Akış Sitometrisi ile Sıçan Böbrek gelen Makrofagların Fenotipik Karakterizasyonu

Özet

Bu yazıda fenotipik ve flow sitometri ile sıçan böbreklerden yerleşik makrofajlar kantitatif analizi için ayrıntılı bir protokol açıklar. Elde edilen lekeli hücreler aynı zamanda, böylece deneysel modelinde elde edilen bilgileri, artan hücre sıralama, gen ekspresyon analizi veya fonksiyonel çalışmalar dahil olmak üzere, başka uygulamalar için de kullanılabilir.

Özet

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

Giriş

Renal disease is a global health problem, with increased prevalence, and associated with elevated morbidity and mortality¹. One of the most important mechanisms involved in the progression and development of renal injury is inflammation, mainly triggered by macrophages. Macrophages play a pivotal role in many inflammatory diseases, including renal disorders². Thus, an elevated presence of infiltrating macrophages has been reported in biopsies from patients with acute kidney injury (AKI) or chronic kidney disease (CKD)^3,4. Recent studies suggest that the long-term outcome of renal disease could be controlled by macrophages^5,6. In response to the local microenvironment, macrophages may differentiate into different phenotypes that play diverse biological functions⁷. Two well differentiated macrophage phenotypes have been established: classically activated macrophages (M1 macrophages) and alternatively activated macrophages (M2)⁸. M1 macrophages promote inflammation, whereas M2 macrophages have an anti-inflammatory role and are involved in tissue repair⁹. Therefore, a better knowledge of macrophage heterogeneity is necessary to understand their regulation and contribution to renal pathology and develop novel therapeutic approaches.

Both, murine and rats models have been widely used to understand the molecular and cellular mechanism involved in renal injury¹⁰. However, there are substantial differences in the diverse markers used to identify macrophages phenotypes between these rodents. Hence, several murine markers, such as F4/80 or Ly6C are not used in rats, thus limiting the extrapolation of findings between these species. Moreover, there is a limited number of markers describing macrophage phenotypes in rats, explaining the scarce studies analyzing macrophage heterogeneity in these animals as compared with mice. Therefore, new strategies for macrophage subset characterization are necessary to understand the role of macrophages in renal disease models in rats.

This manuscript describes a protocol for the phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. This technique can be further followed by several assays, including cell sorting and mRNA or protein expression studies to allow in-depth characterization of the role of macrophages in renal disease.

Protokol

Bu protokol Direktifi Avrupa Parlamentosu 2010/63 / AB ve Ulusal Rehber 53/2013 aşağıdaki yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı.

Reaktifler ve Çözümleri 1. Hazırlık

1. Steril koşullar altında tüm reaktifler ve çözümler hazırlamak ve bir laminar akış başlığı altında kullanınız. 4 ° C'de çözüm tutun.
2. lekeleme tampon maddesi hazırlanması (% 2 fetal sığır serumu 1x Dulbecco PBS (FBS)).
3. tuzlu su, her ml kolajenaz 0.5 mg ekleyerek kolajenaz çözeltisi hazırlayın.
4. ketamin / ksilazin anestezi çözeltisi hazırlayın (2: 1 hac / hac).

2. Böbrek Perfüzyon ve Ekstraksiyon

1. ketamin / ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu (75 mg / 12 mg / kg ağırlık) göre sıçan anestezisi. Dikkatle hayvan yeterince anestezi olup olmadığını kontrol etmek, cildin küçük bir kat tutam. Ardından, anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için veteriner merhemi gözleri kapsamaktadır. Not: 4-moninci Wistar sıçanları bu deneyde kullanılır.
2. Sıçan tamamen uyuşturulduktan sonra, bir yatar pozisyonda bir cerrahi masanın üzerine yerleştirin.
3. karın% 70 etanol uygulayın.
4. Plevra ve karın boşlukları ortaya çıkarmak için, göğüs kafesine pubis, karın derisi ve periton aracılığıyla merkezi bir kesi yapmak.
5. Tüm kan böbrekler kaldırılana kadar bir perfüzyon sistemi kullanılarak böbrek serpmek için abdominal aorta içine tuzlu su çözeltisi (% 0.9) enjekte edilir. kan serbest yardım karın düzeyde aort kesin.
6. Renal hilus (renal ven, arter ve üreter) dan keserek sıçan hem böbrek çıkarın. Böbrek açarlar için dikkatle kapsül ¹¹ ayıran, parmaklarını kullanarak böbrek kenarına basın.
7. Hanks dengeli tuz çözeltisi içine böbrek yerleştirin.

3. Böbrek Sindirim ve Hücre Süspansiyon

1. Küçük parçalar halinde makas ile böbrek yarısı kesilmiş ve koyun1.5 ml tüp içine adettir.
   Not: Aşağıdaki tüm konsantrasyonlar 1 numune (1/2 sıçan böbrek) için hesaplanmıştır.
2. kolajenaz çözeltisi 1 ml ilave edilir ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. kollajenaz çözüm tüm doku kere emin olmak için ters çevirerek her 5 dk karıştırın.
3. çözelti toplamak ve bir piston yardımıyla bir süzgeç (40 um) üzerinden geçmesi ve lekeleme tampon maddesi, 10 ml içinde tekrar süspansiyon.
4. 15 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
5. 1 ml ACK (Amonyum Klorür-Potasyum) Parçalama Tampon pelet yeniden askıya. 1 dakika, oda sıcaklığında 30 saniye sonra, reaksiyonu durdurmak için lekeleme tampon maddesi 10 ml ekleyin.
6. 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
7. Yeniden askıya tamponu (1 mi) boyama yeterli hacimde pelet ve bir süzgeç (30 um) kullanılarak hücre süspansiyonu filtre edin.
8. Bir hemasitometre tripan mavisi dışlama kullanarak hücrelerin sayısını ve sta için 1.5 ml tüp 2 milyon hücre eklemekadencilik.

