Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصفت وهناك طريقة بسيطة وموثوق بها هنا لتحليل مجموعة من وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية مثل تحبب، خلوى والإنتاج chemokine ضمن مختلف مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية.

Abstract

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

Introduction

كجزء من القاتل الطبيعي نظام المناعة الفطري (NK) الخلايا تساهم في خط الدفاع الأول ضد الخلايا المصابة بالفيروسات أو تحويلها malignantly. نظام المستقبلات المثبطة وتفعيل تمكنهم من التمييز بين الخلايا السليمة وتحويلها دون فتيلة مستضد مسبق على النقيض من الخلايا التائية. على خلية لقاء الهدف الخلايا القاتلة الطبيعية الافراج عن محتوى حبيبات السامة للخلايا الخاصة بهم (على سبيل المثال، بيرفورين، granzymes) إلى المشبك المناعي لقتل هدفهم. وعلاوة على ذلك، الخلايا القاتلة الطبيعية تنتج وتفرز أنواع مختلفة من السيتوكينات (على سبيل المثال، γ interferon-: IFN-γ، عامل نخر الورم α: TNF-α) و chemokines (على سبيل المثال، بلعم التهابات البروتين 1β: MIP-1β) على الخلية المستهدفة تفاعل أو خلوى التحفيز 1.

كافية وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية مثل السمية الخلوية، chemokine وإنتاج السيتوكينات لها تأثير هام على مصير ديس متنوعةيخفف. مرضى سرطان الدم تظهر زيادة معدلات الانتكاس إذا كانوا يظهرون لمحة الخلايا القاتلة الطبيعية خلل في تشخيص تتكون من انخفاض إنتاج الإنترفيرون γ وانخفاض التعبير تفعيل مستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية (2). ويرتبط انتعاش مبكر من أعداد الخلايا القاتلة الطبيعية وظيفة بما في ذلك إنتاج السيتوكينات على التفاعل الخلية المستهدفة مع انخفاض الانتكاس وتحسين معدل البقاء على قيد الحياة في المرضى الذين يتلقون الجذعية خيفي خلية زرع 3. وعلاوة على ذلك، عند بدء علاج مضاد للفيروسات في المرضى المصابين بفيروس التهاب الكبد C القدرة تحبب الخلايا القاتلة الطبيعية الطرفية أقوى في المستجيبين في وقت مبكر مما كانت عليه في غير المستجيبين 4. أعداد الخلايا القاتلة الطبيعية (> 80 / ميكرولتر) في يوم 15 بعد زرع الخلايا الجذعية ذاتي (autoSCT) في المرضى الذين يعانون من سرطان الغدد الليمفاوية أو المايلوما المتعددة والتنبؤية لتحسين تطور الحر والشامل البقاء على قيد الحياة 5. في المرضى الذين يعانون سرطان الجلد التعبير عن خلايا T immunoglobulin- والميوسين المجال، containinز جزيء 3 (TIM-3)، وهو بروتين المناعة التنظيمية على الخلايا القاتلة الطبيعية، يرتبط مرحلة المرض والتشخيص 6.

وقد رصد العلماء ظائف الخلايا القاتلة الطبيعية خلال العقود الماضية. وقد تناول التحليل الأولي للNK الخلية السمسة ضد الخلايا السرطانية دون فتيلة مسبق باستخدام فحص 51 كر الإفراج 7. وفي الآونة الأخيرة، طور العلماء طريقة غير المشعة لتقييم السمية الخلوية للخلايا NK توسيع 8. وكثيرا ما يتم تقييمها من إنتاج السيتوكينات وchemokine باستخدام الفحص المناعي (ELISA) تقنيات انزيم مرتبط 9،10. خلال العقود الماضية واستكملت هذه الأساليب التي تدفق المقايسات مقرها الخلوي. وقد مكنت استخدام مثبطات البروتين النقل (على سبيل المثال، brefeldin ألف ومونينسين) وأساليب خلية permeabilization في تركيبة مع بروتوكولات تلطيخ السطح التقليدي العلماء لدراسة chemokine والإنتاج خلوى في الليمفاوية محددة مختلفةفرعية ocyte (على سبيل المثال، T، B أو الخلايا القاتلة الطبيعية) 11. وعلاوة على ذلك، تم وضع تدفق مختلف المقايسات القائمة على الخلوي لمراقبة تي وNK الخلايا السمية الخلوية. في عام 2004 وصف ألتر آخرون التعبير سطح البروتين المرتبط يحلول CD107a (Lamp1) على الخلايا القاتلة الطبيعية عند لقاء الخلية المستهدفة كعلامة للتحبب من حبيبات السامة للخلايا (12). منذ طائفة واسعة من fluorochromes مختلفة وأجهزة قياس التدفق الخلوي متعدد القنوات تتوفر في أيامنا هذه، أصبح من الممكن رصد في وقت واحد متنوعة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية (السمية الخلوية، خلوى والإنتاج chemokine) في مختلف مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية. هذا يصبح من المهم وخصوصا في الحالات التي يقتصر حجم العينة، على سبيل المثال، في الخزعات أو عينات الدم من المرضى الذين يعانون من نقص الكريات البيض.

