Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Basit ve güvenilir bir yöntem, örneğin, farklı NK hücresi alt-gruplar içinde degranülasyonu, sitokin ve kemokin üretimi gibi NK hücresi fonksiyonlarının bir dizi analiz için tarif edilmektedir.

Özet

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

Giriş

doğuştan gelen bağışıklık sistemi doğal katil bir parçası olarak (NK) hücreleri virüs bulaşmış ya da malign hücre transformasyonu karşı ilk savunma hattı katkıda bulunur. inhibe edici ve aktive edici reseptör bir sistem T hücrelerinin aksine önceki antijen astarsız sağlıklı ve dönüştürülmüş hücreler arasında ayrım sağlar. Hedef hücre karşılaşma üzerine NK hücreleri hedeflerini öldürmek için bağışıklık sinaps içine sitotoksik granül (örneğin, perforin, granzymes) içeriğini bırakın. Hedef hücre üzerinde (MIP-1β, örneğin, makrofaj enflamatuar protein 1β) ve kemokinleri:;: Ayrıca, NK hücreleri, farklı sitokin türde (TNF-α, tümör nekroz faktörü-α, IFN-γ, örneğin, interferon-γ) üreten ve salgılayan etkileşimi veya sitokin stimülasyonu 1.

Böyle sitotoksisite, kemokin ve sitokin üretimi yeterli NK hücre fonksiyonları farklı dis kaderi üzerinde önemli bir etkiye sahipkolaylaştırır. Onlar azaltılmış IFN-γ üretimi ve NK hücre reseptörlerini 2 aktive azaltılmış ifade oluşan tanı anındaki bir kusurlu NK hücre profili sergileyen eğer Lösemi hastaları nüks oranları artış göstermektedir. Hedef hücre etkileşimi üzerine sitokin üretimi de dahil olmak üzere, NK hücre sayıları ve fonksiyonu bir erken toparlanma allojenik kök hücre transplantasyonu 3 alan hastalarda azalmış nüks ve sağkalım oranı ile ilişkilidir. Ayrıca, hepatit C virüsü ile enfekte hastalarda interferon tedavisinin başlaması ile periferik NK hücrelerinin degranülasyonu kapasitesi olmayan yanıt 4 daha erken yanıt güçlüdür. NK hücre sayıları (> 80 / ul) lenfoma veya multipl miyelom muzdarip hastalarda otolog kök hücre nakli (autoSCT) gün sonra 15 geliştirilmiş bir ilerlemesinde ve genel sağkalım 5 için öngörü vardır. melanom hastalarında T-hücresi ekspresyonu İmmünoglobulin ve müsin-alan-containing molekül-3 (TİM-3), NK hücreleri üzerinde bağışıklık-düzenleyici protein, bir hastalık aşaması ve prognoz 6 ile bağlantılıdır.

Bilim adamları son yıllarda boyunca NK hücre fonksiyonlarını takip var. Önceden astarsız tümör hücrelerine karşı NK hücre sitotoksisite başlangıç analizi, 51Cr-açığa çıkarma deneyinde 7 ile ele alındı. Daha yakın zamanda, bilim adamları, genişletilmiş NK hücrelerinin 8 sitotoksisitesini değerlendirmek için radyoaktif olmayan bir yöntem geliştirdi. Sitokin ve kemokin üretimi sıklıkla enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) tekniği 9,10 kullanılarak değerlendirilmiştir. Son yıllarda bu yöntemler flow sitometri tabanlı analizleri ile tamamlanmıştır. Geleneksel yüzey boyama protokolleri ile birlikte protein taşıma inhibitörleri (örneğin, Brefeldin A ve monensin) ve hücre permeabilization yöntemlerinin kullanımı, farklı spesifik lenf kemokin ve sitokin üretimini incelemek için bilim adamları sağladıocyte alt-kümeleri (örneğin, T, B ya da NK hücreleri) 11. Ayrıca, farklı akış sitometri bazlı deneyler T ve NK hücre sitotoksisitesini izlemek için geliştirilmiştir. 2004 Alter ve ark., Sitotoksik granüller 12 degranülasyonunun için bir markör olarak hedef hücre karşılaşıldığında NK hücreleri üzerinde lizozom ilişkili protein CD 107a (LAMP1) yüzey ekspresyonunu tarif. Farklı fluorochromes ve çok kanallı akış sitometrelerinde geniş bir yelpazede günümüzde mevcut olduğundan, aynı anda farklı NK hücre alt gruplarında çeşitli NK hücre fonksiyonlarını (sitotoksisite, sitokin ve kemokin üretimi) izlenmesi mümkün hale gelmiştir. Bu biyopsi veya lökopeni mustarip hastaların kan örneklerinde, örneğin Örnek büyüklüğü sınırlı olduğu durumlarda özellikle önemli hale gelir.

