Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיטה פשוטה ואמינה מתוארת כאן כדי לנתח קבוצה של פונקציות תא NK כגון degranulation, ציטוקינים וייצור chemokine בתוך תת תא NK שונה.

Abstract

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

Introduction

במסגרת ההרג הטבעי מערכת חיסון המולדת (NK) תאים לתרום קו ההגנה הראשון נגד שנדבק בנגיף או רע ומר טרנספורמציה תאים. מערכת של קולטנים מעכב והפעלה מאפשרת להם להבחין בין תאים בריאים טרנספורמציה ללא תחול אנטיגן לפני בניגוד לתאי T. לאחר מפגש תא המטרה תא NK לשחרר את התוכן של הגרגרים שלהם ציטוטוקסיות (למשל, perforin, granzymes) לתוך הסינפסה החיסונית להרוג היעד שלהם. יתר על כן, תאי NK מייצרים ומפרישים סוגים שונים של ציטוקינים (למשל, γ interferon-: IFN-γ; הגידול נמק-α גורם: TNF-α) וכמוקינים (למשל,-1β חלבון דלקתי מקרופאג: MIP-1β) על תא המטרה אינטראקציה או ציטוקינים גירוי 1.

מספיק פונקציות תא NK כגון רעילות, chemokine וייצור ציטוקינים יש השפעה חשובה על גורל דיס מגווןמקל. חולי לוקמיה להראות גדל בשיעור ההתקפים אם הם מפגינים פרופיל תא NK פגום בעת האבחנה המורכב של ייצור IFN-γ מופחת התבטאות מופחתת של הפעלת 2 לקולטנים המצויים בתאי NK. התאוששות מוקדמת של מספרים הסלולריים NK ותפקוד כולל ייצור ציטוקינים על אינטראקצית תא המטרה קשורה להרע מופחת שיעור הישרדות משופר בחולים מקבל השתלת תאי גזע אלוגנאית 3. יתר על כן, על התחלת טיפול אינטרפרון בחולים שנדבקו בנגיף הפטיטיס C קיבולת degranulation של תאים היקפיים NK הוא חזק המגיבים מוקדם מאשר שלא הגיבו לטיפול 4. מספרי תא NK (> 80 / μl) ביום 15 לאחר השתלת מח עצם אוטולוגית (autoSCT) בחולים הסובלים מלימפומה או מיאלומה נפוצה הם המנבאים התקדמות משופרת חופשית הכוללת הישרדות 5. בחולים מלנומה הביטוי של T-cell immunoglobulin- ו mucin-מושלם-containinמולקולת -3 G (TIM-3), חלבון חיסוני רגולציה על תאי NK, עולה בקנה אחד עם שלב מחלה והפרוגנוזה 6.

מדעני פיקוח פונקציות תא NK לאורך העשורים האחרונים. הניתוח הראשוני של cytotoxicity תא NK כנגד תאים סרטניים ללא תחול לפני טופל באמצעות assay 51 Cr-שחרור 7. לאחרונה, מדענים פתחו שיטה שאינה רדיואקטיבי כדי להעריך את הרעילות של תאי NK המורחבים 8. ייצור ציטוקינים ו chemokine נבדק לעתים קרובות באמצעות assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) טכניקות 9,10. במהלך העשורים האחרונים שיטות אלה כבר כהשלמת מבחני זרימה מבוססת cytometry. השימוש מעכבי תחבורת חלבון (לדוגמא, brefeldin ו monensin) ושיטות התא permeabilization בשילוב עם פרוטוקולים מכתימים קונבנציונלי שטח אפשר למדענים לחקור chemokine וייצור ציטוקינים ב הלימפה ספציפית שונהתת ocyte (למשל, T, B או תאי NK) 11. יתר על כן, מבחני cytometry מבוסס זרימה שונה פותחו כדי לפקח T ו- NK cytotoxicity תא. בשנת 2004 אלתר ואח. תאר את ביטוי השטח של החלבון ליזוזום הקשורים CD107a (Lamp1) על תאי NK על מפגש תא המטרה כסמן עבור degranulation של גרגרי ציטוטוקסיות 12. מאז מגוון רחב של fluorochromes השונה cytometers זרימת רב ​​ערוצית זמין בימינו, זה הפך להיות אפשרי לפקח בו זמנית פונקציות תא NK מגוונות (cytotoxicity, ציטוקינים וייצור chemokine) תת תאים שונים NK. זה הופך להיות חשוב במיוחד במצבים בהם גודל המדגם מוגבל, למשל, ב ביופסיות או דגימות דם של חולים הסובלים לויקופניה.

