Фенотипическая Характеристика макрофаги почек крыс с помощью проточной цитометрии

Резюме

Эта рукопись описывает подробный протокол для фенотипической и количественного анализа резидентных макрофагов из почек крыс с помощью проточной цитометрии. Полученные клетки могут запятнанные быть также использованы для других приложений, в том числе клеток, сортировкой анализа экспрессии генов или функциональных исследований, тем самым увеличивая информацию, полученную в экспериментальной модели.

Аннотация

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

Введение

Renal disease is a global health problem, with increased prevalence, and associated with elevated morbidity and mortality¹. One of the most important mechanisms involved in the progression and development of renal injury is inflammation, mainly triggered by macrophages. Macrophages play a pivotal role in many inflammatory diseases, including renal disorders². Thus, an elevated presence of infiltrating macrophages has been reported in biopsies from patients with acute kidney injury (AKI) or chronic kidney disease (CKD)^3,4. Recent studies suggest that the long-term outcome of renal disease could be controlled by macrophages^5,6. In response to the local microenvironment, macrophages may differentiate into different phenotypes that play diverse biological functions⁷. Two well differentiated macrophage phenotypes have been established: classically activated macrophages (M1 macrophages) and alternatively activated macrophages (M2)⁸. M1 macrophages promote inflammation, whereas M2 macrophages have an anti-inflammatory role and are involved in tissue repair⁹. Therefore, a better knowledge of macrophage heterogeneity is necessary to understand their regulation and contribution to renal pathology and develop novel therapeutic approaches.

Both, murine and rats models have been widely used to understand the molecular and cellular mechanism involved in renal injury¹⁰. However, there are substantial differences in the diverse markers used to identify macrophages phenotypes between these rodents. Hence, several murine markers, such as F4/80 or Ly6C are not used in rats, thus limiting the extrapolation of findings between these species. Moreover, there is a limited number of markers describing macrophage phenotypes in rats, explaining the scarce studies analyzing macrophage heterogeneity in these animals as compared with mice. Therefore, new strategies for macrophage subset characterization are necessary to understand the role of macrophages in renal disease models in rats.

This manuscript describes a protocol for the phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. This technique can be further followed by several assays, including cell sorting and mRNA or protein expression studies to allow in-depth characterization of the role of macrophages in renal disease.

протокол

Этот протокол был одобрен местными институциональными уходу и использованию животных комитетов после Директивы 2010/63 / ЕС Европейского парламента и Национального руководящего принципа 53/2013.

1. Приготовление реагентов и растворов

1. Подготовьте все реагенты и растворы в стерильных условиях и использовать под колпаком с ламинарным потоком. Хранить растворы при 4 ° С.
2. Готовят окрашивающего буфера (2% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в PBS 1X Дульбекко).
3. Подготовка раствора коллагеназы путем добавления 0,5 мг коллагеназы в каждый мл физиологического раствора.
4. Подготовка анестезии раствор кетамина / ксилазина (2: 1 об / об).

2. Почечная перфузия и экстракция

1. Обезболить крыс путем внутрибрюшинной инъекции кетамина / ксилазина (75 мг / 12 мг / кг массы тела). Тщательно зажать небольшой складки кожи, чтобы убедиться, что животное достаточно наркозом. Затем покрывают глаза ветеринара мазь для предотвращения сухости под наркозом. Примечание: 4-MONго-самцам крыс Wistar используются в данном анализе.
2. После того, как крыса полностью под наркозом, поместите его на операционном столе в положении лежа на спине.
3. Применяют 70% этанола в брюшной полости.
4. Сделайте центральный разрез через кожу живота и брюшины, от лобка к грудной клетке, чтобы выставить плевральной и брюшной полости.
5. Вводят физиологический раствор (0,9%) в брюшную аорту заливать почки с помощью перфузионной системы, пока вся кровь не будет удалена из почек. Вырезать аорты на уровне живота, чтобы помочь выпустить кровь.
6. Удалить обе почки от крыс путем разрезания от почечной рубчика (почечной вены, артерии и мочеточника). Для decapsulate почки, прижимать край почки с помощью пальцев, тщательно отделяя капсулы ^11.
7. Поместите почку в сбалансированный солевой раствор Хэнкса.

3. Почки Пищеварение и клеточной суспензии

1. Вырезать половина почки с ножницами на мелкие кусочки и положитьчастей в 1,5 мл пробирку.
   Примечание: Все следующие концентрации рассчитаны для 1 образца (почки 1/2 крысы).
2. Добавляют 1 мл раствора коллагеназы и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Смешайте переворачиванием каждые 5 минут, чтобы убедиться, что раствор коллагеназы получает доступ к всей ткани.
3. Собирают решение и передать его через сито (40 мкм) с помощью плунжера, и вновь суспендируют его в 10 мл окрашивающего буфера.
4. Центрифуга при 400 х г в течение 15 мин.
5. Повторное приостановить осадок в 1 мл ACK (аммоний-хлоридно-калий) Lysing буфера. Через 1 мин 30 с при комнатной температуре, добавляют 10 мл окрашивающего буфера для остановки реакции.
6. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин.
7. Повторно приостанавливать осадок в адекватном объеме окрашивающего буфера (1 мл) и фильтруют суспензию клеток с использованием сетчатого фильтра (30 мкм).
8. Подсчитайте число клеток с использованием трипанового синего на гемоцитометра и добавить 2 миллиона клеток в 1,5 мл пробирку для STAоцен- ками.

4. Сотовый анализ Окрашивание и проточной цитометрии

1. Центрифуга клетки при 100 мкг в течение 5 мин.
2. Повторное приостановить осадок в 100 мкл крысиной сыворотки (разведенным 1: 100) в течение 10 мин при 4 ° C, чтобы блокировать Fc-рецепторы.
3. Промыть путем добавления 1 мл окрашивающего буфера и центрифуге 100 мкг в течение 5 мин.
4. Смешать антител к клеточной поверхности окрашивания в 100 мкл окрашивающего буфера для каждого условия: CD45, АРС-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) и раствор для обнаружения живых клеток (3: 1000).
5. Повторное приостановить осадок клеток в смеси антител в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
6. Промыть путем добавления 1 мл окрашивающего буфера и центрифуге при 100 мкг в течение 5 мин. Повторите этот шаг.
7. Добавьте 600 мкл раствора / пермеабилизирующего Fixation в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
8. Промыть 2 раза с 1 мл пермеабилизирующего / промывочного буфера и центрифугируют при 170 х г в течение 5 мин.
9. Добавить антитела CD68 FITC (35: 1000) для intracellular окрашивание в 100 мкл буфера пермеабилизирующего / промывочного раствора для каждого условия.
10. Повторное приостановить осадок в CD68-антитело раствора и инкубировать 50 мин при 4 ° С в темноте.
11. Промыть 1 мл пермеабилизирующего / промывочного буфера и центрифуге при 170 мкг в течение 5 мин.
12. Повторное приостановить осадок в 100 мкл буфера пермеабилизирующего / Wash, добавьте CD86PE антитела (35: 1000) и инкубировать в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
13. Вымойте добавлением 1 мл пермеабилизирующего / Wash буфера и центрифуге при 100 мкг в течение 5 мин.
14. Повторное приостановить осадок в 100 мкл буфера пермеабилизирующего / Wash и передать его в проточной цитометрии трубки.
15. Анализ проб с помощью проточной цитометрии. Определение CD45 окрашивание в живых клетках закрытого типа в боковой рассеянный свет / вперед рассеянного света (/ FSC SSC) окна. На втором этапе, анализировать CD86 и CD163 выражение в CD68 ⁺ клеток.

Результаты

Мы проанализировали макрофагами гетерогенность в воспалительной экспериментальной модели повреждения почек, связанных с повышенным присутствием инфильтрации макрофагами в почках. В этой модели, повреждение почек индуцировали введением альдостерона (1 мг ^-1 к?...

Обсуждение

Макрофаги являются гетерогенными клетки, которые играют важную роль в различных воспалительных заболеваний, в том числе почечных расстройств. Существует растущий интерес к характеристике макрофаги подмножеств при заболеваниях почек , так как каждый макрофаг субпопуляции способству...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminar flow hood	Faster		Or equivalent equipment
Centrifuge	Hettich		Or equivalent equipment
Flow cytometer (FACSAria)	BD Biosciences
Fetal bovine serum	BioWest	S1820-500
PBS 10x	LONZA	BE17-515Q
Collagenase	Sigma-Aldrich	12/1/9001
ACK Lysing Buffer	Thermo Fisher Scientific	A10492-01
Flow cytometry strainers	BD Biosciences	340626
Falcon cell strainers	Thermo Fisher Scientific	352340
Flow cytometry tubes	Falcon	352052	5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube
Centrifuge tubes	Corning centristar	430791
Water bath	Memmert GmbH + Co. KG	WNE 7	37 °C
Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer	BD Biosciences	554714
Rompum (Xylazine)	Bayer		Or equivalent
Ketalar (Ketamine)	Pfizer		Or equivalent
Hanks’ balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H8264-500ML
Saline solution	Braun	622415
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7	Biolegend	202216	Diluted 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITC	Bio-RAD	MCA341F	Diluted 35:1,000
anti-CD86 (clone: 24F) PE	Biolegend	200307	Diluted 35:1,000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647	Bio-RAD	MCA342R	Diluted 4:100
Live/dead stain	Molecular Probes	L34955	Diluted 3:1,000