4. Hücre Boyama ve Sitometrisi Analizi

1. 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüje hücreleri.
2. Fc reseptörleri bloke etmek için 4 ° C'de 10 dakika süre ile: yeniden askıya sıçan serumu, 100 ul pelet (100 1 seyreltilmiş).
3. 5 dakika boyunca boyama tamponu ve santrifüj 100 xg 1 ml ekleyerek yıkayın.
4. canlı hücreler (: 1000 3) tespit etmek için ve çözelti, CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (100 4) her bir durum için lekeleme tampon maddesi 100 ul hücre yüzeyi boyama için antikorlar karıştırın.
5. karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika süre ile, antikor karışımı hücre pelletini yeniden askıya.
6. 5 dakika boyunca 100 x g'de lekeleme tampon maddesi ve santrifüj 1 ml ekleyerek yıkayın. bu adımı yineleyin.
7. karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika için tespit / Permeabilization çözeltisi 600 ul ekle.
8. 5 dakika boyunca 170 x g'de 1 mi Permeabilization / Yıkama tamponu ve santrifüj ile 2 kez yıkanır.
9. intracel için iyi: CD68 FITC antikoru (1.000 35) eklemeHer bir durum için Permeabilization / Yıkama tamponu, 100 ul lular boyama.
10. CD68 antikor çözeltisi pelet yeniden askıya ve karanlıkta 4 ° C'de 50 dakika inkübe edilir.
11. 5 dakika boyunca 170 x g'de 1 mi Permeabilization / Yıkama tamponu ve santrifüj ile yıkanır.
12. , Permeabilization / Yıkama tamponu 100 ul pelet yeniden askıya CD86PE antikoru (35: 1000) ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe edin.
13. 5 dakika boyunca 100 x g'de tampon ve santrifüj Permeabilization / Wash 1 ml ekleyerek yıkayın.
14. Permeabilization / Yıkama tampon 100 ul pelet yeniden askıya ve tüpün sitometri akışı geçmek.
15. flow sitometri ile örnekleri analiz edin. Yan-dağınık ışık / ileri-dağınık ışık (SSC / FSC) penceresi kapılı canlı hücrelerde CD45 boyanma belirleyin. İkinci bir aşamada, CD68 ⁺ hücrelerinde CD86 ve CD163 ifadesini analiz.

Sonuçlar

Biz böbrekteki makrofajlar infiltre artan varlığı ile ilişkili renal hasar inflamatuar deneysel modelinde makrofaj heterojenite analiz. Daha önce belirtildiği gibi ¹² Bu modelde, böbrek hasarı, Wistar sıçanlarının 3 hafta için içme suyu aldosteronun (1 mg ^{-1 kg-1} gün) artı tuz (NaCl,% 1), ilaç olarak verilmesi ile indüklenmiştir.

Deneylerimizde çizelgesi, Şekil 1 &...

Tartışmalar

Makrofajlar, renal bozukluklar da dahil olmak üzere, farklı enflamatuar hastalıkların, önemli bir rol oynamaktadır, heterojen hücrelerdir. Her makrofaj ICSI'nin glomerülonefrit, diyabetik nefropati ve böbrek kanseri ^14-16 belirtildiği gibi, böbrek hasarı gelişmesine farklı bir şekilde katkıda çünkü böbrek hastalığı makrofajlar alt gruplarının karakterizasyonu artan bir ilgi vardır. Akut böbrek hasarı erken evrelerinde, M1 makrofajlar bir üstünlüğü tübüler nekroz ve infla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminar flow hood	Faster		Or equivalent equipment
Centrifuge	Hettich		Or equivalent equipment
Flow cytometer (FACSAria)	BD Biosciences
Fetal bovine serum	BioWest	S1820-500
PBS 10x	LONZA	BE17-515Q
Collagenase	Sigma-Aldrich	12/1/9001
ACK Lysing Buffer	Thermo Fisher Scientific	A10492-01
Flow cytometry strainers	BD Biosciences	340626
Falcon cell strainers	Thermo Fisher Scientific	352340
Flow cytometry tubes	Falcon	352052	5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube
Centrifuge tubes	Corning centristar	430791
Water bath	Memmert GmbH + Co. KG	WNE 7	37 °C
Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer	BD Biosciences	554714
Rompum (Xylazine)	Bayer		Or equivalent
Ketalar (Ketamine)	Pfizer		Or equivalent
Hanks’ balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H8264-500ML
Saline solution	Braun	622415
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7	Biolegend	202216	Diluted 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITC	Bio-RAD	MCA341F	Diluted 35:1,000
anti-CD86 (clone: 24F) PE	Biolegend	200307	Diluted 35:1,000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647	Bio-RAD	MCA342R	Diluted 4:100
Live/dead stain	Molecular Probes	L34955	Diluted 3:1,000