Caracterización fenotípica de los macrófagos a partir de riñón de rata por Citometría de Flujo

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo detallado para fenotípica y análisis cuantitativo de los macrófagos residentes de riñones de rata por citometría de flujo. Las células teñidas resultantes también se pueden utilizar para otras aplicaciones, incluyendo la clasificación de células, el análisis de la expresión génica o estudios funcionales, aumentando así la información obtenida en el modelo experimental.

Resumen

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

Introducción

Renal disease is a global health problem, with increased prevalence, and associated with elevated morbidity and mortality¹. One of the most important mechanisms involved in the progression and development of renal injury is inflammation, mainly triggered by macrophages. Macrophages play a pivotal role in many inflammatory diseases, including renal disorders². Thus, an elevated presence of infiltrating macrophages has been reported in biopsies from patients with acute kidney injury (AKI) or chronic kidney disease (CKD)^3,4. Recent studies suggest that the long-term outcome of renal disease could be controlled by macrophages^5,6. In response to the local microenvironment, macrophages may differentiate into different phenotypes that play diverse biological functions⁷. Two well differentiated macrophage phenotypes have been established: classically activated macrophages (M1 macrophages) and alternatively activated macrophages (M2)⁸. M1 macrophages promote inflammation, whereas M2 macrophages have an anti-inflammatory role and are involved in tissue repair⁹. Therefore, a better knowledge of macrophage heterogeneity is necessary to understand their regulation and contribution to renal pathology and develop novel therapeutic approaches.

Both, murine and rats models have been widely used to understand the molecular and cellular mechanism involved in renal injury¹⁰. However, there are substantial differences in the diverse markers used to identify macrophages phenotypes between these rodents. Hence, several murine markers, such as F4/80 or Ly6C are not used in rats, thus limiting the extrapolation of findings between these species. Moreover, there is a limited number of markers describing macrophage phenotypes in rats, explaining the scarce studies analyzing macrophage heterogeneity in these animals as compared with mice. Therefore, new strategies for macrophage subset characterization are necessary to understand the role of macrophages in renal disease models in rats.

This manuscript describes a protocol for the phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. This technique can be further followed by several assays, including cell sorting and mRNA or protein expression studies to allow in-depth characterization of the role of macrophages in renal disease.

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Protocolo

Este protocolo fue aprobado por las autoridades locales Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comités siguiendo la Directiva 2010/63 / UE del Parlamento Europeo y la Directriz Nacional 53/2013.

1. Preparación de Reactivos y Soluciones

1. Preparar todos los reactivos y soluciones en condiciones estériles y utilizar bajo una campana de flujo laminar. Mantener las soluciones a 4 ° C.
2. Preparar tampón de tinción (2% de suero bovino fetal (FBS) en PBS de Dulbecco 1x).
3. Preparar la solución de colagenasa mediante la adición de 0,5 mg de colagenasa a cada ml de solución salina.
4. Preparar la solución de anestesia de ketamina / xilazina (2: 1 v / v).

2. riñón de perfusión y Extracción

1. Anestesiar las ratas por inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina (75 mg / 12 mg / kg peso). pellizcar con cuidado un pequeño pliegue de la piel, para comprobar si el animal está suficientemente anestesiado. A continuación, cubrir los ojos con ungüento veterinario para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Nota: 4-month-ratas Wistar se utilizan en este ensayo.
2. Una vez que la rata está totalmente anestesiado, colocarlo sobre una mesa de operaciones en posición supina.
3. Aplicar 70% de etanol en el abdomen.
4. Haga una incisión central a través de la piel abdominal y el peritoneo, desde el pubis hasta la caja torácica, para exponer las cavidades pleurales y abdominales.
5. Inyectar solución salina (0,9%) en la aorta abdominal para perfundir los riñones utilizando un sistema de perfusión hasta que se elimina toda la sangre de los riñones. Cortar la aorta a nivel abdominal para ayudar a liberar la sangre.
6. Retire ambos riñones de las ratas mediante la reducción del hilio renal (vena renal, arteria y uréter). Para decapsulate el riñón, presione el borde del riñón usando los dedos, separando con cuidado la cápsula ^11.
7. Coloque el riñón en la solución salina equilibrada de Hanks.

La digestión 3. Riñón y suspensión celular

1. Cortar la mitad de un riñón con tijeras en trozos pequeños y poner elpedazos en un tubo de 1,5 ml.
   Nota: Todas las siguientes concentraciones se calculan para la muestra 1 (1/2 de riñón de rata).
2. Añadir 1 ml de la solución de colagenasa y se incuba a 37 ° C durante 30 min. Mezclar por inversión cada 5 min para asegurarse de que la solución de colagenasa accede a todo el tejido.
3. Recoger la solución y pasarla a través de un colador (40 micras) con la ayuda de un émbolo, y volver a suspender en 10 ml de tampón de tinción.
4. Centrifugar a 400 xg durante 15 min.
5. Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml ACK (amonio-cloruro y potasio) buffer de lisis. Después de 1 minuto 30 segundos a temperatura ambiente, se añaden 10 ml de tampón de tinción para detener la reacción.
6. Centrifugar a 400 xg durante 10 min.
7. Vuelva a suspender el sedimento en un volumen adecuado de tampón (1 ml) y la tinción y filtrar la suspensión celular utilizando un colador (30 micras).
8. Contar el número de células por medio de exclusión de azul de tripano en un hemocitómetro y añadir 2 millones de células a un tubo de 1,5 ml para stanando.

4. Análisis de tinción celular y citometría de flujo

1. centrifugar las células a 100 xg durante 5 min.
2. Vuelva a suspender el precipitado en 100 l de suero de rata (diluido 1: 100) durante 10 min a 4 ° C para bloquear los receptores Fc.
3. Lavar mediante la adición de 1 ml de tampón de tinción y centrifugar 100 xg durante 5 min.
4. Mezclar los anticuerpos para la tinción de la superficie celular en 100 l de tampón de tinción para cada condición: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) y una solución para detectar células vivas (3: 1000).
5. Vuelva a suspender el sedimento celular en la mezcla de anticuerpos durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
6. Lavar mediante la adición de 1 ml de tampón de tinción y se centrifuga a 100 xg durante 5 min. Repita este paso.
7. Añadir 600 l de solución / permeabilización de fijación durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
8. Lavar 2 veces con 1 ml de tampón de permeabilización / lavado y centrifugar a 170 xg durante 5 min.
9. Añadir el anticuerpo CD68 FITC (35: 1000) para la Intracellular tinción de 100 l de tampón de permeabilización / lavado para cada condición.
10. Vuelva a suspender el sedimento en la solución de anticuerpos CD68-e incubar 50 min a 4 ° C en la oscuridad.
11. Lavar con 1 ml de tampón de permeabilización / lavado y centrifugar a 170 xg durante 5 min.
12. Vuelva a suspender el precipitado en 100 l de tampón de permeabilización / lavado, añadir anticuerpos CD86PE (35: 1000) y se incuba durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
13. Lavar mediante la adición de 1 ml de permeabilización / tampón de lavado y centrifugar a 100 g durante 5 min.
14. Vuelva a suspender el precipitado en 100 l de tampón de permeabilización / Lavar y pasarlo a un tubo de citometría de flujo.
15. Analizar las muestras por citometría de flujo. Determinar la tinción de CD45 en células vivas cerrados a la luz la luz dispersada lateral / dispersa hacia adelante (/ FSC, SSC) ventana. En un segundo paso, analizar CD86 y la expresión de CD163 en células CD68 ^+.

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Resultados

Se analizó la heterogeneidad de los macrófagos en un modelo experimental de lesión inflamatoria renal asociada a la mayor presencia de la infiltración de macrófagos en el riñón. En este modelo, el daño renal fue inducida por la administración de la aldosterona (1 mg kg ^{-1 -1} día) más de sal (NaCl 1%) en agua de bebida durante 3 semanas en ratas Wistar, como se informó anteriormente ^12.

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Discusión

Los macrófagos son células heterogéneas que juegan un papel importante en diferentes enfermedades inflamatorias, incluyendo trastornos renales. Hay un creciente interés en la caracterización de los macrófagos subconjuntos en la enfermedad renal, ya que cada subpoblación de macrófagos contribuye de una manera diferente a la evolución de la lesión renal, como se informa en la glomerulonefritis, la nefropatía diabética y cáncer renal ^14-16. En las primeras etapas de la lesión renal aguda, se observ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminar flow hood	Faster		Or equivalent equipment
Centrifuge	Hettich		Or equivalent equipment
Flow cytometer (FACSAria)	BD Biosciences
Fetal bovine serum	BioWest	S1820-500
PBS 10x	LONZA	BE17-515Q
Collagenase	Sigma-Aldrich	12/1/9001
ACK Lysing Buffer	Thermo Fisher Scientific	A10492-01
Flow cytometry strainers	BD Biosciences	340626
Falcon cell strainers	Thermo Fisher Scientific	352340
Flow cytometry tubes	Falcon	352052	5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube
Centrifuge tubes	Corning centristar	430791
Water bath	Memmert GmbH + Co. KG	WNE 7	37 °C
Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer	BD Biosciences	554714
Rompum (Xylazine)	Bayer		Or equivalent
Ketalar (Ketamine)	Pfizer		Or equivalent
Hanks’ balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H8264-500ML
Saline solution	Braun	622415
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7	Biolegend	202216	Diluted 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITC	Bio-RAD	MCA341F	Diluted 35:1,000
anti-CD86 (clone: 24F) PE	Biolegend	200307	Diluted 35:1,000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647	Bio-RAD	MCA342R	Diluted 4:100
Live/dead stain	Molecular Probes	L34955	Diluted 3:1,000