لاختبار وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية العالمية، وفحوصات على أساس التدفق الخلوي مختلفة يمكن الجمع بين بكفاءة. Theorell آخرون حفز الخلايا القاتلة الطبيعية من هيئة التعليم العاليالجهات المانحة lthy مع خط الخلايا السرطانية K562 وتحليلها NK تحبب الخلايا، إشارة من الداخل إلى الخارج وchemokine الإنتاج من خلال التدفق الخلوي 13. مؤخرا مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية، وقد تم تحليل الظواهر وظائف في مرضى الأورام خلال autoSCT باستخدام التدفق المقايسات مقرها الخلوي. وقد تبين أن الخلايا القاتلة الطبيعية استطاعت degranulate وإنتاج السيتوكينات / كيموكينات على الاعتراف الخلايا السرطانية في نقطة زمنية في وقت مبكر جدا بعد autoSCT 11.

هنا يتم وصف بروتوكول لتقييم وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية على التفاعل مع الخلايا السرطانية بما في ذلك القدرة تحبب، chemokine وإنتاج السيتوكينات باستخدام تدفق الفحص القائمة على الخلوي الذي يجعل من الممكن لمراقبة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية في مجموعات فرعية مختلفة في وقت واحد.

Protocol

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا لتوصيات لجنة الاخلاق المحلية من جامعة فرانكفورت.

1. التثقيف من خلايا K562

  1. الخلايا ثقافة K562 في وسائل الإعلام R10 (RPMI1640 المتوسطة مع الجلوتامين، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، 10٪ الجنين مصل العجل) في مناطق ذات كثافة من 0.5-1 × 10 6 خلايا لكل مل في قارورة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. خلايا الحصاد K562 24 ساعة قبل بدء تجربة جديدة.
    1. إزالة قارورة الثقافة الخلية التي تحتوي على خلايا K562 من الحاضنة. إعادة تعليق الخلايا K562 في وسائل الاعلام والثقافة من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
    2. نقل وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على الخلايا K562 في أنبوب 15 أو 50 مل و بيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 8 دقائق. تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايا في 5 مل وسائل الاعلام R10 وتخلط جيدا.
    3. نقل 20 ميكرولتر من محلول خلية في بئر من لوحة 96-U-جيدا. إضافة 20 ميكرولتر التريبان الأزرق ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل. ماصة 10 ميكرولتر من الحل في غرفة عد الخلايا وعدد الخلايا.
    4. بيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 8 دقائق. إعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام R10 وضبط تركيز خلية K562 إلى 0.5-1 × 10 6 خلايا لكل مل.
    5. احتضان الخلايا K562 في قارورة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى الاستخدام.