Global NK hücresi fonksiyonlarını test etmek için, farklı akış sitometri bazlı deneyler etkin birleştirilebilir. Theorell ve ark. İşitme cihazı uyarılır NK hücrelerilthy tümör hücre çizgisi K562 ile bağışçıların ve 13 flow sitometri aracılığı ile NK hücre degranülasyonu, iç-dış sinyal ve kemokin üretimini analiz. Son zamanlarda NK hücre alt grupları, autoSCT sırasında fenotipleri ve tümör hastalarında fonksiyonları sitometri tabanlı deneyler akış kullanılarak analiz edildi. Bu NK hücreleri degranüle ve autoSCT 11 sonra çok erken zaman noktalarında tümör hücre tanıma üzerine sitokinler / kemokinleri üretmek mümkün olduğu gösterilmiştir.

Burada bir protokol degranülasyonu kapasitesi, kemokin ve sitokin üretimi dahil olmak üzere tümör hücrelerinin mümkün aynı anda farklı alt NK hücre fonksiyonlarını izlemek için yapan bir akış sitometrisi bazlı analiz kullamlarak etkileşimin ardından NK hücre fonksiyonlarını değerlendirmek için tarif edilmektedir.

Protokol

Bu çalışma Frankfurt Üniversitesi yerel etik kurul önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir.

K562 hücrelerinin 1. Kültürleme

  1. R10 ortam Kültür K562 hücreleri, 37 ° C'de ve% 5 CO bir hücre kültürü şişesi içinde, ml başına 0.5-1 x 10 6 hücre yoğunluğunda (glutamin ortamı,% 1 penisilin / streptomisin,% 10 fetal dana serumu ile RPMI-1640) 2.
  2. Hasat K562 Hücreler Yeni deney başlamadan önce 24 saat.
    1. inkübatör K562 hücreleri içeren hücre kültürü şişesi çıkarın. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme kültür ortamı içinde K562 hücreleri yeniden askıya.
    2. 15 ya da 50 ml tüp içine K562 hücreleri içeren kültür ortamı aktarın ve 8 dakika boyunca 400 x g'de pelet hücreleri. Süpernatantı atın ve 5 ml R10 medya hücrelerin yeniden askıya ve iyice karıştırın.
    3. Aktarım, 96 U-bölmeli plaka iyi içine hücre çözeltisinin 20 ul. 20 uL tripan mavi ilave edin veEn az 5 kez yukarı pipetleme ve aşağı iyice karıştırın. Pipet hücre sayım odasına çözeltisi 10 ul ve hücre sayımı.
    4. 8 dakika boyunca 400 x g'de Pelet hücreleri. R10 medya hücreleri yeniden askıya ve ml başına 0.5-1 x 10 6 hücre K562 hücre konsantrasyonunu ayarlamak.
    5. Kullanılana kadar CO2 37 ° C'de bir hücre kültür şişesi içinde K562 hücreleri inkübe ve% 5.