כדי לבדוק פונקציות תא NK העולמיות, מבחני הזרימה השונה מבוסס cytometry ניתן לשלב ביעילות. Theorell et al. תאי NK מגורה מ heaתורמי lthy עם קו התאים הסרטניים K562 ונותח degranulation תא NK, ייצור אות ו chemokine מבפנים החוצה באמצעות זרימת cytometry 13. לאחרונה תת-קבוצות תא NK, פנוטיפים ופונקציות בחולי גידול בזמן autoSCT נותחו באמצעות לזרום מבחני cytometry מבוססים. זה הודגם כי תאי NK הצליחו degranulate ולייצר ציטוקינים / כמוקינים בעת ההכרה תאים סרטניים בנקודות מוקדם מאוד זמן אחרי autoSCT 11.

הנה פרוטוקול מתואר להעריך פונקציות תא NK על אינטראקציה עם תאים סרטניים כוללים קיבולת degranulation, chemokine וייצור ציטוקינים באמצעות זרימה cytometry המבוסס assay זה עושה את זה ניתן לבצע מעקב אחר פונקציות תא NK תת שונים בו זמנית.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות של ועדת האתיקה המקומית מאוניברסיטת פרנקפורט.

1. Culturing של תאי K562

  1. K562 תאים תרבות בתקשורת R10 (RPMI1640 עם המדיום גלוטמין, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 10% נסיוב עגל עוברית) בצפיפות של 0.5-1 x 10 6 תאים לכל מ"ל בבקבוק תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס ו- CO 5% 2.
  2. תאי הקציר K562 24 שעות לפני תחילת ניסוי חדש.
    1. הסר את בקבוק תרבית תאים המכיל את תאי K562 מן החממה. Re- להשעות את תאי K562 בתוך התקשורת והתרבות על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
    2. מעביר את התקשורת והתרבות המכילה את תאי K562 לתוך צינור 15 או 50 מיליליטר ו גלולת התאים ב 400 XG במשך 8 דקות. בטל supernatant מחדש להשעות את התאים 5 מ"ל התקשורת R10 ומערבבים היטב.
    3. העברת 20 μl של פתרון התא לתוך באר של צלחת 96-U-היטב. הוסף 20 μl trypan כחול וומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים לפחות. פיפטה 10 μl של פתרון לתוך תא ספירת תאים לספור את התאים.
    4. גלולת התאים ב 400 XG במשך 8 דקות. Re- להשעות את תאי תקשורת R10 ולהתאים את ריכוז תאי K562 כדי 0.5-1 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.
    5. דגירת תאי K562 בבקבוק תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד שימוש.

