD68 ^+.

תוצאות

ניתחנו ההטרוגניות מקרופאג במודל ניסיוני דלקתיות של פגיעה כלייתית הקשורים נוכחות מוגברת של הסתננות מקרופאגים בכליות. במודל זה, נזק כלייתי הושרה על ידי הממשל של אלדוסטרון (1 מ"ג ^-1 ק"ג ^-1 יום) בתוספת מלח (% NaCl 1) במי שתייה במשך 3 שבועות בחול...

Discussion

המקרופאגים הם תאים הטרוגנית לשחק תפקיד חשוב במחלות דלקתיות שונות, כולל הפרעות כליות. יש התעניינות גוברת באפיון של תת מקרופאגים מחלת כליות כי כל תת-אוכלוסיית מקרופאג תורמת בצורה שונה להתפתחות פגיעה כלייתית, כפי שדווחה גלומרולונפריטיס, נפרופתיה סוכרתית בסרטן הכליות <...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminar flow hood	Faster		Or equivalent equipment
Centrifuge	Hettich		Or equivalent equipment
Flow cytometer (FACSAria)	BD Biosciences
Fetal bovine serum	BioWest	S1820-500
PBS 10x	LONZA	BE17-515Q
Collagenase	Sigma-Aldrich	12/1/9001
ACK Lysing Buffer	Thermo Fisher Scientific	A10492-01
Flow cytometry strainers	BD Biosciences	340626
Falcon cell strainers	Thermo Fisher Scientific	352340
Flow cytometry tubes	Falcon	352052	5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube
Centrifuge tubes	Corning centristar	430791
Water bath	Memmert GmbH + Co. KG	WNE 7	37 °C
Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer	BD Biosciences	554714
Rompum (Xylazine)	Bayer		Or equivalent
Ketalar (Ketamine)	Pfizer		Or equivalent
Hanks’ balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H8264-500ML
Saline solution	Braun	622415
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7	Biolegend	202216	Diluted 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITC	Bio-RAD	MCA341F	Diluted 35:1,000
anti-CD86 (clone: 24F) PE	Biolegend	200307	Diluted 35:1,000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647	Bio-RAD	MCA342R	Diluted 4:100
Live/dead stain	Molecular Probes	L34955	Diluted 3:1,000