2. عزل الخلايا القاتلة الطبيعية

  1. وفقا لموافقة والمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات المحلية، الحصول على الموافقة المسبقة عن خطية من متبرع سليم أو المريض قبل مجموعة من 6-10 مل من EDTA إما أو الدم المحيطي heparinized.
  2. متجر الكواشف لعزل الخلايا القاتلة الطبيعية عند 4 درجات مئوية حتى بداية التجربة ومن ثم استخدامها في درجة حرارة الغرفة (RT) تحت ظروف معقمة. عزل الخلايا القاتلة الطبيعية من الدم المحيطي باستخدام ميكروبيدات المغناطيسية والمغناطيس محددة لعزل الخلايا وفقا لرانه تعليمات الشركة الصانعة.
    1. إعادة قنينة واحدة من الخلايا القاتلة الطبيعية مجفف بالتجميد العزلة السلبية الأجسام المضادة كوكتيل بواسطة pipetting 7.5 مل من المقدمة عازلة و(المدرجة ضمن NK عدة العزلة الخلية) في قارورة. المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات.
      ملاحظة: تأكد من أن التعليق غير متجانسة قبل كل استعمال.
    2. إعداد الحل كوكتيل النهائي عن طريق خلط كميات مناسبة من بيليه تشكيلها من الخطوة 2.2.1 وB العازلة (المدرجة داخل الخلية عدة العزلة NK). لتحديد هذه الكميات، وتحديد حجم عينة الدم كلها في مل من حيث حجم التجارة = 1.0. استخدام 0.25 حجم بيليه المعاد (من الخطوة 2.2.1) و 0.25 حجم B العازلة لمعالجة حجم 1 من الدم الكامل.
    3. نقل الخليط في أنبوب المناسب الذي يحتوي على عينة دم كاملة. لا ماصة صعودا وهبوطا لتجنب فقدان الدم داخل ماصة. بدلا من ذلك، أغلق أنبوب وتحريكه بعناية صعودا وهبوطا حتى السقوفسيون غير متجانسة. لا الدوامة.
    4. وعلاوة على ذلك تجانس العينة باستخدام محور دوار أنبوب لمدة 5 دقائق على RT.
    5. تحت ظروف معقمة، وإزالة الغطاء ووضع أنبوب في فاصل المغناطيسي لمدة 15 دقيقة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. تأكد من أن التسميات أنبوب تواجه نحو المؤخر من المغناطيس للسماح للرؤية دون عائق من الخط الفاصل. لا تتحرك المغناطيس خلال الفصل، كما سيتم بالانزعاج هذا الإجراء.
    6. نقل بعناية طاف في أنبوب 15 مل جديدة وملء مع وسائل الإعلام كاملة (CM ووسائل الإعلام للدم خلية، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، 5٪ الإنسان الأمصال). بيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 8 دقائق.
      1. اختياري: إذا كان بيليه هو أحمر، اعادة تعليق الخلايا في 1ml من العازلة تحلل كرات الدم الحمراء (على سبيل المثال، 1 مل من الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) الناشر المخزن المؤقت: 155 ملي NH 4 الكلور؛ 0.1 ملي EDTA و 10 ملي KHCO 3 في 1 لتر من الماء المقطر (DW))، واحتضان لمدة 8 دقائق على RT. بدلا من ذلك، استخدم إيهعدة نضوب ythrocyte.
        ملاحظة: نضع في اعتبارنا، أن استخدام العازلة ACK قد يؤثر سلبا على وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية (14).
      2. بسرعة تمييع عازلة ACK بإضافة 1 مل على الأقل من سم إلى وقف تحلل وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 8 دقائق لخلايا بيليه.
    7. إعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل سم والمضي قدما في العد. نقل 20 ميكرولتر من محلول الخلايا القاتلة الطبيعية على طبق من ذهب 96-U-جيدا. إضافة 20 ميكرولتر من الميثيلين الأزرق إلى كل بئر ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل. ماصة 10 ميكرولتر من الحل في غرفة عد الخلايا وعدد الخلايا. بدلا من ذلك، استخدم 30 ميكرولتر من تعليق خلية مخفف لحساب مع عداد الخلايا المتاحة تجاريا.
    8. ضبط الخلايا إلى تركيز لا يقل عن 2 × 10 4 الخلايا القاتلة الطبيعية لكل 100 سم ميكرولتر.
    9. إجراء تلوين الأجسام المضادة سطح معزول السكان الخلايا القاتلة الطبيعية للتحقق من نقاء باستخدام قياس التدفق الخلوي.
      1. العلاقات العامةepare حل مزيج الرئيسي عن طريق خلط كميات من الأجسام المضادة وأشار حسب الجدول 1.
      2. إعادة تعليق الخلايا في 88.5 غسل العازلة ميكرولتر (WB؛ 0.5٪ زلال المصل البقري (BSA)، 0.1٪ نان 3 في برنامج تلفزيوني) وإضافة 11.5 ميكرولتر من الحل مزيج الرئيسي. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
        تحذير: نان 3 غير سامة والمغير. التعامل معها وفقا لذلك إلى المقابلة ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS).
      3. إضافة 1 مل من البنك الدولي وبيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 4 دقائق.
      4. إعادة تعليق الخلايا في عازلة تلطيخ 300 ميكرولتر بالإضافة إلى دابي. الحصول على الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي.
        ملاحظة: المضي قدما مع التجربة فقط إذا كانت الخلية نقاء NK هو لا يقل عن 80٪ من مجموع الخلايا الليمفاوية على قيد الحياة.