NK Hücrelerinin 2. İzolasyon

  1. Yerel etik kurul onayı ve yönetmeliklerine uygun olarak, EDTA veya heparinli periferik kandan birinin 6-10 ml toplamadan önce sağlıklı donörün ya da hastanın yazılı bilgilendirilmiş onam edinin.
  2. Sakla deney başlangıcına kadar 4 ° C 'de NK hücre izolasyon reaktifler ve steril koşullar altında, oda sıcaklığında (RT) kullanın. Manyetik mikroboncuklar ve t uygun hücre izolasyonu için belirli bir mıknatıs kullanılarak periferik kan NK hücreleri izoleÜreticinin talimatları diye.
    1. şişenin içine (NK hücre izolasyon kiti dahil) sağlanan tampon A 7.5 ml pipetleme liyofilize NK hücre negatif izolasyon antikor kokteyli bir flakon sulandırın. aşağı 3-4 kez yukarı pipetleme ve hafifçe karıştırın.
      NOT: Süspansiyon Her kullanımdan önce homojen olduğundan emin olun.
    2. Adım 2.2.1 ve (NK hücre izolasyon kiti dahil) tampon B'den yeniden pelet uygun hacimleri karıştırılarak nihai kokteyl çözüm hazırlayın. Bu miktarlar belirlemek = hacim olarak ml 1.0 tam kan örneğinin hacmini tanımlamak için kullanılır. tam kan 1 hacim işlemek ve tampon B 0.25 hacimleri (adım 2.2.1 itibaren) sulandırılmış pelet 0.25 hacimleri kullanın.
    3. tam kan örneği içeren uygun bir tüp içine karışımı aktarın. pipet içindeki kan kaybını önlemek için aşağı yukarı pipet ve vermeyin. Bunun yerine, tüp kapatın ve Asma tavanlar kadar dikkatlice yukarı ve aşağı hareket ettirinsion homojendir. vorteks etmeyin.
    4. Bundan başka, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca tüp rotator kullanarak örnek homojenleştirin.
    5. steril koşullar altında, kapağı çıkarın ve üretici tarafından tavsiye edildiği gibi, 15 dakika boyunca manyetik ayırıcıya tüp yerleştirin. tüp etiketleri ayırma hattının rahatsız görünürlüğünü sağlamak için mıknatısın arka dönük olduğundan emin olun. Bu prosedür rahatsız gibi, ayrılması sırasında mıknatısı hareket ettirmeyin.
    6. Dikkatle yeni bir 15 ml tüp içine süpernatant transferi ve tam medya ile dolmaya (CM, hematopoetik hücre ortamı,% 1 penisilin / streptomisin,% 5 insan serumu). 8 dakika boyunca 400 x g'de Pelet hücreleri.
      1. İsteğe bağlı Pellet kırmızı ise, eritrosit lizis tamponu (1 ml hücrelerin yeniden askıya örneğin 1 amonyum klorür-potasyum (ACK) parçalama tamponu mi: 155 mM NH4CI, 0.1 mM EDTA, 10 mM KHCO 3 1 L damıtılmış su (DW)) ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca inkübe edin. Alternatif olarak, bir er kullanınythrocyte tükenme kiti.
        NOT: ACK tampon kullanımı olumsuz NK hücre fonksiyonlarını 14 etkileyebileceğini aklınızda bulundurun.
      2. Hızla pelet hücreleri 8 dakika boyunca 400 x g'de lizis ve santrifüj durdurmak için CM en az 1 ml ekleyerek ACK tampon sulandırmak.
    7. 1 ml CM hücre pelet yeniden askıya ve sayma işlemine devam edin. 96 U-bölmeli plaka NK hücre çözeltisinin 20 ul aktarın. Her bir oyuğa, mavi metilen 20 ul ilave edin ve en az 5 kat için pipetleme aşağı iyice karıştırın. Pipet 10 hücre sayım odasına çözeltisi ul sayısı hücreleri. Seçenek olarak ise, ticari olarak temin edilebilen hücre sayacı ile sayılması için seyreltilmemiş hücre süspansiyonu 30 ul kullanın.
    8. 100 ul santimetre başına en az 2 X 10 4 NK hücrelerinin bir konsantrasyona hücreleri ayarlayın.
    9. debi sitometresinde saflığını kontrol etmek izole edilmiş NK hücre yüzey antikoru boyamasını gerçekleştirin.
      1. PrTablo 1 gereğince belirtilen antikorların hacimleri karıştırılarak bir master miks çözüm epare.
      2. 88.5 ul yıkama tamponunda hücrelerin yeniden askıya (WB% 0.5 sığır serum albümini (BSA),% 0.1 PBS içinde NaN3) ve ana karışım çözeltisi 11.5 ul ekle. karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe hücreleri.
        Dikkat: NaN 3 toksik ve mutajen olduğunu. İlgili Malzeme Güvenlik Bilgi Formunda (MSDS) buna göre idare.
      3. 4 dakika boyunca 400 xg'de hücreleri WB 1 ml ekleyin ve pelet.
      4. 300 ul tampon boyama artı DAPI hücreleri yeniden askıya. bir akış sitometresinin kullanarak hücrelerin elde edin.
        NOT: NK hücre saflık tüm canlı lenfositlerin en az% 80 olması durumunda deney ile daha fazla devam edin.