בידוד 2. של תאי NK

  1. על פי אישור והנחיות של ועדת האתיקה המקומית, קבלת הסכמה מדעת בכתב של התורם או המטופל בריא לפני גביית 6-10 מ"ל של או EDTA או דם היקפי heparinized.
  2. ריאגנטים חנות עבור בידוד תא NK ב 4 מעלות צלזיוס עד תחילת הניסוי ולאחר מכן להשתמש בהם בטמפרטורת החדר (RT) בתנאים סטריליים. לבודד תאי NK מדם היקפי באמצעות microbeads מגנטי מגנט ספציפי בידוד תא פי tהוא הוראות היצרן.
    1. לשקם בקבוקון אחד של הקוקטייל של נוגדני בידוד שלילי תא NK lyophilized על ידי pipetting 7.5 מיליליטר של החיץ ספק (הכלול בתוך ערכת בידוד תא NK) לתוך הבקבוקון. מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
      הערה: ודא, כי ההשעיה היא הומוגנית לפני כל שימוש.
    2. הכן את הפתרון קוקטייל הסופי על ידי ערבוב כמויות מתאימות של גלולה מחדש משלב 2.2.1 ו חיץ B (כלול בתוך ערכת בידוד תא NK). כדי לקבוע כרכים אלה, להגדיר את עוצמת הקול של כל דגימת דם ב מ"ל כמו נפח = 1.0. השתמש 0.25 כרכים של גלולה מחדש (משלב 2.2.1) ו -0.25 כרכים של חיץ B לעבד 1 נפח של דם מלא.
    3. מעבירים את התערובת לתוך צינור הולם המכיל את כל דגימת דם. אל פיפטה למעלה ולמטה כדי להימנע מאובדן דם בתוך פיפטה. במקום זאת, לסגור את הצינור והעבר אותו בזהירות מעלה ומטה עד suspenשיאון הוא הומוגני. לא מערבולת.
    4. בהמשך homogenize המדגם באמצעות Rotator צינור במשך 5 דקות ב RT.
    5. בתנאים סטריליים, להסיר את הכובע במקום הצינור לתוך המפריד המגנטי במשך 15 דקות כפי מומלץ על ידי היצרן. ודא כי תוויות צינור הפנים כלפי הישבן של המגנט כדי לאפשר שקיפות מופרעת של קו ההפרדה. אל תזיז את המגנט במהלך ההפרדה, משום שהליך רפואי זה לא יוזז.
    6. להעביר בזהירות את supernatant לתוך צינור חדש 15 מ"ל ו להתמלא מדיה מלאה (CM; מדיה תא hematopoietic, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 5% האנושי סרה). גלולת התאים ב 400 XG במשך 8 דקות.
      1. אופציונלי: אם גלולה הוא אדום, מחדש להשעות את התאים 1ml של חיץ תמוגה כדורית אדומה (למשל, 1 מ"ל של אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) lysing חיץ: 155 מ"מ NH 4 Cl; 0.1 מ"מ EDTA; 10 מ"מ KHCO 3 ב 1 מים מזוקקים L (DW)) דגירה במשך 8 דקות ב RT. לחלופין, להשתמש erערכת דלדול ythrocyte.
        הערה: זכור, כי השימוש חיץ ACK כאמור עלול להשפיע לרעה על תפקודי התא NK 14.
      2. במהירות לדלל למאגר ACK על ידי הוספת לפחות 1 מ"ל של CM לעצור את תמוגה צנטריפוגות ב 400 XG במשך 8 דקות עד גלולה התאים.
    7. Re- להשעות את התא גלולה ב 1 ס"מ מ"ל ולהמשיך עם היד נטויה. עבר 20 μl של פתרון תא NK לצלחת 96-U-היטב. הוסף 20 μl של מתילן כחול היטב כל ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים לפחות. פיפטה 10 μl של פתרון לתוך תא ספירת תאים ותאי לספור. לחלופין, להשתמש 30 μl של השעית תא חייה לספירה עם דלפק תא זמין מסחרי.
    8. התאם את תאי ריכוז של לפחות 2 x 10 4 תאי NK לכל 100 μl CM.
    9. בצע מכתים נוגדן השטח של אוכלוסיית התאים המבודדת NK לבדוק את הטוהר באמצעות cytometer זרימה.
      1. יחסי ציבורepare פתרון תערובת אמן על ידי ערבוב הכרכים של נוגדנים הצביעו לפי טבלה 1.
      2. Re- להשעות את התאים 88.5 כביסה חיץ μl (WB; 0.5% בסרום שור אלבומין (BSA), 0.1% NaN 3 ב PBS) ולהוסיף 11.5 μl של פתרון שילוב הורים. דגירת התאים במשך 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
        זהירות: NaN 3 רעילים mutagen. טפל בו בהתאם לגיליון הבטיחות של החומר המתאים (MSDS).
      3. הוסף 1 מ"ל של WB ו גלולה התאים ב 400 XG למשך 4 דקות.
      4. Re- להשעות התאים חיץ מכתים 300 μl בתוספת DAPI. רוכש את התאים באמצעות cytometer זרימה.
        הערה: להמשיך הלאה עם הניסוי רק אם טוהר תא NK הוא לפחות 80% מכלל לימפוציטים בחיים.