3. حصاد خلايا K562 لNK تحفيز الخلية

  1. إزالة قارورة الثقافة الخلية التي تحتوي على خلايا K562 (من الخطوة 1.2) من ال البريد الحاضنة. إعادة تعليق الخلايا K562 في وسائل الاعلام والثقافة من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
  2. نقل وسائل الإعلام ثقافة كله في أنبوب 15 أو 50 مل و بيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 8 دقائق. تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايا في 5 مخزنة المالحة الفوسفات مل (PBS) وتخلط جيدا.
  3. نقل 20 ميكرولتر من محلول خلية في بئر من لوحة 96-U-جيدا. إضافة 20 ميكرولتر الأزرق التريبان ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل. ماصة 10 ميكرولتر من الحل في غرفة عد الخلايا وعدد الخلايا. بدلا من ذلك استخدام 30 ميكرولتر من تعليق خلية مخفف لحساب مع عداد الخلايا المتاحة تجاريا.
  4. بيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 8 دقائق. اعادة تعليق الخلايا في CM بتركيز لا يقل عن 2 × 10 4 K562 خلية لكل 100 ميكرولتر وسائل الإعلام.
    ملاحظة: استخدم نفس K562 وتركيز الخلايا القاتلة الطبيعية من أجل احتضان كل من والمستجيب: الهدف (E: T) نسبة 1: 1 في وقت لاحق.
"> 4. تحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية مع ورم الخلايا K562 الخط والسيتوكينات

  1. المزيج بلطف الخلايا بواسطة pipetting لهم صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل. توزيع 100 ميكرولتر جيدا / الحل الخلايا القاتلة الطبيعية في الآبار المطلوبة من لوحة 96-V جيدا.
    1. استخدام اثنين على الأقل من الآبار لكل الجهات المانحة، واحد مع واحد دون التحفيز (على سبيل المثال، K562 الخلايا السرطانية والسيتوكينات). كلما كان ذلك ممكنا، إجراء تجربة على الأقل في مكررة وإضافة عنصر تحكم إيجابية (على سبيل المثال، phorbol 12 ميريستيت 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) وionomycin، التركيز النهائي: 50 نانومتر سلطة النقد الفلسطينية، 1 ميكرومتر ionomycin لكل بئر). إعداد تدفق تحديث الخلوي التعويضات للتاريخ من التجربة.
      ملاحظة: عاير الأجسام المضادة الاستخدام السابق (انظر المناقشة).
  2. إيقاف ضوء وإضافة إلى CD107a مكافحة الأجسام المضادة (2 ميكرولتر، التركيز النهائي: 1: 100) إلى كل بئر مع الخلايا القاتلة الطبيعية في لوحة 96-V جيدا.
  3. المزيج بلطف الخلايا K562 من قبل pipetting لهم صعودا وهبوطا لفيأقل 5 مرات.
    1. من الآبار التي تحتوي على الخلايا القاتلة الطبيعية / مكافحة CD107a-حل الأجسام المضادة، وتحديد تلك التي خططت لتحفيز الخلايا مع K562. إضافة 100 ميكرولتر / جيد من الحل خلية K562 في هذه الآبار. مزيج بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل.
    2. إضافة انترلوكين 2 (IL-2، تركيز النهائي 100 U / مل)، وانترلوكين 15 (IL-15؛ النهائي تركيز 10 نانوغرام / مل) إلى الآبار التي تحتوي K562 خلايا والخلايا القاتلة الطبيعية / مكافحة CD107a حل الأجسام المضادة.
      1. اختياري: اختبار تأثير إما خلايا K562 أو السيتوكينات وحده على الخلايا القاتلة الطبيعية وزعت على فك الورم الناجم مقابل وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية التي يسببها خلوى.
    3. تحديد الآبار على لوحة 96-V جيدا المخطط الضوابط سلبية دون التحفيز. إضافة 100 ميكرولتر / جيد سم إلى هذه الآبار التي تحتوي فقط على الخلايا القاتلة الطبيعية / مكافحة CD107a حل الأجسام المضادة. مزيج بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل.
      1. اختياري: للتحكم إيجابية، إضافة 100 μ؛ ل CM تحتوي على سلطة النقد الفلسطينية وionomycin (تركيز النهائي: 50 نانومتر سلطة النقد الفلسطينية، 1 ميكرومتر ionomycin لكل بئر) إلى بئر مع الخلايا القاتلة الطبيعية / مكافحة CD107a حل الأجسام المضادة.
  4. احتضان الخلايا لمدة 3 ساعات في الظلام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  5. يعد حل المانع النقل البروتين (على سبيل المثال، brefeldin وو / أو مونينسين) في سم. بعد 1 ساعة من الحضانة، إضافة حل كل بئر من لوحة 96-V جيدا مع ضوء مغلقا (تركيز النهائي: 0.5-1μM brefeldin ألف و2-3 مونينسين ميكرومتر). مزيج بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل. تستمر حضانة لساعة المتبقية 2.