NK Hücre Stimulation için K562 hücrelerinin 3. Hasat

  1. inci (adım 1.2 dan itibaren) K562 hücreleri içeren hücre kültürü şişesi kaldır e inkübatör. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme kültür ortamı içinde K562 hücreleri yeniden askıya.
  2. 15 ya da 50 ml tüp içine bütün kültür ortamı aktarın ve 8 dakika boyunca 400 x g'de pelet hücreleri. Süpernatant atılır ve 5 ml fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde hücrelerin yeniden askıya ve iyice karıştırın.
  3. Aktarım, 96 U-bölmeli plaka iyi içine hücre çözeltisinin 20 ul. Mavi 20 ul tripan ekleyin ve en az 5 kez yukarı pipetleme ve aşağı iyice karıştırın. Pipet hücre sayım odasına çözeltisi 10 ul ve hücre sayımı. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen hücre sayacı ile saymak seyreltilmemiş hücre süspansiyonu 30 ul kullanın.
  4. 8 dakika boyunca 400 x g'de Pelet hücreleri. 100 ul ortam başına en az 2 X 10 4 K562 hücrelerinin bir konsantrasyonda CM hücrelerin yeniden askıya.
    NOT: Bir efektör iki inkübe için aynı K562 ve NK hücre konsantrasyonları kullanın: Hedef: 1 (E T) oranı: 1, daha sonra.
Tümör Hücre Hattı K562 ve Sitokinlerle NK Hücrelerinin "> 4. Uyarım

  1. Yavaşça en az 5 kez onları pipetleme ve aşağı hücreleri karıştırın. 100 ul / kuyu NK hücre çözeltisi 96 V-plaka gerekli kuyu içine dağıtın.
    1. Bir uyarana (örneğin, K562 tümör hücreleri ve sitokinler) olmadan, her donör için birlikte diğeri en az iki kuyu kullanın. Mümkün olduğunda, en azından iki kez, deney sonuçlarını ve pozitif kontrol (ör forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ve iyonomisin; nihai konsantrasyon: 50 nM PMA, oyuk başına iyonomisin 1 uM) ilave edilir. Deney için tarih tazminatları sitometri güncellenen akış hazırlayın.
      NOT: antikorların önce kullanım (tartışma) titre edilir.
  2. ışık kapatın ve anti-CD 107a antikoru (2 ul, nihai konsantrasyon 100: 1) ekleyin, 96-V-oyuklu bir plaka üzerinde NK hücreleri, her bir kuyucuğa.
  3. Yavaşça onları pipetleme ve en aşağı K562 hücreleri mixen az 5 kez.
    1. NK hücre / anti-CD 107a antikor çözüm içeren kuyulardan, K562 hücreleri ile uyarılması için planlanan olanları tespit. 100 ul / böyle kuyulara K562 hücre çözeltisinin Well ekleyin. En az 5 kez yukarı pipetleme ve aşağı dikkatlice karıştırın.
    2. Ekle interlökin-2 (IL-2, nihai konsantrasyon 100 U / ml) ve interlökin-15 (IL-15; nihai konsantrasyon 10 ng / ml) K562 hücreleri ve NK hücre / anti-CD 107a antikor çözeltisi ihtiva eden oyuklara.
      1. İsteğe bağlı Tümör kaynaklı sitokin kaynaklı NK hücresi fonksiyonlarının karşılık deşifre dağıtıldı NK hücreleri tek başına K562 hücreleri veya sitokinler ya etkisini test edin.
    3. 96-V-oyuklu bir plaka üzerinde kuyu tespit uyarıcı olmayan negatif kontrol olarak planlanmış. Sadece NK hücre / anti-CD 107a antikor çözeltisi ihtiva eden bu oyuklara 100 ul / oyuk CM ekleyin. En az 5 kez yukarı pipetleme ve aşağı dikkatlice karıştırın.
      1. İsteğe bağlı: bir pozitif kontrol, 100 u ekleme, PMA ve iyonomisin ihtiva eden L CM (nihai konsantrasyon: 50 nM PMA, oyuk başına iyonomisin 1 uM) NK hücre / anti-CD 107a antikor çözeltisi ile bir kuyuya.
  4. 37 ° C'de karanlıkta 3 saat ve% 5 CO2 inkübe hücreleri.
  5. Bir protein taşıma inhibitörü çözeltisi hazırlayın (örn A ve / veya monensin Brefeldin) CM. inkübasyondan 1 saat sonra, ışık ile 96 V-oyuklu plakanın her oyuğuna çözeltisini ekleyin kapatılır (nihai konsantrasyon: 0.5-1μM Brefeldin A ve 2-3 uM monensin). En az 5 kez yukarı pipetleme ve aşağı dikkatlice karıştırın. Geri kalan 2 saat inkübasyona devam edin.

5. Yüzey ve Hücre içi Boyama

  1. 3 saatlik bir bekletme süresinden sonra, en az 5 kat için pipetleme aşağı dikkatle 96 V-kuyulu plakanın kuyularına olan hücrelerin karışımı ve borular akış sitometrisi içine aktarın. 1 ml / DB tüp ekleyin. 4 dakika boyunca 400 xg'de Pelet hücreleri.
    1. İsteğe bağlı: santrifüj ilgili FACS tüpü içine hücreleri aktarmadan önce en az 5 kat için pipetleme aşağı hücre geri kazanımını optimize etmek için, 100 ul / göz PBS ile yıkayın önce.
  2. Süpernatantı atın ve Yüzey Boyama ile devam edin.
  3. Bir tamir edilebilir ölü hücre işaretleyici (DCM) gibi 423 nm'lik bir emisyon maksimum hücreleri canlı olmayan geçirgen olan bir amin-reaktif floresan boya içerir. önce (aşağıya bakınız) veya antikor yüzeyi boyama kullanılabilir, DCM tipine bağlı olarak paralel olarak boyama gerçekleştirin.
    1. 99 ul / tüp PBS hücrelerin askıya Re 1 ul / tamir edilebilir DCM (nihai konsantrasyon: 1: 100) tüp ekleyin. de bir girdap kullanarak hücreleri karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe.
    2. (Adım sütun boyama bkz mavi vurgulanmış) Tablo 2'de listelenen "yüzey" antikorlar karıştırılarak bir master miks çözeltisi hazırlayın. in kullanhacimleri / tüp dicated ve tüpler lekeli edilecek akış sitometri sayısı ile çarpın.
    3. İnkübasyondan sonra hücreler tüpler akış sitometrisi almak ve 1 ml / WB tüpünü ekleyin. 4 dakika boyunca 400 x g'de Pelet hücreleri.
    4. WB 84 ul / tüp içinde hücrelerin yeniden askıya ve 16 ul / master miks çözümün tüp ekleyin süpernatant atın. iyi bir girdap kullanarak hücrelerin karıştırın. karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe hücreleri.
    5. 20 dakika sonra 4 dakika boyunca 400 x g'de 1 ml / tüp WB ve pelet hücreleri ekleyin.
  4. Süpernatantı atın ve 100 ul / soğuk sabitleme solüsyonu (örneğin,% 2 (son) paraformaldehid veya formaldehit) bir tüp içinde hücrelerin yeniden askıya. iyi bir girdap kullanarak hücrelerin karıştırın. karanlıkta 4 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe hücreleri.
    1. Bu adımdan sonra, hücre içi sitokin / kemokin için hücrelerin lekelenmesi ya da UVB 4 ° C'de bir gece boyunca muhafaza edin.
      NOT: Gece boyunca inkübasyondan sonra, daha düşük bir hücre elde oluşabilir.
      Dikkat: Paraformaldehyde ve formaldehit potansiyel kanserojen bulunmaktadır. İlgili Malzeme Güvenlik Bilgi Formunda (MSDS) buna göre onları idare.
  5. 4 dakika boyunca 400 x g'de 1 ml / tüp WB hücreleri yıkayın ve Permeabilization adımla devam edin.
  6. Permeabilizasyon tamponu (PB) (PBS içinde, örneğin,% 0.2 saponin,% 1 BSA çözeltisi) hazırlayın.
  7. 4 dakika boyunca 400 x g'de PB 1 ml / tüp içinde hücreler iki kez yıkayın. hücre içi boyama ile devam edin.
    Dikkat: Saponin potansiyel rahatsız edici. İlgili Malzeme Güvenlik Bilgi Formunda (MSDS) buna göre idare.
  8. (Yeşil vurgulanır) Tablo 2'de belirtilen "hücre içi" antikor birimleri kullanarak bir master miks çözeltisi hazırlayın. tüplerin sayısı ile bu miktarlar çarpın lekeli edilecek.
    1. 90 ul / tüp PB hücreleri yeniden askıya ve 10 ul / antikor master miks çözümünün tüpünü uygulanır. bir girdap kullanarak iyice karıştırın ve 3 hücreleri inkübeKaranlıkta 4 ° C'de 0 dak.
  9. 4 dakika boyunca 400 xg'de PB 1 ml / tüp içinde iki kez Hücreler yıkayın.
  10. Süpernatantı atın ve 400 ul / tüp PB hücreleri yeniden askıya. iyi bir girdap kullanarak hücrelerin karıştırın. Ölçme kadar karanlıkta buz üzerinde hücrelerin yerleştirin.