קציר 3. של תאי K562 עבור גירוי תא NK

  1. הסר את בקבוק תרבית תאים המכיל את תאי K562 (משלב 1.2) מ ה חממת דואר. Re- להשעות את תאי K562 בתוך התקשורת והתרבות על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
  2. מעבירים את התקשורת והתרבות כולה לתוך צינור 15 או 50 מ"ל ו גלולה התאים ב 400 XG במשך 8 דקות. בטל supernatant מחדש להשעות את התאים מלוחים מ"ל 5 פוספט שנאגרו (PBS) ומערבבים היטב.
  3. העברת 20 μl של פתרון התא לתוך באר של צלחת 96-U-היטב. הוסף 20 μl trypan כחול ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים לפחות. פיפטה 10 μl של פתרון לתוך תא ספירת תאים לספור את התאים. לחלופין להשתמש 30 μl של השעית תא חייה לספור עם דלפק תא זמין מסחרי.
  4. גלולת התאים ב 400 XG במשך 8 דקות. Re להשעות תאים CM בריכוז של לפחות 2 x 10 4 תאים לכל K562 100 מדיה μl.
    הערה: משתמש באותה K562 וריכוז תא NK כדי לדגור הוא לעבר מפעיל: היעד (E: T) יחס של 1: 1 בהמשך.
"> 4. גירוי של תאי NK עם K562 בשורת תאים סרטניים וציטוקינים

  1. לערבב בעדינות את התאים על ידי pipetting אותם מעלה ומטה במשך 5 פעמים לפחות. הפץ 100 μl / טוב של פתרון התא NK לתוך הבארות הנדרשות של צלחת 96-V-היטב.
    1. השתמש לפחות שתי בארות עבור כל תורם, אחד עם ואחד בלי גירוי (למשל, תאים סרטניים K562 וציטוקינים). במידת האפשר, לבצע את הניסוי לפחות בשני עותקים ולהוסיף כביקורת חיובית (למשל, phorbol 12-myristate 13-אצטט (PMA) ו ionomycin; לריכוז סופי: 50 ננומטר PMA, 1 מיקרומטר ionomycin לכל טוב). כן תזרים עודכן cytometry בהליך משפט פיצויים בשל מועד הניסוי.
      הערה: לכיל הנוגדנים שימוש קודם (ראה דיון).
  2. כבו את האור ולהוסיף את נוגדן אנטי CD107a (2 μl, ריכוז סופי: 1: 100) זה טוב עם תאי NK על צלחת 96-V-היטב.
  3. לערבב בעדינות את תאי K562 ידי pipetting אותם מעלה ומטה במשך5 פעמים לפחות.
    1. מן הבארות המכיל את פתרון נוגדן NK תא / אנטי CD107a, לזהות את אלה המתוכננים גירוי עם תאי K562. הוספת 100 μl / טוב של פתרון התא K562 לתוך בארות אלה. מערבבים בזהירות על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים לפחות.
    2. להוסיף אינטרלויקין -2 (IL-2; ריכוז סופי 100 U / ml) ו- interleukin-15 (IL-15; ng 10 לריכוז סופי / מיליליטר) כדי הבארות המכילות K562 תאים ותא NK / אנטי CD107a פתרון הנוגדנים.
      1. אופציונלי: לבדוק את ההשפעה של תאים או K562 או ציטוקינים לבד על תאי NK מופץ לפענח הנגרמת הגידול לעומת פונקציות תא NK-induced ציטוקינים.
    3. זהה את הבארות על הצלחת 96-V-מתוכנן היטב כפי שולט שלילי ללא גירוי. הוספת 100 μl / טוב CM לבארות אלה המכיל רק את תא NK / פתרון נוגדן אנטי CD107a. מערבבים בזהירות על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים לפחות.
      1. אופציונאלי: עבור פקד חיובי, להוסיף 100 μ; CM l המכיל PMA ו ionomycin (הריכוז הסופי: 50 ננומטר PMA, 1 מיקרומטר ionomycin לכל טוב) אל באר עם תא NK / פתרון נוגדן אנטי CD107a.
  4. דגירת התאים עבור 3 שעות בחושך ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  5. כן פתרון מעכב תחבורת חלבון (למשל, brefeldin A ו- / או monensin) ב CM. אחרי שעה 1 של דגירה, להוסיף את הפתרון היטב בכל צלחת 96-V-היטב עם אור כבוי (ריכוז סופי: 0.5-1μM brefeldin A ו- 2-3 monensin מיקרומטר). מערבבים בזהירות על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים לפחות. המשך הדגירה של השעה 2 הנותרים.