5. السطح وبين الخلايا تلطيخ

  1. بعد فترة الحضانة 3 ساعات، مزيج من الخلايا داخل الآبار من لوحة 96-V جيدا بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل ونقلها إلى التدفق الخلوي الأنابيب. إضافة 1 مل / أنبوب من البنك الدولي. بيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 4 دقائق.
    1. اختياري: قبل الطرد المركزي شطف الآبار مع 100 ميكرولتر / جيد في برنامج تلفزيوني، من أجل تحسين الانتعاش الخلية، من قبل pipetting صعودا وهبوطا لمدة 5 مرات على الأقل قبل نقل خلايا في أنبوب FACS منها.
  2. تجاهل طاف والاستمرار في تلطيخ السطح.
  3. تشمل صبغ الأمينات رد الفعل الفلورسنت التي هي غير نفيذ للعيش الخلايا مع حد أقصى للانبعاثات من 423 نانومتر كما يمكن حلها علامة الخلية الميتة (DCM). أداء تلطيخ قبل (انظر أدناه) أو بالتوازي مع تلطيخ السطح الأضداد تبعا لنوع من DCM المستخدمة.
    1. اعادة تعليق الخلايا في 99 ميكرولتر / أنبوب برنامج تلفزيوني وإضافة 1 ميكرولتر / أنبوب من قابل للتثبيت • قرار مجلس الوزراء (تركيز النهائي: 1: 100). مزيج خلايا جيدا باستخدام دوامة واحتضان لهم لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
    2. يعد حل مزيج الرئيسي عن طريق خلط معا الأجسام المضادة "سطح" المدرجة في الجدول 2 (انظر تلطيخ العمود خطوة باللون الأزرق). استخدام فيdicated مجلدات / أنبوب وضرب لهم مع عدد من التدفق الخلوي أنابيب لتكون ملطخة.
    3. بعد مرور فترة الحضانة اتخاذ التدفق الخلوي أنابيب مع الخلايا وإضافة 1 مل / أنبوب من البنك الدولي. بيليه الخلايا في 400 x ج لمدة 4 دقائق.
    4. تجاهل طاف، اعادة تعليق الخلايا في 84 ميكرولتر / أنبوب من البنك الدولي وإضافة 16 ميكرولتر / أنبوب من الحل مزيج الرئيسي. مزيج خلايا جيدا باستخدام دوامة. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
    5. بعد 20 دقيقة إضافة 1 مل / أنبوب البنك الدولي والخلايا بيليه في 400 x ج لمدة 4 دقائق.
  4. تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر / أنبوب الحل تثبيت البارد (على سبيل المثال، 2٪ (النهائي) لامتصاص العرق أو الفورمالديهايد). مزيج خلايا جيدا باستخدام دوامة. احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
    1. وصمة عار على الخلايا للالسيتوكينات داخل الخلايا / كيموكينات بعد هذه الخطوة أو تخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الضفة الغربية.
      ملاحظة: بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، قد تحدث انتعاشا خلية أقل.
      تحذير: لامتصاص العرق والفورمالديهايد المسرطنة المحتملة. التعامل معها وفقا لذلك كل ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS).
  5. غسل الخلايا في 1 مل / أنبوب WB في 400 x ج لمدة 4 دقائق، والمضي قدما في خطوة permeabilization.
  6. إعداد العازلة permeabilization (PB) (على سبيل المثال، 0.2٪ سابونين، 1٪ حل جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني).
  7. غسل الخلايا مرتين في 1 مل / أنبوب PB في 400 x ج لمدة 4 دقائق. تواصل مع تلطيخ الخلايا.
    تحذير: سابونين يحتمل أن تكون مزعجة. التعامل معها وفقا لذلك إلى المقابلة ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS).
  8. يعد حل مزيج الرئيسي باستخدام أشار "الخلايا" أحجام الأجسام المضادة في الجدول 2 (مظللة باللون الأخضر). مضاعفة هذه الكميات مع عدد من الأنابيب لتكون ملطخة.
    1. إعادة تعليق الخلايا في 90 ميكرولتر / أنبوب PB وتطبيق 10 ميكرولتر / أنبوب من الحل مزيج الرئيسي الأجسام المضادة. تخلط جيدا باستخدام الدوامة واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
  9. غسل الخلايا مرتين في 1 مل / أنبوب PB في 400 x ج لمدة 4 دقائق.
  10. تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر / أنبوب PB. مزيج خلايا جيدا باستخدام دوامة. وضع الخلايا على الجليد في الظلام حتى قياس.

6. التدفق الخلوي التعويض واكتساب

  1. حدد قنوات لfluorochromes مختلفة (انظر الجدول 2) داخل التدفق الخلوي اقتناء البرمجيات في مجلد إعداد المعلمة. بالإضافة إلى ذلك، واختيار قنوات FSC-A و-H فضلا عن SSC-A و-H.
  2. تحميل مصفوفة التعويضات التي تم إنشاؤها للمعلمات المختارة في ملف الاستحواذ.
    1. إنشاء مصفوفة التعويض باستخدام الخلايا القاتلة الطبيعية المعزولة من الخطوة 2.2.8 عن طريق أداء وصمة عار لون واحد لكل تألقي المستخدمة (انظر الجدول 2). استخدام بروتوكول تلطيخ السطح هو موضح في الخطوات 5،1-5،4. تشمل عنصر تحكم غير ملوثين (بدون أي الأجسام المضادة) وكذلك الضوابط نمط إسوي و / أو مضان ناقص الضوابط واحد (FMO).
      ملاحظة: كبديل لتعويض خلية القاعدة، استخدام الخرز والضوابط تعويض مفتش ملزم.
    2. وضع كل أنبوب للعينات وصمة عار واحدة وعينة من دون الأجسام المضادة في ميناء حقن العينة (SIP). انقر على زر "السجل" في برنامج الحصول على التدفق الخلوي والحصول على عدد الخلايا لا يقل عن 5 × 10 3 الخلايا القاتلة الطبيعية لكل عينة.
    3. استخدام التطبيق تعويض حساب البرنامج الحصول على الخلوي لإنشاء مصفوفة التعويض.
  3. إنشاء مؤامرات نقطة لتحديد السكان الخلايا القاتلة الطبيعية.
    1. تحديد الخلايا واحدة باستخدام FSC-A / FSC-H وSSC-A / SSC-H المؤامرات نقطة. انقر على زر "بوابة المضلع". رسم بوابة حول الخلايا، والتي لها نمط التوزيع الخطي في كل المؤامرات نقطة. انقر نقرا مزدوجا على أبواب فتح نقطة مؤامرة جديدة.
    2. اختيار FSC-A / SSC-A مؤامرة نقطة للتعرف على الخلايا اللمفاوية/ NK السكان الخلية (انظر الشكل 1). رسم مضلع بوابة حوله وانقر نقرا مزدوجا على البوابة.
  4. وضع كل أنبوب عينة من NK تحفيز الخلايا فحص في SIP. انقر على زر "سجل" والحصول على عدد الخلايا لا يقل عن 5 × 10 3 الخلايا القاتلة الطبيعية لكل عينة.

7. تحليل والإحصاء

  1. فتح التدفق الخلوي برنامج برامج التحليل. انقر على زر تحميل عينة لفتح العينة الضابطة unstimulated.
  2. إنشاء نظام المحاصرة لمجموعات سكانية فرعية NK مختلفة من الخلايا (انظر الشكل 1).
    1. انقر على زر نقطة مؤامرة لخلق FSC-A / SSC-A المؤامرة. انقر على زر بوابة المستطيل ورسم بوابة المستطيل على كل الأحداث مع FSC-A قيمة> 5 × 10 4 إلى استبعاد الحطام. فتح البوابة عن طريق النقر المزدوج على البوابة.
    2. اختيار مرة أخرى / SSC-A المعلمات FSC-A ضمن مؤامرة نقطة جديدة وانقر على زر بوابة المضلع. دالخام بوابة المضلع حول السكان لمفاوية (انظر الشكل 1). افتح البوابة.
    3. حدد SSC-A المعلمة / SSC-H لمؤامرة نقطة جديدة ورسم بوابة المضلع حول كل الخلايا وحيدة. الخلايا واحد يبرهن على وجود توزيع خطي عبر المعلمات FSC-A / FSC-H وSSC-A / SSC-H (انظر الشكل 1). فتح البوابة عن طريق النقر المزدوج على ذلك.
    4. كرر الخطوة 7.2.3 باستخدام المعلمات FSC-A / FSC-H هذا الوقت.
    5. استخدام CD45 المعلمة وتفريغ قناة (CD3، CD14، CD19، DCM) لاستبعاد الخلايا الميتة. رسم باب مستطيل حول كل CD45 إيجابية وتفريغ الخلايا السلبية القناة. فتح البوابة عن طريق النقر المزدوج على البوابة.
    6. تحديد كامل السكان الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام CD56 وتفريغ المعلمات قناة. إنشاء بوابة مستطيل حول CD56 إيجابية وتفريغ توجيه الخلايا السلبية. فتح البوابة عن طريق النقر المزدوج على ذلك.
    7. رسم باب مستطيل حول كل المجموعات الفرعية الثلاث الخلايا القاتلة الطبيعية ضمن CD56 / CD16 نقطة مؤامرة. بيئة تطوير متكاملةntify مجموعات فرعية مختلفة كما CD56 + CD16 - CD56 + CD16 + ومجموعات فرعية خلية CD56 + CD16 + NK.
  3. تحليل NK وظائف الخليوي لكل المجموعة الثانوية خلية فردية NK.
    1. انقر على واحدة من NK بوابات خلية فرعية ثلاثة لفتحه. إنشاء ثلاث قطع نقطة مختلفة لCD56 / CD107a، CD56 / IFN-γ وCD56 / MIP-1β.
    2. رسم بوابة المستطيل لCD56 الخلايا الإيجابية، التي هي ايجابية فضلا عن CD107a، IFN-γ أو MIP-1β على التوالي (انظر الشكل 1).
    3. كرر الخطوة 7.3.1-7.3.2 لكل فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية المتبقية.
  4. كرر الخطوة 7.2 و 7.3 لجميع العينات حفز. احفظ كل القيم الإحصائية من كل عينة على حدة عن طريق النقر على زر المصدرة للإحصاء ضمن برامج التحليل.
  5. فتح الملفات التي تحتوي على القيم الإحصائية العينات الفردية لتحليل وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية. حدد قيم الخلايا القاتلة الطبيعية الفرديةفرعية (على سبيل المثال، CD56 + CD16 - الخلايا القاتلة الطبيعية) عن طريق نسخها إلى ملف آخر.
    1. طرح نسبة من CD107a الخلايا القاتلة الطبيعية إيجابي، والتي لم يتم التعامل معها حافزا، من نسبة CD107a الخلايا القاتلة الطبيعية الإيجابية التي تم التعامل مع حافز.
      ملاحظة: استخدم نتيجة للتدليل على قدرة تحبب هذا خاصة خلية فرعية NK ردا على التحفيز.
    2. كرر الخطوة 7.5.1 لIFN-γ والخلايا القاتلة الطبيعية الإيجابية MIP-1ß للتدليل على خلوى وchemokine الإنتاج استجابة لحافز.
    3. كرر الخطوة 7.5.1-7.5.2 لكل فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية المتبقية لتقييم قدرة تحبب وإنتاج السيتوكينات / chemokine على التحفيز.

النتائج

ويتضح استراتيجية النابضة لتحليل تحبب، خلوى وchemokine إنتاج كامل السكان الخلايا القاتلة الطبيعية وثلاث مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية المختلفة في الشكل 1.

موضحة نتائج ممثلة م...

Discussion

وصف الأسلوب هو نهج سهل وسريع وموثوق بها لدراسة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية من عينات دم كاملة من المتبرعين الأصحاء أو المرضى. هذا الأسلوب يوفر ميزة كبيرة لتنقية الخلايا القاتلة الطبيعية مباشرة من الدم الكامل، وتجنب الطرد المركزي التدرج الكثافة، وهو إلزامي لكثير ?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the "Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung", Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 + glutamineInvitrogen6187-044
penicilin/streptomycinInvitrogen15140-122
BD Falcon Round Bottom TubeBD352008
fetal calf serumInvitrogen10270-106heat inactivated before use
T-flaskGreiner Bio-One690195
K562 tumor cell lineDSMZ GmbHACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffermade in house/components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml PlastipurFresenius Kabi1088813
Megafuge 40R CentrifugeHeraeus/
EDTA blood collector tubesSarstedt386453S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Life Technologies15575-020
Hematopoietic media (XVIVO)Lonza Group LtdBE04-743Q
human serumDRK Blutspendedienst, Frankfurt/M /healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright lineMarienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd.0640030/ 1110000
trypan blue solution (0,4%)Invitrogen15250-061
3% acetic acid with methylene blueStemcell Technologies 07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated MicroplatesCorning 3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated MicroplatesCorning 351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free)Gibco Invitrogen14190-169
BSASigma AldrichA2153-100G
NaN3Sigma Aldrich08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Merck524400-1MG
ionomycin PromoKinePK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15)PeproTech200-15
Proleukin S (IL-2) Novartis Pharma730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)BD Biosciences554724This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A)BD Biosciences555029
paraformaldehydeAppliChemUN2209
saponinSigma Aldrich47036
flow cytometer: Canto10CBD Biosciences/
FlowJoTreeStar Inc./
Graph PadGraph Pad Inc./
MACSxpress SeparatorMiltenyi Biotec 130-098-308
MACSxpress NK isolation kitMiltenyi Biotec 130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, humanMiltenyi Biotec 130-098-196
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
anti-human CD3 APCBiolegend300412
anti-human CD3 V450BD Biosciences560366
anti-human CD14 PerCPMiltenyi Biotec 130-094-969
anti-human CD14 V450BD Biosciences560349
anti-human CD16 PEBiolegend302008
anti-human CD16 PerCPBiolegend302029
anti-human CD19 PE-Cy7Biolegend302216
anti-human CD19 V450BD Biosciences560353
anti-human CD45 BV510BD Biosciences563204
anti-human CD56 FITCBiolegend345811
anti-human CD107a PEBiolegend328608
anti-human IFN-γ AF-647BD Biosciences557729
anti-human MIP-1β APC-H7BD Biosciences561280
DAPIBiolegend422801
Zombie Violet Fixable Viability KitBiolegend423113fixable dead cell marker

References

  1. Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
  2. Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
  3. Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
  4. Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
  5. Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
  6. Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
  7. Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
  8. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
  9. Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
  10. Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
  11. Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
  12. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  13. Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
  14. Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
  15. Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
  16. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
  17. Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
  18. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  19. Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
  20. Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
  21. Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
  22. Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
  23. Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
  24. Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
  25. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
  26. Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
  27. Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
  28. Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
  29. Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
  30. Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
  31. Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
  32. Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
  33. Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
  34. Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
  35. Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
  36. Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
  37. Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

116 CD107a IFN MIP 1 K562

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved