Caractérisation phénotypique des macrophages du Rat Kidney par cytométrie de flux

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour phénotypiques et l'analyse quantitative des macrophages résidents de reins de rats par cytométrie de flux. Les cellules colorées ainsi obtenues peuvent également être utilisées pour d'autres applications, y compris le tri cellulaire, l'analyse de l'expression des gènes ou des études fonctionnelles, augmentant ainsi les informations obtenues dans le modèle expérimental.

Résumé

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

Introduction

Renal disease is a global health problem, with increased prevalence, and associated with elevated morbidity and mortality¹. One of the most important mechanisms involved in the progression and development of renal injury is inflammation, mainly triggered by macrophages. Macrophages play a pivotal role in many inflammatory diseases, including renal disorders². Thus, an elevated presence of infiltrating macrophages has been reported in biopsies from patients with acute kidney injury (AKI) or chronic kidney disease (CKD)^3,4. Recent studies suggest that the long-term outcome of renal disease could be controlled by macrophages^5,6. In response to the local microenvironment, macrophages may differentiate into different phenotypes that play diverse biological functions⁷. Two well differentiated macrophage phenotypes have been established: classically activated macrophages (M1 macrophages) and alternatively activated macrophages (M2)⁸. M1 macrophages promote inflammation, whereas M2 macrophages have an anti-inflammatory role and are involved in tissue repair⁹. Therefore, a better knowledge of macrophage heterogeneity is necessary to understand their regulation and contribution to renal pathology and develop novel therapeutic approaches.

Both, murine and rats models have been widely used to understand the molecular and cellular mechanism involved in renal injury¹⁰. However, there are substantial differences in the diverse markers used to identify macrophages phenotypes between these rodents. Hence, several murine markers, such as F4/80 or Ly6C are not used in rats, thus limiting the extrapolation of findings between these species. Moreover, there is a limited number of markers describing macrophage phenotypes in rats, explaining the scarce studies analyzing macrophage heterogeneity in these animals as compared with mice. Therefore, new strategies for macrophage subset characterization are necessary to understand the role of macrophages in renal disease models in rats.

This manuscript describes a protocol for the phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. This technique can be further followed by several assays, including cell sorting and mRNA or protein expression studies to allow in-depth characterization of the role of macrophages in renal disease.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par des institutions locales de protection des animaux et l'utilisation des comités suite à la directive 2010/63 / UE du Parlement européen et la ligne directrice nationale 53/2013.

1. Préparation des réactifs et solutions

1. Préparer tous les réactifs et les solutions dans des conditions stériles et à utiliser sous une hotte à flux laminaire. Conserver les solutions à 4 ° C.
2. Préparer tampon de coloration (2% de sérum bovin fœtal (FBS) dans du PBS 1x Dulbecco).
3. Préparer une solution de collagénase en ajoutant 0,5 mg de collagénase à chaque ml de solution saline.
4. Préparer une solution d'anesthésie de la kétamine / xylazine (2: 1 v / v).

2. Kidney Perfusion et Extraction

1. Anesthésier les rats par injection intraperitoneale de kétamine / xylazine (75 mg / 12 mg / kg de poids). pincer délicatement un petit pli de la peau, pour vérifier que l'animal est suffisamment anesthésiée. Ensuite, couvrir les yeux avec vétérinaire onguent pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Note: 4-mone rats Wistar sont utilisés dans cet essai.
2. Une fois que le rat est totalement anesthésié, placez-le sur une table chirurgicale en position couchée.
3. Appliquer 70% d'éthanol dans l'abdomen.
4. Faire une incision centrale à travers la peau abdominale et le péritoine, du pubis à la cage thoracique afin d'exposer les cavités pleurale et abdominale.
5. Injecter une solution saline (0,9%) dans l'aorte abdominale pour perfuser les reins en utilisant un système de perfusion jusqu'à ce que tout le sang est retiré du rein. Couper l'aorte au niveau abdominal pour aider à libérer le sang.
6. Retirer les deux reins du rat en coupant du hile rénal (veine rénale, l'artère et de l'uretère). Pour décapsuler le rein, appuyez sur le bord du rein en utilisant les doigts, séparer soigneusement la capsule ^11.
7. Placer le rein dans une solution saline équilibrée de Hanks.

3. Rein Digestion et Cell Suspension

1. Coupez la moitié d'un rein avec des ciseaux en petits morceaux et mettez-lemorceaux dans un tube de 1,5 ml.
   Remarque: Toutes les concentrations suivantes sont calculés pour 1 échantillon (de rein de 1/2 rat).
2. Ajouter 1 ml de la solution de collagénase et incuber à 37 ° C pendant 30 min. Mélanger par inversion toutes les 5 minutes pour vous assurer que la solution de collagénase accède au tissu entier.
3. Recueillir la solution et le faire passer à travers un filtre (40 pm) à l'aide d'un piston, et remettre en suspension dans 10 ml de tampon de coloration.
4. Centrifuger à 400 g pendant 15 min.
5. Re-suspendre le culot dans 1 ml ACK (Ammonium-Chloride-potassium) Lyse Buffer. Au bout de 1 min 30 sec à la température ambiante, on ajoute 10 ml de tampon de coloration pour arrêter la réaction.
6. Centrifuger à 400 g pendant 10 min.
7. Remettre en suspension le culot dans un volume suffisant de tampon (1 ml) et filtrer la coloration de la suspension cellulaire à l'aide d'un filtre (30 pm).
8. Comptez le nombre de cellules en utilisant l'exclusion du bleu trypan sur un hémocytomètre et ajouter 2 millions de cellules dans un tube de 1,5 ml pour staining.

4. Cellule d'analyse Coloration et cytométrie de flux

1. Centrifuger les cellules à 100 g pendant 5 min.
2. Remettre en suspension le culot dans 100 pl de sérum de rat (dilution 1: 100) pendant 10 min à 4 ° C pour bloquer les récepteurs Fc.
3. Lavage en ajoutant 1 ml de tampon de coloration et de centrifugation 100 g pendant 5 min.
4. Mélanger les anticorps pour la coloration de la surface cellulaire dans 100 pi de tampon de coloration pour chaque condition: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) et de solution pour détecter des cellules vivantes (3: 1000).
5. Remettre en suspension le culot cellulaire dans le mélange d'anticorps pendant 20 minutes à 4 ° C dans l'obscurité.
6. Lavage en ajoutant 1 ml de tampon de coloration et centrifuger à 100 g pendant 5 min. Répétez cette étape.
7. Ajouter 600 ul d'une solution / perméabilisation de fixation pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité.
8. Laver 2 fois avec 1 ml de tampon perméabilisation / Wash et centrifuger à 170 g pendant 5 min.
9. Ajouter l'anticorps CD68 FITC (35: 1000) pour le Intracelcoloration lular à 100 pi de tampon de perméabilisation / Wash pour chaque condition.
10. Remettre en suspension le culot dans la solution de CD68-anticorps et incuber pendant 50 min à 4 ° C dans l'obscurité.
11. Laver avec 1 ml de tampon perméabilisation / Wash et centrifuger à 170 g pendant 5 min.
12. Re-suspendre le culot dans 100 ul de tampon de perméabilisation / Wash, ajouter un anticorps CD86PE (35: 1000) et incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité.
13. Laver en ajoutant 1 ml de perméabilisation / tampon de lavage et de centrifugation à 100 g pendant 5 min.
14. Re-suspendre le culot dans 100 ul de tampon perméabilisation / Wash et de passer à une cytométrie en flux tube.
15. Analyser les échantillons par cytométrie de flux. Déterminer CD45 coloration dans les cellules vivantes gated à la lumière / lumière diffusée vers l'avant-Side dispersés (SSC / FSC) fenêtre. Dans une deuxième étape, l' analyse de CD86 et de l' expression de CD163 dans des cellules CD68 ^+.

Résultats

Nous avons analysé l'hétérogénéité des macrophages dans un modèle expérimental de lésion rénale inflammatoire associée à une présence accrue de l'infiltration des macrophages dans le rein. Dans ce modèle, les lésions rénales a été induite par l' administration de l' aldostérone (1 mg ^{-1 kg -1} jour) plus de sel (NaCl 1%) dans l' eau potable pendant 3 semaines chez les rats Wistar, comme indiqué précédemment ^12.

Discussion

Les macrophages sont des cellules hétérogènes qui jouent un rôle important dans diverses maladies inflammatoires, y compris les troubles rénaux. Il y a un intérêt croissant pour la caractérisation des sous - ensembles des macrophages dans la maladie rénale parce que chaque sous - population macrophage contribue d'une manière différente au développement des lésions rénales, comme indiqué dans la glomérulonéphrite, la néphropathie diabétique et le cancer du rein ^14-16. Dans les premiers s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminar flow hood	Faster		Or equivalent equipment
Centrifuge	Hettich		Or equivalent equipment
Flow cytometer (FACSAria)	BD Biosciences
Fetal bovine serum	BioWest	S1820-500
PBS 10x	LONZA	BE17-515Q
Collagenase	Sigma-Aldrich	12/1/9001
ACK Lysing Buffer	Thermo Fisher Scientific	A10492-01
Flow cytometry strainers	BD Biosciences	340626
Falcon cell strainers	Thermo Fisher Scientific	352340
Flow cytometry tubes	Falcon	352052	5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube
Centrifuge tubes	Corning centristar	430791
Water bath	Memmert GmbH + Co. KG	WNE 7	37 °C
Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer	BD Biosciences	554714
Rompum (Xylazine)	Bayer		Or equivalent
Ketalar (Ketamine)	Pfizer		Or equivalent
Hanks’ balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H8264-500ML
Saline solution	Braun	622415
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7	Biolegend	202216	Diluted 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITC	Bio-RAD	MCA341F	Diluted 35:1,000
anti-CD86 (clone: 24F) PE	Biolegend	200307	Diluted 35:1,000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647	Bio-RAD	MCA342R	Diluted 4:100
Live/dead stain	Molecular Probes	L34955	Diluted 3:1,000