Surface 5. תאיים מכתימים

  1. לאחר תקופת דגירה 3 שעות, לערבב את התאים בתוך בארות הצלחת 96-V-טוב בקפידה על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך לפחות 5 פעמים ולהעביר אותם לתוך זרימת cytometry צינורות. הוסף 1 מ"ל / שפופרת של WB. תאים גלולים ב 400 XG למשך 4 דקות.
    1. אופציונאלי: לפני צנטריפוגה ולשטוף את הבארות עם 100 μl / גם PBS, על מנת לייעל את התאוששות התא, על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים לפחות לפני העברת התאים לתוך צינור FACS בהתאמה.
  2. בטל supernatant והמשך עם משטח מכתים.
  3. כלול צבע פלואורסצנטי-reactive אמין כי הוא בלתי permeant לחיות תאים עם מקסימום פליטה של ​​423 ננומטר כסמן תאים מתים fixable (DCM). בצע את המכתים לפני (ראה להלן) או במקביל עם מכתים משטח נוגדן בהתאם לסוג של DCM בשימוש.
    1. Re- להשעות התאים 99 μl / צינור PBS ולהוסיף 1 μl / צינור של (הריכוז הסופי: 1: 100) DCM ניתן לתקן. מערבבים היטב תאים בעזרת מערבולת דגירה אותם במשך 15 דקות ב RT בחושך.
    2. כן פתרון תערובת אמן על ידי ערבוב יחד נוגדני "המשטח" המפורטים בטבלה 2 (ראה מכתים טור צעד מודגש בכחול). השתמש בכרכים / צינור dicated ולהתרבות אותם עם מספר זרימת cytometry צינורות להיצבע.
    3. לאחר דגירה לקחת את זרימת cytometry צינורות עם תאים ולהוסיף 1 מ"ל / שפופרת של WB. גלולת התאים ב 400 XG למשך 4 דקות.
    4. בטל supernatant, מחדש להשעות את התאים 84 μl / שפופרת של WB ולהוסיף 16 μl / שפופרת של הפתרון תערובת מאסטר. מערבבים היטב תאים בעזרת מערבולת. דגירה תאים עבור 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
    5. לאחר 20 דקות להוסיף 1 מ"ל / WB צינור ותאי גלולה ב 400 XG למשך 4 דקות.
  4. בטל supernatant מחדש להשעות את התאים 100 μl / שפופרת של פתרון קיבעון קר (למשל, 2% (סופי) paraformaldehyde או פורמלין). מערבבים היטב תאים בעזרת מערבולת. דגירה תאים עבור 10 דקות ב 4 ° C בחושך.
    1. כתם תאי ציטוקינים תאיים / כמוקינים לאחר שלב זה או לאחסן אותם הלילה ב 4 מעלות צלזיוס WB.
      הערה: לאחר דגירת הלילה, התאוששות תא תחתונה עלולה להתרחש.
      זהירות: Paraformaldehyde פורמלדהיד הוא פוטנציאל לסרטן. לטפל בהם בהתאם לגיליון הבטיחות של החומר בהתאמה (MSDS).
  5. שטפו תאים ב WB 1 מ"ל / צינור ב 400 XG למשך 4 דקות ו להמשיך לשלב permeabilization.
  6. הכן חיץ permeabilization (PB) (למשל, 0.2% saponin, 1% פתרון BSA ב PBS).
  7. שוטפים את התאים פעמיים 1 מ"ל / שפופרת של PB ב 400 XG למשך 4 דקות. המשך עם המכתים התאי.
    זהירות: Saponin הוא פוטנציאל מעצבן. טפל בו בהתאם לגיליון הבטיחות של החומר המתאים (MSDS).
  8. כן פתרון תערובת מאסטר באמצעות כרכי נוגדן "התאיים" המצוינים בטבלת 2 (מסומנים בירוק). כפל כרכים אלה עם מספר הצינורות להיצבע.
    1. Re- להשעות את התאים 90 μl / צינור PB ולהחיל 10 μl / שפופרת של הפתרון תערובת אמן נוגדן. מערבבים היטב בעזרת מערבולת דגירה התאים עבור 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
  9. לשטוף תאים פעמיים ב 1 מ"ל / שפופרת של PB ב 400 XG למשך 4 דקות.
  10. בטל supernatant מחדש להשעות את התאים 400 μl / צינורית PB. מערבבים היטב תאים בעזרת מערבולת. מניחים את התאים על הקרח בחושך עד המדידה.