6. Akım Sitometri Tazminat ve Toplama

  1. Farklı fluorochromes için kanalı seçin parametre kurulum klasöründe toplama yazılımı flow sitometri içinde (bakınız Tablo 2). Buna ek olarak, FSC A kanal seçim ve SSC-A ve -H olarak -H.
  2. satın alma dosyasına seçilen parametreler için oluşturulan bir tazminat matris yükleyin.
    1. Her kullanılan florokrom için tek renkli bir leke gerçekleştirerek aşama 2.2.8 gelen izole edilmiş NK hücreleri kullanılarak bir dengeleme matris oluşturmak (bakınız Tablo 2). adımlarda 5,1-5,4 açıklanan yüzey boyama protokolü kullanın. Herhangi bir antikor olmadan lekesiz kontrolü (Dahil) Ve izotip kontrolleri ve / veya floresan eksi kontrol (FMO).
      Not: Hücre bazlı telafisi için bir alternatif olarak, dengeleme kontrol olarak boncuklar IgG bağlama kullanın.
    2. Tek leke örnekleri için her tüpü ve numune enjeksiyon portu (SIP) içine antikorlar olmadan örnek yerleştirin. Akış sitometri edinme yazılımı "kayıt" butonuna tıklayın ve örnek başına en az 5 x 10 3 NK hücreleri bir hücre sayısını kazanır.
    3. bir tazminat matris oluşturmak için sitometri toplama yazılımı tazminat hesaplama uygulamasını kullanın.
  3. NK Hücre Nüfus belirlenmesi için Nokta Arsalar oluşturun.
    1. FSC-A / FSC-H ve SSC-A / SSC-H nokta araziler kullanılarak tek hücre tanımlayın. "Çokgen kapısı" butonuna tıklayın. Her iki nokta araziler doğrusal dağıtım desen var hücreler, etrafında bir kapı çizin. Yeni bir nokta arsa açmak için kapıları çift tıklayın.
    2. lenfosit tanımlamak için bir FSC-A / SSC-A nokta arsa seçin/ NK hücre popülasyonu (Şekil 1). etrafında bir poligon kapısı çizin ve kapısı üzerinde çift tıklayın.
  4. SIP içine NK hücre uyarımı testinin her örnek tüp yerleştirin. "Kayıt" butonuna tıklayın ve örnek başına en az 5 x 10 3 NK hücreleri bir hücre sayısını kazanır.

7. Analiz ve İstatistik

  1. Analiz yazılım programı flow sitometri açın. uyarılmamış kontrol örneği açmak için yükleme örnek butonuna tıklayın.
  2. Farklı NK hücre alt (Şekil 1) için Yolluk Sistemi oluşturun.
    1. Bir FSC-A / SSC-A arsa oluşturmak için nokta arsa butonuna tıklayın. Dikdörtgen kapı düğmesine tıklayın ve> 5 x 10 4 enkaz dışlamak için bir FSC-A değerine sahip tüm olayları üzerinde bir dikdörtgen kapısı çizin. Kapının üzerinde çift tıklayarak kapıyı açın.
    2. Yine yeni nokta arsa içinde FSC-A / SSC-A parametrelerini seçin ve poligon kapı düğmesine tıklayın. DLenfosit popülasyonunun etrafında bir poligon kapısı ham (Şekil 1). Kapıyı aç.
    3. Yeni nokta arsa için SSC-A / SSC-H parametresini seçin ve çevresindeki tüm tek hücreleri bir poligon kapısı çizin. Tek hücreler FSC A / FSC H'dir ve SSC-A / SSC-H parametreleri arasında doğrusal dağılımını göstermektedir (bakınız Şekil 1). Bunun üzerine çift tıklayarak kapıyı açın.
    4. FSC-A / FSC-H parametreleri bu kez kullanarak adımı yineleyin 7.2.3.
    5. parametre CD45 kullanın ve kanal Damper (CD3, CD14, CD19, DCM) ölü hücreleri hariç. Tüm CD45 pozitif etrafında bir dikdörtgen kapı çizin ve kanal negatif hücreleri döker. Kapının üzerinde çift tıklayarak kapıyı açın.
    6. CD56 ile bütün NK hücre popülasyonu tespit ve kanal parametrelerini döker. CD56 pozitif etrafında bir dikdörtgen kapı oluşturun ve negatif hücreleri kanal döker. Bunun üzerine çift tıklayarak kapıyı açın.
    7. etrafında bir CD56 / CD16 nokta arsa içinde üç NK hücre alt grupları bir dikdörtgen kapı çizin. ide, CD56 ++ CD16 + ve CD56 + CD16 ++ NK hücre alt - CD56 ++ CD16 gibi farklı alt kümelerini ntify.
  3. Her Bireysel NK Hücre Altkümedeki için NK Hücre Fonksiyonları analiz edin.
    1. açmak için üç NK hücresi alt kümesi kapılarından biri üzerine tıklayın. CD56 / CD 107a, CD56 / IFN-y ve CD56 / MIP-1 p için üç farklı nokta araziler oluşturun.
    2. Sırasıyla, CD 107a, IFN-y ya da MIP-1 p için de pozitif CD56 pozitif hücreler, bir dikdörtgen kapı çizin (bakınız Şekil 1).
    3. kalan her NK hücre alt kümesi için yineleyin 7.3.1-7.3.2.
  4. Adımı tekrarlayın 7.2 ve tüm uyarılmış numuneler için 7.3. analiz yazılımları içinde istatistik ihraç düğmesine tıklayarak her numunenin tüm istatistiksel değerleri kaydedin.
  5. NK hücre fonksiyonlarını analiz etmek için bireysel örneklerin istatistiksel değerlerini içeren dosyaları açmak. Bireysel NK hücre için değerleri seçinalt grupları (örneğin, CD56 ++ CD16 - NK hücreleri) başka bir dosyaya kopyalayarak.
    1. uyarıcı ile muamele edilmiştir CD 107a pozitif NK hücreleri yüzdesi arasında, bir uyarıcı ile muamele edilmemiş CD 107a pozitif NK hücreleri, yüzdesini çıkarın.
      Not: uyarana yanıt olarak bu, özellikle NK hücresi alt kümesi degranülasyon kapasitesini göstermek için sonuç kullanın.
    2. IFN-y ve MIP-1p-pozitif NK hücreleri için yineleyin 7.5.1 uyarıcıya tepki olarak sitokin ve kemokin üretimini göstermek için.
    3. kalan her NK hücre alt kümesi için yineleyin 7.5.1-7.5.2 stimülasyon üzerine kendi degranülasyonu kapasitesi ve sitokin / kemokin üretimini değerlendirmek.

Sonuçlar

Bütün NK hücre ve üç farklı NK hücresi alt kümelerinin degranülasyonu, sitokin ve kemokin üretimini analiz etmek için Ayırıcı stratejisi, Şekil 1 'de gösterilmiştir.

Bir sağlıklı donörün Örnek sonuçlar Şekil 2'de gösterilmektedir. Bir uyarıcı olmadan NK hücreleri de IFN-y veya MIP-1 p üretilen ve yüzeyi üzerinde CD 107a (Şekil 2A)...

Tartışmalar

tarif edilen yöntem sağlıklı vericilerden veya hastanın tam kan örnekleri NK hücre fonksiyonlarını incelemek için kolay, hızlı ve güvenilir bir yaklaşımdır. Bu yöntem, kaçınarak doğrudan tam kan NK hücrelerinin saflaştırılması için büyük bir avantaj sunmaktadır zaman alıcı bir çok saflaştırma yöntemleri 15 için zorunlu olan yoğunluk gradyan santrifüjleme. Ayrıca, pediatrik ve / veya bağışıklık eksikliği olan hastalarda örnekler için uygun bir alternatif yapar &qu...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the "Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung", Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 + glutamineInvitrogen6187-044
penicilin/streptomycinInvitrogen15140-122
BD Falcon Round Bottom TubeBD352008
fetal calf serumInvitrogen10270-106heat inactivated before use
T-flaskGreiner Bio-One690195
K562 tumor cell lineDSMZ GmbHACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffermade in house/components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml PlastipurFresenius Kabi1088813
Megafuge 40R CentrifugeHeraeus/
EDTA blood collector tubesSarstedt386453S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Life Technologies15575-020
Hematopoietic media (XVIVO)Lonza Group LtdBE04-743Q
human serumDRK Blutspendedienst, Frankfurt/M /healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright lineMarienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd.0640030/ 1110000
trypan blue solution (0,4%)Invitrogen15250-061
3% acetic acid with methylene blueStemcell Technologies 07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated MicroplatesCorning 3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated MicroplatesCorning 351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free)Gibco Invitrogen14190-169
BSASigma AldrichA2153-100G
NaN3Sigma Aldrich08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Merck524400-1MG
ionomycin PromoKinePK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15)PeproTech200-15
Proleukin S (IL-2) Novartis Pharma730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)BD Biosciences554724This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A)BD Biosciences555029
paraformaldehydeAppliChemUN2209
saponinSigma Aldrich47036
flow cytometer: Canto10CBD Biosciences/
FlowJoTreeStar Inc./
Graph PadGraph Pad Inc./
MACSxpress SeparatorMiltenyi Biotec 130-098-308
MACSxpress NK isolation kitMiltenyi Biotec 130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, humanMiltenyi Biotec 130-098-196
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
anti-human CD3 APCBiolegend300412
anti-human CD3 V450BD Biosciences560366
anti-human CD14 PerCPMiltenyi Biotec 130-094-969
anti-human CD14 V450BD Biosciences560349
anti-human CD16 PEBiolegend302008
anti-human CD16 PerCPBiolegend302029
anti-human CD19 PE-Cy7Biolegend302216
anti-human CD19 V450BD Biosciences560353
anti-human CD45 BV510BD Biosciences563204
anti-human CD56 FITCBiolegend345811
anti-human CD107a PEBiolegend328608
anti-human IFN-γ AF-647BD Biosciences557729
anti-human MIP-1β APC-H7BD Biosciences561280
DAPIBiolegend422801
Zombie Violet Fixable Viability KitBiolegend423113fixable dead cell marker

Referanslar

  1. Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
  2. Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
  3. Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
  4. Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
  5. Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
  6. Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
  7. Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
  8. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
  9. Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
  10. Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
  11. Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
  12. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  13. Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
  14. Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
  15. Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
  16. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
  17. Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
  18. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  19. Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
  20. Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
  21. Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
  22. Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
  23. Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
  24. Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
  25. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
  26. Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
  27. Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
  28. Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
  29. Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
  30. Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
  31. Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
  32. Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
  33. Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
  34. Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
  35. Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
  36. Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
  37. Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

ImmunologySay 116NK h creleriCD 107asitotoksisitefonksiyonIFNMlP 1K562 h creleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır