Phänotypische Charakterisierung von Makrophagen aus Rattenniere mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Diese Handschrift beschreibt ein detailliertes Protokoll für phänotypische und quantitative Analyse von Makrophagen aus Rattennieren durch Durchflusszytometrie. Die resultierenden gefärbten Zellen können auch für andere Anwendungen verwendet werden, einschließlich Zellsortierung, Genexpressionsanalyse oder funktionelle Untersuchungen, wodurch die in dem experimentellen Modell erhaltenen Informationen zu erhöhen.

Zusammenfassung

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

Einleitung

Renal disease is a global health problem, with increased prevalence, and associated with elevated morbidity and mortality¹. One of the most important mechanisms involved in the progression and development of renal injury is inflammation, mainly triggered by macrophages. Macrophages play a pivotal role in many inflammatory diseases, including renal disorders². Thus, an elevated presence of infiltrating macrophages has been reported in biopsies from patients with acute kidney injury (AKI) or chronic kidney disease (CKD)^3,4. Recent studies suggest that the long-term outcome of renal disease could be controlled by macrophages^5,6. In response to the local microenvironment, macrophages may differentiate into different phenotypes that play diverse biological functions⁷. Two well differentiated macrophage phenotypes have been established: classically activated macrophages (M1 macrophages) and alternatively activated macrophages (M2)⁸. M1 macrophages promote inflammation, whereas M2 macrophages have an anti-inflammatory role and are involved in tissue repair⁹. Therefore, a better knowledge of macrophage heterogeneity is necessary to understand their regulation and contribution to renal pathology and develop novel therapeutic approaches.

Both, murine and rats models have been widely used to understand the molecular and cellular mechanism involved in renal injury¹⁰. However, there are substantial differences in the diverse markers used to identify macrophages phenotypes between these rodents. Hence, several murine markers, such as F4/80 or Ly6C are not used in rats, thus limiting the extrapolation of findings between these species. Moreover, there is a limited number of markers describing macrophage phenotypes in rats, explaining the scarce studies analyzing macrophage heterogeneity in these animals as compared with mice. Therefore, new strategies for macrophage subset characterization are necessary to understand the role of macrophages in renal disease models in rats.

This manuscript describes a protocol for the phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. This technique can be further followed by several assays, including cell sorting and mRNA or protein expression studies to allow in-depth characterization of the role of macrophages in renal disease.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde von den lokalen Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse nach der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments und der nationalen Richtlinie 53/2013 genehmigt.

1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen

1. Bereiten Sie alle Reagenzien und Lösungen unter sterilen Bedingungen und Verwendung unter einer Laminar-Flow-Haube. Halten Lösungen bei 4 ° C.
2. Bereiten Färbepuffer (2% fötalem Rinderserum (FBS) in 1x Dulbecco-PBS).
3. Bereiten Kollagenase-Lösung durch Zugabe von 0,5 mg Kollagenase zu jedem ml Kochsalzlösung.
4. Bereiten Anästhesie Lösung von Ketamin / Xylazin (2: 1 v / v).

2. Nierenperfusion und Extraktion

1. Anästhesieren Ratten durch intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin (75 mg / 12 mg / kg Gewicht). kneifen Sie vorsichtig eine kleine Hautfalte, um zu überprüfen, dass das Tier ausreichend betäubt. Dann decken die Augen mit vet Salbe Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Hinweis: 4-month-alten Wistar-Ratten werden in diesem Test verwendet.
2. Sobald die Ratte völlig betäubt ist, legen Sie es auf einem OP-Tisch in Rückenlage.
3. Bewerben 70% Ethanol auf den Bauch.
4. Machen Sie einen zentralen Schnitt durch die Bauchhaut und Bauchfell, vom Schambein bis zum Brustkorb, die Pleura und Bauchhöhle zu belichten.
5. Injizieren Kochsalzlösung (0,9%) in die Bauchaorta zu perfundieren Nieren ein Perfusionssystem verwendet, bis das gesamte Blut aus Nieren entfernt wird. Schneiden Sie die Aorta auf der Bauchebene zu helfen, das Blut freigeben.
6. Entfernen Sie beide Nieren von Ratten durch vom Nierenhilus Schneiden (renale Vene, Arterie und Harnleiter). Um die Niere decapsulate, drücken Sie die Kante der Niere Fingern vorsichtig die Kapsel zu trennen ^11.
7. Legen Sie die Niere in Hanks 'ausgeglichener Salzlösung.

3. Nieren Verdauung und Zellsuspension

1. Schneiden Sie die Hälfte einer Niere mit einer Schere in kleine Stücke schneiden und dieStücke in ein 1,5 ml Röhrchen.
   Hinweis: Alle folgenden Konzentrationen für 1 Probe berechnet (1/2 Rattenniere).
2. 1 ml der Kollagenase-Lösung und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. Mischen durch Umdrehen alle 5 Minuten, um sicherzustellen, dass die Kollagenase-Lösung das gesamte Gewebe zugreift.
3. Sammeln Sie die Lösung und gibt sie durch ein Sieb (40 um) mit Hilfe eines Kolbens und Resuspension in 10 ml Färbepuffer.
4. Zentrifuge bei 400 × g für 15 min.
5. Re-suspend das Pellet in 1 ml ACK (Ammonium-Chlorid-Kalium) Lysepuffer. Nach 1 min 30 sec bei Raumtemperatur, gibt 10 ml Färbepuffer die Reaktion zu stoppen.
6. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min.
7. Resuspendieren des Pellets in einem geeigneten Volumen von Färbepuffer (1 ml) und Filtern der Zellsuspension mit einem Sieb (30 um).
8. Zählen Sie die Anzahl der Zellen unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss auf einem Hämozytometer und mit 2 Millionen Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen für staining.

4. Zellfärbung und Durchflusszytometrie-Analyse

1. Zentrifugen Zellen bei 100 xg für 5 min.
2. Resuspendieren des Pellets in 100 & mgr; l Rattenserum (verdünnt 1: 100) für 10 min bei 4 ° C Fc-Rezeptoren zu blockieren.
3. Waschen durch Zugabe von 1 ml Färbepuffer und Zentrifuge 100 xg für 5 min.
4. Mischen Sie die Antikörper für Zelloberflächenfärbung in 100 ul Färbepuffers für jede Bedingung: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) und die Lösung zu lebenden Zellen erkennen (3: 1000).
5. Resuspendieren des Zellpellets in der Antikörpermischung für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln.
6. Waschen durch Zugabe von 1 ml Färbepuffer und Zentrifuge bei 100 × g für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt.
7. Hinzufügen 600 ul Fixation / Permeabilisierung Lösung für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln.
8. Waschen 2-mal mit 1 ml Permeabilisierung / Waschpuffer und Zentrifugieren bei 170 xg für 5 min.
9. Fügen Sie den CD68 FITC-Antikörper (35: 1000) für die intracelzelluläre Färbung zu 100 ul Permeabilisierungs / Waschpuffer für jede Bedingung.
10. Resuspendieren des Pellets in der CD68-Antikörperlösung und inkubiere 50 min bei 4 ° C im Dunkeln.
11. Waschen mit 1 ml Permeabilisierungs / Waschpuffer und Zentrifuge bei 170 xg für 5 min.
12. Re-suspend das Pellet in 100 ul Permeabilisierungs / Waschpuffer, fügen CD86PE Antikörper (35: 1000) und für 20 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln inkubiert.
13. Waschen durch Zugabe von 1 ml Permeabilisierung / Waschpuffer und Zentrifugieren bei 100 xg für 5 min.
14. Re-suspend das Pellet in 100 ul Permeabilisierungs / Waschpuffer und übergeben es an einer Durchflusszytometrie Röhre.
15. Analysieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie. Bestimmen Sie CD45-Färbung in Live-gated-Zellen in der Seitenstreulicht / Vorwärtsstreulicht (SSC / FSC) Fenster. In einem zweiten Schritt analysieren CD86 und CD163 Expression in CD68 ⁺ Zellen.

Ergebnisse

Wir analysierten Makrophagen Heterogenität in einer entzündlichen experimentellen Modell der Nierenschädigung mit einer erhöhten Präsenz von Makrophagen in der Niere zu infiltrieren. In diesem Modell wurde Nierenschäden durch die Gabe von Aldosteron (1 mg ^-1 kg ^-1 Tag) und Salz (NaCl 1%) im Trinkwasser für 3 Wochen bei Wistar - Ratten induziert, wie zuvor ¹² berichtet.

Der Zeitplan unser...

Diskussion

Makrophagen sind heterogene Zellen, die eine wichtige Rolle bei verschiedenen entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Nierenerkrankungen spielen. Es ist bei der Charakterisierung von Makrophagen Subsets in renal disease zunehmendes Interesse , da jeder Subpopulation von Makrophagen zur Entwicklung von Nierenschädigung in einer anderen Weise trägt, wie ^14-16 in Glomerulonephritis, diabetischer Nephropathie und Nierenkrebs berichtet. In den frühen Stadien der akuten Nierenschädigung, eine Dominanz von ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminar flow hood	Faster		Or equivalent equipment
Centrifuge	Hettich		Or equivalent equipment
Flow cytometer (FACSAria)	BD Biosciences
Fetal bovine serum	BioWest	S1820-500
PBS 10x	LONZA	BE17-515Q
Collagenase	Sigma-Aldrich	12/1/9001
ACK Lysing Buffer	Thermo Fisher Scientific	A10492-01
Flow cytometry strainers	BD Biosciences	340626
Falcon cell strainers	Thermo Fisher Scientific	352340
Flow cytometry tubes	Falcon	352052	5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube
Centrifuge tubes	Corning centristar	430791
Water bath	Memmert GmbH + Co. KG	WNE 7	37 °C
Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer	BD Biosciences	554714
Rompum (Xylazine)	Bayer		Or equivalent
Ketalar (Ketamine)	Pfizer		Or equivalent
Hanks’ balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H8264-500ML
Saline solution	Braun	622415
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7	Biolegend	202216	Diluted 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITC	Bio-RAD	MCA341F	Diluted 35:1,000
anti-CD86 (clone: 24F) PE	Biolegend	200307	Diluted 35:1,000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647	Bio-RAD	MCA342R	Diluted 4:100
Live/dead stain	Molecular Probes	L34955	Diluted 3:1,000