6. פיצוי Cytometry זרימת רכישה

  1. בחר את הערוצים עבור fluorochromes השונה (ראה טבלה 2) בתוך הזרימה cytometry תוכנת רכישה בתיקיית התקנת פרמטר. בנוסף, לבחור את הערוצים עבור FSC-A ו- -h כמו גם עבור SSC-A ו- -H.
  2. טען מטריקס פיצוי נוצר לפרמטרים שנבחרו לקובץ הרכישה.
    1. צור מטריצת פיצויים באמצעות תאי NK מבודדים משלב 2.2.8 ידי ביצוע כתם צבע אחד עבור כל fluorochrome בשימוש (ראה טבלה 2). השתמש בפרוטוקול מכתים משטח כמתואר צעדים 5.1-5.4. כלול פקד בלא כתם (ללא נוגדנים) וכן בקרות אלוטיפ ו / או קרינה מינוס אחד שולט (FMO).
      הערה: כחלופה לפיצוי מבוסס תאים, השתמש IgG מחייב חרוזים שולטים פיצוי.
    2. מניחים כל צינור עבור דגימות כתם יחיד המדגם ללא נוגדנים ליציאת הזרקת מדגם (SIP). הקש על הכפתור "הקלט" בתוכנת רכישת cytometry הזרימה ולרכוש את מספר נייד של לפחות 5 x 10 3 NK תאים לדגימה.
    3. השתמש ביישום חישוב פיצויים של תוכנת רכישת cytometry ליצור מטריצת פיצויים.
  3. צור מגרשים דוט עבור זיהוי אוכלוסיית תא NK.
    1. לזהות תאים בודדים באמצעות FSC-A / FSC-H ומגרשים נקודה SSC-A / SSC-H. לחץ על הכפתור "שער פוליגון". צייר שער סביב תאים, אשר יש דפוס והפצה ליניארי בחלקות הנקודה שניהם. לחץ פעמים על שעיר לפתוח עלילת נקודה חדשה.
    2. בחר עלילת FSC-A / SSC-נקודה כדי לזהות את הלימפוציטים/ אוכלוסיית תא NK (ראה איור 1). צייר שער מצולע סביבו ללחוץ לחיצה כפולה על השער.
  4. מניחים כל צינור דגימה של assay גירוי תא NK לתוך SIP. הקישו על כפתור "הקלט" ולרכוש את מספר הנייד של לפחות 5 x 10 3 NK תאים לדגימה.

7. ניתוח וסטטיסטיקה

  1. פתח את זרימת cytometry תוכנה לניתוח. לחץ על כפתור הטעינה מדגם לפתוח מדגם השליטה unstimulated.
  2. ליצור מערכת Gating עבור subpopulations תא NK השונה (ראה איור 1).
    1. לחץ על כפתור עלילת הנקודה ליצור FSC-A / SSC-עלילה. לחץ על כפתור השער המלבן ולהסיק שער מלבן מעל כל האירועים עם FSC-ערך> 5 x 10 4 להוציא פסולת. פתח את השער על ידי לחיצה כפולה על השער.
    2. בחר שוב את פרמטרי FSC-A / SSC-A בתוך עלילת הנקודה החדשה ולחץ על כפתור השער מצולע. Dגלם שער פוליגון סביב אוכלוסיית הלימפוציטים (ראה איור 1). פתח את השער.
    3. בחר את פרמטר SSC-A / SSC-H עבור מגרש הנקודה החדש לצייר שער מצולע כל התאים הבודדים סביב. תאים בודדים להפגין חלוקה ליניארית על פני פרמטרים FSC-A / FSC-H ו SSC-A / SSC-H (ראה איור 1). פתח את השער על ידי לחיצה כפולה על זה.
    4. חזור על שלב 7.2.3 באמצעות הפרמטרים FSC-A / FSC-H הפעם.
    5. השתמש CD45 פרמטר דאמפ ערוץ (CD3; CD14; CD19; DCM) להוציא תאים מתים. צייר שער מלבן סביב כל חיובית CD45 ו- dump תאי ערוץ שליליים. פתח את השער על ידי לחיצה כפולה על השער.
    6. זהה את אוכלוסיית התא כולו NK באמצעות CD56 ו- dump פרמטרי ערוץ. צור שער מלבן סביב החיובי CD56 ו- dump לתעל תאים שליליים. פתח את השער על ידי לחיצה כפולה על זה.
    7. צייר שער מלבן סביב כל השלושה תת תא NK בתוך עלילת נקודת CD56 / CD16. אידהntify תת שונים כמו CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + ו- CD56 + CD16 ++ תת תא NK.
  3. לנתח פונקציות תא NK עבור כל תת תא יחיד NK.
    1. לחץ על אחד משערי משנה התא שלוש NK כדי לפתוח אותו. צור שלוש חלקות נקודה שונה עבור CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ ו CD56 / MIP-1β.
    2. צייר שער מלבן עבור תאים חיוביים CD56, שהן חיוביות כמו גם עבור CD107a, IFN-γ או MIP-1β בהתאמה (ראה איור 1).
    3. חזור על שלב 7.3.1-7.3.2 עבור כל תת תא NK הנותרים.
  4. חזור על שלב 7.2 ו -7.3 עבור כל הדגימות המגורות. שמור את כל הערכים הסטטיסטיים של כל דגימה על ידי לחיצה על כפתור מייצאות הנתונה בתוך תוכנת הניתוח.
  5. פתח את הקבצים המכילים את הערכים הסטטיסטיים של הדגימות הבודדות לנתח פונקציות תא NK. בחר את הערכים עבור תא NK פרטתת (למשל, CD16 ++ CD56 - תאי NK) על ידי העתקת אותם בתוך קובץ אחר.
    1. הפחת את אחוז תאי NK החיובית CD107a, אשר לא טופלו עם גירוי, משיעור של תאי NK החיוביים CD107a, אשר טופל עם גירוי.
      הערה: השתמש התוצאה להפגין את יכולת degranulation של מערך ספציפי NK תא זה בתגובה לגירוי.
    2. חזור על שלב 7.5.1 עבור-γ IFN ו- MIP-1SS חיוב תאי NK כדי להדגים את ייצור ציטוקינים ו chemokine בתגובה לגירוי.
    3. חזור על שלב 7.5.1-7.5.2 עבור כל תת תא NK הנותרים להעריך קיבולת degranulation שלהם ייצור ציטוקינים / chemokine על גירוי.

תוצאות

האסטרטגיה gating לניתוח degranulation, ציטוקינים ו chemokine הייצור של האוכלוסייה התא כולו NK ושלושה תת תא NK שונים הם באיור 1.

תוצאות נציג התורם אחד בריא הם באיור 2. תאי NK ללא כל גירוי הפיק ...

Discussion

השיטה המתוארת היא גישה קלה, מהירה ואמינה ללמוד פונקציות תא NK מדגימה דם שלם של תורמים או מטופלים בריאים. שיטה זו מציעה את היתרון הגדול לטהר תאי NK ישירות מדם כולו, הימנעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות זמן רבה, שהיא חובה עבור שיטות טיהור רבות אחרות 15. יתר על כן, זה דורש גוד...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the "Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung", Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 + glutamineInvitrogen6187-044
penicilin/streptomycinInvitrogen15140-122
BD Falcon Round Bottom TubeBD352008
fetal calf serumInvitrogen10270-106heat inactivated before use
T-flaskGreiner Bio-One690195
K562 tumor cell lineDSMZ GmbHACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffermade in house/components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml PlastipurFresenius Kabi1088813
Megafuge 40R CentrifugeHeraeus/
EDTA blood collector tubesSarstedt386453S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Life Technologies15575-020
Hematopoietic media (XVIVO)Lonza Group LtdBE04-743Q
human serumDRK Blutspendedienst, Frankfurt/M /healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright lineMarienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd.0640030/ 1110000
trypan blue solution (0,4%)Invitrogen15250-061
3% acetic acid with methylene blueStemcell Technologies 07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated MicroplatesCorning 3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated MicroplatesCorning 351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free)Gibco Invitrogen14190-169
BSASigma AldrichA2153-100G
NaN3Sigma Aldrich08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Merck524400-1MG
ionomycin PromoKinePK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15)PeproTech200-15
Proleukin S (IL-2) Novartis Pharma730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)BD Biosciences554724This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A)BD Biosciences555029
paraformaldehydeAppliChemUN2209
saponinSigma Aldrich47036
flow cytometer: Canto10CBD Biosciences/
FlowJoTreeStar Inc./
Graph PadGraph Pad Inc./
MACSxpress SeparatorMiltenyi Biotec 130-098-308
MACSxpress NK isolation kitMiltenyi Biotec 130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, humanMiltenyi Biotec 130-098-196
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
anti-human CD3 APCBiolegend300412
anti-human CD3 V450BD Biosciences560366
anti-human CD14 PerCPMiltenyi Biotec 130-094-969
anti-human CD14 V450BD Biosciences560349
anti-human CD16 PEBiolegend302008
anti-human CD16 PerCPBiolegend302029
anti-human CD19 PE-Cy7Biolegend302216
anti-human CD19 V450BD Biosciences560353
anti-human CD45 BV510BD Biosciences563204
anti-human CD56 FITCBiolegend345811
anti-human CD107a PEBiolegend328608
anti-human IFN-γ AF-647BD Biosciences557729
anti-human MIP-1β APC-H7BD Biosciences561280
DAPIBiolegend422801
Zombie Violet Fixable Viability KitBiolegend423113fixable dead cell marker

References

  1. Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
  2. Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
  3. Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
  4. Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
  5. Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
  6. Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
  7. Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
  8. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
  9. Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
  10. Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
  11. Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
  12. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  13. Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
  14. Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
  15. Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
  16. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
  17. Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
  18. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  19. Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
  20. Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
  21. Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
  22. Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
  23. Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
  24. Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
  25. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
  26. Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
  27. Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
  28. Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
  29. Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
  30. Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
  31. Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
  32. Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
  33. Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
  34. Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
  35. Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
  36. Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
  37. Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

116NKCD107acytotoxicityIFNMIP 1K562

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved